一、鼻咽癌、胃癌中抑癌基因ING1的突变检测（论文文献综述）
蔡曌[1]（2021）在《1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义》文中认为这一博士学位课题由相对独立的两部分研究工作构成。第一章DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究膀胱癌的高复发率为患者带来了长期的身体和经济负担。目前对于膀胱癌的诊断已有多种基于不同技术平台的生物标志物,然而,对于患者复发风险的评估和预测还较少有相关标志物的报道。尽管在膀胱癌肿瘤的发生发展过程中存在大量基因组序列的改变,但目前对于膀胱癌肿瘤预后风险评估还尚未有获得广泛认可的生物标志物可供临床使用。本项研究旨在膀胱癌组织和尿液中探索与膀胱癌患者预后相关的分子标志物,评估其在患者预后评估中的临床应用价值。本实验室前期工作中对65例膀胱癌肿瘤组织DNA进行了基于芯片的比较基因组杂交实验,发现并通过real-time PCR验证了在膀胱癌组织中高频出现的5个高频拷贝数变异的基因CEP63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3。本项研究对候选的5个拷贝数高频变异的基因在219例于中国医学科学院肿瘤医院初治的膀胱癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本和123例初治膀胱癌患者术前尿沉渣脱落细胞样本中的拷贝数变异与患者临床特征的相关性进行了进一步分析。为分析候选拷贝数变异与患者预后的相关性,研究中对所有入组患者均开展了术后随访,获得其无瘤生存期。研究应用Kaplan-Meier生存曲线、Cox风险比例回归、Logestic线性回归分析候选拷贝数变异与患者肿瘤复发风险的关系,并分别对非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌构建了预后预测模型。为提高在尿液中检测拷贝数变异的准确性,研究中采用了高灵敏的3D数字PCR技术,并运用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC 曲线）比较了 real-time PCR 与 3D 数字PCR在尿沉渣脱落细胞中对拷贝数变异基因的检测效能,建立了尿样本中膀胱癌的诊断模型。在5个候选拷贝数变异的基因中,CEP63（p<0.01）、FOSL2（p<0.01）、PAQR6（p<0.01）在219例肿瘤组织中相比于健康人外周血白细胞中的基因拷贝数显着增加。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p<0.01）的拷贝数在肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织中显着高于非肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p=0.047）的拷贝数在高级别肿瘤中显着高于低级别肿瘤。在发生淋巴结转移患者的肿瘤组织中CEP63的拷贝数显着增加（p<0.01）。研究中对所有病例进行了随访,随访时间为3个月至188个月,中位随访时间为61个月。所有入组患者的5年无瘤生存率为48.3%;10年无瘤生存率为22.7%。基于219例肿瘤组织中CEP63、FOSL2、PAQR6的拷贝数变异,分别对非肌层浸润性膀胱癌患者和肌层浸润性膀胱癌患者进行生存分析,发现CEP63和FOSL2的拷贝数增加是非肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。FOSL2和PAQR6的拷贝数增加是肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。基于CEP63、FOSL2的拷贝数变异构建非肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数（Prognostic Index,PI）,预测模型为PI=1.5095×CEP63+1.47123×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发风险是预后指数低的患者的3.434倍（p=0.0003）。基于FOSL2和PAQR6拷贝数变异,构建肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数,预测模型为PI=2.0440×FOSL2+2.2079×PAQR6,结果显示预后指数高的肌层浸润性膀胱癌患者发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的5.443倍（p=0.0001）。对于基于传统危险分层中的高风险非肌层浸润性膀胱癌患者,生存分析结果显示,预后指数高的患者无瘤生存期更短（p=0.00056）。在膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63（p=0.036）与FOSL2（p<0.01）的拷贝数相比于正常对照尿沉渣脱落细胞样本显着增加。应用3D数字PCR检测,发现肌层浸润性膀胱癌尿沉渣脱落细胞样本中CEP63（p<0.01）与FOSL2（p=0.046）的拷贝数显着高于非肌层浸润性膀胱癌样本,CEP63的拷贝数在发生淋巴结转移的膀胱癌患者中显着增加（p=0.042）。生存分析结果显示非肌层浸润性膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63的拷贝数增加（p<0.01）或FOSL2的拷贝数增加（p=0.018）预示着更大的肿瘤复发风险。基于尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数变异在训练集（n=41）中构建非肌层浸润性膀胱癌12个月内发生肿瘤复发的预测模型并在验证集（n=41）中进行验证,预测模型为PIL=-2.679+2.083×CEP63+1.827×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者12个月内发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的6.612倍（p=0.002）。ROC曲线分析结果显示3D数字PCR检测尿沉渣脱落细胞样本中CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.848和0.803,灵敏度分别为0.750和0.650,阴性预测值分别为0.786和0.708。而real-time PCR检测CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.601和0.685,灵敏度分别为0.475和0.425,阴性预测值分别为0.644和0.646。进一步基于3D数字PCR联合尿样本中CEP63与 FOSL2 的拷贝数变异构建膀胱癌患者诊断型:L=-1.817+2.267×CEP63+2.695×FOSL2,该模型的 ROC 曲线下面积为 0.858,灵敏度为85.0%,阴性预测值为83.8%。本项研究发现CEP63、FOSL2、PAQR6在膀胱癌中拷贝数增加,前两者与膀胱癌肿瘤的分期和病理分级显着相关。CEP63、FOSL2的拷贝数变异能够对非肌层浸润性膀胱癌患者的肿瘤复发风险进行评估和预测,FOSL2、PAQR6的拷贝数变异可应用于肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发的预测。在膀胱癌患者尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数显着增加,并与肿瘤分期相关。尿样本中CEP63和FOSL2拷贝数增加的非肌层浸润性膀胱癌患者1年内发生肿瘤复发风险更高。研究中应用的3D数字PCR相比于real-time PCR检测效能更高,基于3D数字PCR的尿样本诊断模型能够较好的区分膀胱癌与正常人,为未来膀胱癌尿液检测提供了新途径。第二章EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属于疱疹病毒科γ亚科,是双链DNA病毒。EB病毒是人类普遍且长期感染的病毒。在世界人口中大约有95%存在终生的无症状感染。EB病毒参与了人类多种恶性肿瘤的形成,包括Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胃癌等。EB病毒的发现距今已有50余年,但病毒的致癌机制目前仍然尚未清楚。miRNA是基因表达转录后调控的重要因子,在多种复杂的细胞生物学进程,例如细胞发育和分化中扮演着十分重要的作用。越来越多的研究发现某些特定miRNA的负调控作用能够引起多种器官的癌变发生。EB病毒是第一个发现的能够编码miRNA的病毒,已有研究发现部分EB病毒编码的miRNA能够调控宿主基因的表达。但对于其他EB病毒编码的miRNA在癌变过程中的作用机制目前还尚未完全了解。本项研究旨在通过miRNA表达谱芯片和转录组测序分析,构建EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱,分析病毒miRNA在宿主细胞中对宿主基因表达的调控作用,进而探索病毒miRNA对宿主细胞生物学功能的影响,以及在癌变发生和发展过程中所起到的作用。EB病毒相关胃癌在亚洲胃癌患者中约占6%,需要通过EBER原位杂交检测证实肿瘤组织中存在EB病毒的感染,由于EBER原位杂交尚未作为胃癌患者的常规病理检测项目,受到样本收集难度的限制,以及RNA较容易降解的特性,目前国内还尚未有基于EB病毒相关胃癌新鲜组织的转录组测序分析研究。在本项研究中,我们对8例EB病毒相关胃癌新鲜冻存组织、2株EB病毒相关胃癌细胞系SNU719、YCCEL1和2株EB病毒阴性胃癌细胞系AGS、HGC27进行了miRNA表达谱芯片和转录组测序分析宿主基因、宿主miRNA和EB病毒miRNA的表达情况。通过生物信息学分析,联合公共数据库中38例EB病毒相关胃癌的基因表达数据,探索EB病毒miRNA与宿主miRNA以及宿主基因的关系。为验证数据分析结果,进一步对筛选出的病毒miRNA进行体外细胞功能实验,探索其对胃癌细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的影响。为了解筛选出的在EB病毒相关胃癌中能够显着影响细胞生物学功能的病毒miRNA在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即鼻咽癌中的作用。我们对33例鼻咽癌新鲜冻存组织进行了转录组测序。并通过体外细胞功能实验探索候选病毒miRNA在鼻咽癌细胞中对细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的调控作用。在本项研究中,我们通过对miRNA表达谱芯片和转录组测序数据分析获得了 EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱,筛选出在肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中均高表达的4个病毒miRNA。对其进行靶基因预测,我们发现在EB病毒相关胃癌中高表达的4个病毒miRNA靶基因主要富集于细胞迁移、细胞周期调控、细胞间信号转导和DNA复制等重要生物学功能上。而对于肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析水平的分析发现,4个宿主miRNA在肿瘤组织与细胞系中的表达水平与EB病毒miRNA的表达成正相关关系,相关系数大于等于0.9。进一步分析这4个宿主miRNA与EB病毒miRNA的序列,发现 EB 病毒 miRNA miR-BARTl-3p 与宿主 miRNA hsa-miR-29a-3p 具有相同的5’端种子区序列;而miR-BART7-3p则与宿主miRNA hsa-miR-154-3p具有相同的5’端种子区序列。由此推测上述病毒miRNA与宿主miRNA的调控功能具有一定的相似性。为进一步探索“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA是否协同作用共同参与调控细胞生物学功能。首先联合TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中转录组数据和 GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中表达谱芯片数据,以及本项研究中的转录组测序数据,分析共计46例EB病毒相关胃癌中肿瘤与癌旁组织的差异宿主基因,结合在EB病毒相关胃癌相比于EB病毒阴性胃癌细胞中差异的宿主基因,以此对“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA的交集靶基因进行筛选,结果显示,在EB病毒相关胃癌肿瘤组织中差异表达,并与EB病毒感染相关的宿主靶基因,其信号通路主要富集于涉及细胞生长、迁移、分化等重要功能的2个信号通路。说明候选的病毒miRNA可能与其相关的宿主miRNA共同参与到对细胞生长、迁移等重要功能的调控中。进一步的体外细胞功能实验也表明了miR-BART1-3p和miR-BART7-3p能够抑制胃癌细胞的增殖和迁移,对细胞的生长起负向调控作用。此外,在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤,鼻咽癌中,我们也构建了 EB病毒miRNA的表达谱,与EB病毒相关胃癌不同的是,miR-BART1-3p在鼻咽癌中的表达水平较低而miR-BART7-3p在鼻咽癌中的表达水平也仅处于中等。但通过体外细胞功能实验,我们发现miR-BART7-3p在鼻咽癌细胞中,仍具有对细胞增殖和迁移功能的抑制作用。在上述研究中,我们构建了 EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱。通过生物信息学分析获得了具有相同种子区序列的病毒和宿主miRNA,两者共同参与了涉及细胞增殖、迁移、分化等重要生物学功能的信号通路调控。体外细胞实验结果表明了病毒miRNA对于胃癌和鼻咽癌细胞在增殖、细胞周期和细胞迁移能力的抑制作用。本项研究对病毒miRNA miR-BART1-3p和miR-BART7-3p在胃癌细胞中的作用及其可能的机制进行探索,发现了miR-BART7-3p在两种EB病毒相关恶性肿瘤中具有相似的生物学功能,研究从新的视角提供了 EB病毒影响肿瘤进展的可能机制,有助于促进对于上皮性恶性肿瘤中EB病毒感染在癌变中作用的理解。
李回梦[2]（2021）在《ING3在乳腺癌中的表达及功能研究》文中提出[目的]本研究通过生物信息学方法探讨了ING3mRNA表达水平与临床指标（乳腺癌分期、分子分型、绝经状态、年龄、病理学分型等）的相关性;通过生存分析,探讨ING3 mRNA表达水平与乳腺癌患者预后的关系。同时我们在乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231中过表达ING3基因,研究ING3对乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231增殖能力、细胞凋亡、细胞周期的影响;最后通过GSEA分析,对ING3参与乳腺癌发生发展的信号通路进行预测。为寻找乳腺癌诊治中新的预后、诊断、治疗及疗效评估靶点提供理论基础。[方法]1.从TCGA数据库下载乳腺癌患者的ING3基因表达数据和临床数据,比较癌旁正常组织与癌组织以及不同临床指标问ING3的差异表达情况。2.将乳腺癌患者ING3基因表达数据以中位值区分高低表达再结合乳腺癌患者生存时间进行生存分析。3.通过GSEA分析,对ING3可能参与的信号通路进行预测。4.采用qRT-PCR和western bloting技术检测乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231、jimt-1,正常乳腺上皮细胞MCF10A中ING3的表达情况。5.在MCF7、MDA-MB-231细胞中通过脂质体转染过表达ING3质粒,同时设置空载体质粒组作为阴性对照。6.采用qRT-PCR和蛋白印迹实验对ING3过表达情况进行验证。7.采用CCK8法检测过表达ING3后MCF7、MDA-MB-231细胞增殖能力的变化。8.经流式细胞仪检测过表达ING3后MCF7、MDA-MB-231细胞凋亡的变化。9.经流式细胞仪检测过表达ING3后MCF7、MDA-MB-231细胞周期的变化。10.采用qRT-PCR比较过表达ING3后MCF7细胞增殖、凋亡及细胞周期相关基因的表达变化。[结果]1.在乳腺癌组织中ING3mRNA表达明显低于正常乳腺组织,并且ING3表达水平与不同年龄、ER、PR、HER2状态相关。2.ING3 mRNA表达水平可以作为HER2阳性乳腺癌的预后评估因素。3.GSEA 分析提示 ING3 可能参与 KEGGOXIDATIVEPHOSPHORYLATION、KEGGERBBSIGNALINGPATHWAY等信号通路,对乳腺癌发生发展起重要作用。4.qRT-PCR和western bloting显示ING3在乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞株间差异表达。5.qRT-PCR和western bloting显示在乳腺癌细胞中转染过表达质粒后ING3表达水平明显升高。6.CCK8增殖实验显示过表达ING3后MCF7、MDA-MB-231细胞增殖能力明显减弱。7.流式细胞仪凋亡检测显示:过表达ING3后MDA-MB-231细胞凋亡细胞明显增多。8.流式细胞仪细胞周期检测显示:过表达ING3后MCF7细胞周期阻滞于G0/GI期。9.过表达ING3后MCF7细胞细胞周期依赖性激酶抑制剂CDKN1A表达上调,细胞周期调控蛋白cyclinD1在过表达ING3后表达下调,增殖细胞核抗原PCNA在过表达ING3后表达下调。[结论]1.与正常乳腺组织对比,ING3在乳腺癌组织中表达明显下调,ING3表达水平与年龄、ER、PR、HER2状态相关。2.在正常乳腺上皮细胞MCF10A和乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231、jimt-1中ING3差异表达。3.过表达ING3可引起乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡细胞增多,MCF7细胞周期G0/G1期细胞比例增多,明显抑制MDA-MB-231、MCF7细胞增殖能力。4.过表达ING3影响细胞周期相关基因CDKN1A、cyclinD1和细胞增殖相关基因PCNA的表达,ING3可能参与了 KEGGOXIDATIVEPHOSPHORYLATION、KEGGERBBSIGNALINGPATHWAY等信号通路,对乳腺癌发生发展起重要作用。
朱青[3]（2021）在《第一部分：AHR介导黄曲霉毒素B1在肝细胞癌中的毒性研究 第二部分：靶向测序对多种EBV感染相关恶性肿瘤中EBV整合位点分析研究》文中提出研究背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是主要起源于肝脏上皮细胞的恶性肿瘤,居世界肿瘤发病率和死亡率的第五和第二位,是我国第四位常见的恶性肿瘤。目前,已经确定的肝癌危险因素包括乙型（Hepatitis B virus,HBV）和丙型（Hepatitis C virus,HCV）肝炎病毒的慢性感染,以及饮食中黄曲霉毒素（Aflatoxin）暴露是肝癌的主要病因之一。黄曲霉毒素相关肝癌是我国肝癌患者区别于国外发病患者的一个显着类型,黄曲霉毒素被人体摄取后,进入肝细胞引起细胞发生恶性转化继而诱发肝癌的进程和结局各有不同,因此探寻肝细胞内与黄曲霉毒素代谢和毒性相关的关键分子,寻找黄曲霉毒素的潜在受体,阐述影响黄曲霉毒素代谢的调控机制并发现筛查黄曲霉肝癌易感靶点迫在眉睫。研究目的:（1）明确肝癌细胞内黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）的结合分子,揭示AFB1进入肝癌细胞后的关键步骤;（2）明确AFB1对下游代谢通路的调控作用,进一步阐明AFB1诱导肝癌发生的分子机制;（3）预测AFB1与关键抗性分子的作用机制;（4）明确黄曲霉相关肝癌（AF-HCC）免疫治疗靶点的可行性。研究方法:本研究基于全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选技术,将AFB1作用于肝癌细胞系PLC/PRF/5,经过6轮AFB1的诱导后,收集存活的肝癌细胞,通过二代测序鉴定出能够抵抗AFB1持续诱导的关键基因。利用非靶向代谢组学检测AFB1对AHR敲降前后肝癌细胞代谢物质的丰度变化。通过大肠杆菌体系纯化出AHR蛋白分子的N端和C端蛋白,利用核磁饱和转移差谱技术（STD）确定AFB1与AHR蛋白的结合能力。通过分子对接预测AFB1与AHR的结合位点,检测关键结合位点的AHR突变体蛋白与AFB1的结合力。收集江苏启东地区黄曲霉相关肝癌患者标本,检测AHR表达水平与PD-L1表达的关系。体内实验验证PD-L1抑制剂对AHR高表达肝癌的治疗效果。研究结果:全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选发现AHR敲降的肝癌细胞系可以耐受高浓度的AFB1。AFB1可以增加肝癌坏死过程中长链脂肪酸的积累,且AHR是调控长链脂肪酸代谢的关键因子。AFB1可以激活AHR的表达,并且促进AHR蛋白入核过程,与ARNT形成二聚体,调控下游P450代谢通路相关基因的表达。AHR蛋白的N端可以与AFB1直接结合,第208位的异亮氨酸是调控两者结合能力的关系位点。AHR的缺失可以显着降低肝癌细胞内黄曲霉加合物的形成,减少AFB1对肝细胞的损伤,且AHR的高表达会促进肝癌细胞PD-L1表达,使黄曲霉相关肝癌对免疫治疗更加敏感。结论:本课题通过全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选和多种分子生物学实验阐明了 AHR是AFB1潜在的胞内代谢性穿梭受体,其在AFB1代谢和毒素诱导的肝癌中起重要作用,可以作为黄曲霉相关肝癌的候选治疗靶标。AHR的激活可以诱导PD-L1的表达,使黄曲霉相关肝癌对免疫治疗更加敏感。研究背景:爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）与多种恶性肿瘤有关,EBV的持续感染会导致多种恶性肿瘤,包括伯基特淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,鼻咽癌,胃癌等。EBV病毒致癌蛋白的表达和慢性炎症的发生是导致肿瘤发生发展的主要机制,但是目前针对EBV整合到人类基因组中破坏基因表达或基因组稳定性的系统系研究仍然较少。研究目的:我们的工作为多种恶性肿瘤的EBV整合图谱提供了大规模的全基因组分析。我们比较了不同肿瘤中EBV整合位点之间的差异,并且探讨了 EBV整合对基因表达的影响,试图阐明EBV整合与肿瘤发生和发展之间的联系。研究方法:我们收集了多个肿瘤的冷冻组织标本,包括NPC（n=177;中山大学肿瘤防治中心和广西医科大学附属第一医院）;胃癌（n=39;中山大学肿瘤防治中心和青岛大学附属医院）;NK/T细胞淋巴瘤（n=25;中山大学癌症中心和瑞金医院）;霍奇金淋巴瘤（n=11;中山大学癌症中心）;鼻咽炎（n=1;中山大学癌症中心）。从这些肿瘤组织中分离基因组DNA,使用靶向EBV的单链DNA探针对基因组DNA进行杂交捕获,并使用生物信息学方法分析全基因组范围内EBV整合位点特征和整合数量差异。同时,我们检测了 EBV常见整合位点附近的基因表达变化,并通过免疫组织化学验证了热点基因与EBV之间的关系。研究结果:我们从33个肿瘤和C666-1细胞系中共鉴定出197个EBV整合位点,其中EBV在胃癌的整合率（25.6%）高于鼻咽癌的整合率（9.6%）。我们发现多个EBV整合位点位于调节TNF-α,NF-κB信号通路的肿瘤抑制基因和炎症相关基因的附近。此外,在EBV基因组中,这些断点经常位于oriP或末端重复序列。这些断点常被微同源序列包围,这与涉及病毒基因组复制和微同源介导的重组的整合机制一致。结论:EBV整合优先发生在宿主基因组染色体不稳定的区域内,整合位点常位于EBV基因组的oriP或末端重复序列周围。多个EBV整合位点位于肿瘤抑制基因的附近,这些基因在癌症进展过程中经常被破坏。EBV整合参与了 EBV复制和微同源性介导的基因重组。
王玲[4]（2021）在《双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长》文中提出目的:胃癌对人类生命和经济造成严重负担。化学治疗是胃癌的主要治疗方式之一,然而胃癌患者对化疗药物的敏感性差及不耐受副作用等原因,导致其预后不佳。开发新的化疗药物成为胃癌研究的热点。双硫仑作为一种临床用戒酒药,在癌症中表现出广谱的抗肿瘤作用。双硫仑与铜联合可以增强其抗肿瘤能力。因此,为了给胃癌的治疗提供更多可选择的药物,我们研究双硫仑联合铜对胃癌细胞的作用,同时探讨其效应机制。方法:在体外细胞实验中,以胃癌细胞株MKN-45细胞和BGC-823细胞为细胞模型,采用CCK8法和细胞克隆形成实验分别检测双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的毒性和增殖活力作用;使用Transwell和细胞划痕实验研究双硫仑联合铜对胃癌细胞的侵袭迁移效应;使用Annexin V-FITC/PI流式细胞凋亡染色和免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白（BCL2、BAX）的表达,研究双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的凋亡作用;采用透射电镜、免疫印迹、瞬时转染和慢病毒稳定转染等多种方法从结构、分子和蛋白水平研究双硫仑联合铜对MKN-45细胞和BGC-823细胞的自噬作用;使用荧光探针检测活性氧的表达,免疫印迹法检测P21、P53、γ-H2AX、Fzd7、β-catenin、C-myc、Cyclin D1蛋白的表达,使用Seahorse XF24分析仪检测细胞中氧耗率和细胞外酸化率,研究双硫仑联合铜通过调节应激反应和Wnt/β-catenin信号通路发挥对MKN-45细胞和BGC-823细胞的抗肿瘤作用。在体内研究中,以雄性Balb/C裸鼠为动物模型,使用MKN-45细胞建立胃癌的皮下移植瘤模型,通过研究肿瘤体积大小,对肿瘤组织进行苏木素-伊红染色,并利用免疫组化染色检测Ki67的表达,研究双硫仑联合铜对胃癌细胞体内增殖的抑制作用;通过记录裸鼠的体重,研究双硫仑联合铜在体内的毒副作用;通过Tunel凋亡染色及免疫组化（Beclin1、LC3、P53、γ-H2AX、Fzd7、β-catenin、C-myc和Cyclin D1）研究双硫仑联合铜抑制胃癌细胞体内生长的作用机制。结果:双硫仑联合铜抑制MKN-45细胞和BGC-823胃癌细胞的体外增殖活力和侵袭迁移能力,存在时间-剂量依赖性;双硫仑联合铜也可以在体内抑制胃癌皮下移植瘤的生长（抑制率为48.24%）和增殖（Ki67的表达降低）,且无明显毒副作用。在体外,双硫仑联合铜可以诱导MKN-45细胞和BGC-823细胞发生凋亡,调控线粒体凋亡途径中的BCL2和BAX蛋白;在体内,双硫仑联合铜可以诱导凋亡,Tunel染色结果显示实验组移植瘤组织中的凋亡细胞增加。双硫仑联合铜可以在体外诱导MKN-45细胞和BGC-823细胞发生自噬和自噬流,在电镜下可以观察到自噬体,在蛋白水平上调Beclin 1和LC3的表达;通过瞬时转染GFP-LC3和稳定转染m RFP-GFP-LC3分别构建表达GFP-LC3和m RFP-GFP-LC3的胃癌细胞,双硫仑联合铜可以上调MKN-45细胞和BGC-823细胞中GFP-LC3和m RFP-GFP-LC3的表达。双硫仑联合铜可以增加活性氧、抑制糖酵解和氧化磷酸化,在蛋白水平上调P53、P21和γ-H2AX的表达,下调β-catenin、Cyclin D1、C-myc、Fzd7的表达。结论:双硫仑联合铜具有抑制胃癌细胞生长、迁移及侵袭的能力,可以诱导胃癌细胞发生凋亡和自噬,通过调控应激反应和Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肿瘤作用,且在体内无明显毒性作用。双硫仑有潜力成为治疗胃癌的抗肿瘤药物。
黄伦[5]（2021）在《miR-148a-3P在HeLa源性宫颈癌干性维持中的作用》文中认为背景:宫颈癌是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一,宫颈癌在发展中国家的发病率仍在逐年升高,并且有年轻化的趋势。复发、转移是晚期宫颈癌病人死亡的主要原因。大量研究表明肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）或肿瘤干细胞样细胞（cancer stem-like cells.CSLCs）是造成肿瘤复发、转移的根源。新近研究证明,miRNAs参与肿瘤干性的产生和维持。miR-148a-3p是一种重要的肿瘤调控基因。前期研究发现miR-148a-3p在宫颈癌细胞中低表达,发挥抑癌基因的作用。目的:本研究旨评价miR-148a-3p抑制HeLa源性宫颈癌干细胞样细胞自我更新、体外致癌及迁移侵袭能力的效应。为宫颈癌干细胞的miRNAs表达模式改变宫颈癌发病机制提供一种新的认识。为筛选上调miR-148a-3p表达靶向抑制宫颈癌干性治疗人宫颈癌的候选药物提供新靶标和实验依据。方法:（1）用无血清干细胞培养基超低粘附板悬浮培养法获得HeLa细胞系第二代球细胞作为CCSLCs模型,qRT-PCR检测人宫颈癌HeLa细胞及其CCSLCs的miR-148a-3p表达,Westerblot检测人宫颈癌HeLa细胞及其CCSLCs的肿瘤干细胞标志物CD133和CD44蛋白表达。Transwell细胞侵袭实验、肿瘤球形成实验、琼脂集落形成实验分别检测miR-148a-3p对人宫颈癌HeLa细胞及其CCSLCs的侵袭能力、自我更新及体外致癌能力的影响。（2）miR-148a-3p模拟物转染HeLa源性CCSLCs,构建miR-148-3p过表达模型;miR-148a-3p抑制物转染HeLa细胞构建miR-148-3p抑制模型,qRT-PCR检测miR-148a-3p模拟物或miR-148a-3p抑制物的转染效率。与miR-148a-3p模拟物/抑制物阴性对照序列组及空白对照组相比,比较上调或下调miR-148-3p表达对肿瘤干细胞标志物CD133、CD144表达、肿瘤细胞侵袭能力、自我更新及体外致癌能力的影响。（3）在miR-148a-3p抑制物转染的HeLa细胞系,用miR-148a-3p模拟物转染,qRT-PCR比较转染前后miR-148a-3p表达。与miR-148a-3p抑制物阴性对照序列组、miR-148a-3p抑制物转染组和miR-148a-3p模拟物转染组对比,检测细胞CD133、CD44表达、肿瘤细胞侵袭能力、自我更新及体外致癌能力。分析在功能缺失的HeLa细胞中,恢复miR-148a-3p表达对宫颈癌干性的影响。结果:（1）与HeLa细胞相比,miR-148a-3p在HeLa源性CCSLCs中表达更低,肿瘤干细胞标志物CD133和CD44在HeLa源性CCSLCs中表达更高,HeLa源性CCSLCs具有更强的自我更新、体外致癌和细胞侵袭能力（P<0.05）;（2）miR-148a-3p模拟物有效地增高HeLa源性CCSLCs miR-148a-3p表达水平,抑制体外自我更新、致癌能力和细胞侵袭能力以及下调肿瘤干细胞标志物CD133和CD44蛋白表达（P<0.05）;（3）miR-148a-3p抑制物有效地降低HeLa细胞miR-148a-3p表达水平,促进体外自我更新、致癌和细胞侵袭能力以及上调肿瘤干细胞标志物CD133和CD44蛋白表达（P<0.05）;（4）miR-148a-3p模拟物逆转miR-148a-3p抑制物的HeLa细胞miR-148a-3p表达水平,体外自我更新、致癌和细胞侵袭能力的促进作用以及肿瘤干细胞标志物CD133和CD44蛋白表达的上调效应（P<0.05）。结论:与宫颈癌HeLa细胞相比,miR-148a-3p在HeLa源性CCSLCs中低表达,miR-148a-3p能有效抑制CCSLCs干性。
王泽洋[6]（2021）在《EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究》文中研究表明研究背景:胃癌（Gastric Cancer,GC）是全球范围内第五大高发肿瘤疾病,居肿瘤死亡原因第二位。胃癌病因包括遗传因素、理化因素及感染因素等。在感染因素中,幽门螺杆菌与胃癌有关已达成研究者共识。除此之外,近年来EB病毒（epstein barr virus,EBV）也已引起研究者高度重视。EBV是1964年Epstein和Barr从非洲儿童Burkitt’s淋巴瘤培养细胞中发现的病毒,属人类疱疹病毒4型,即γ-型疱疹病毒,特异性人类嗜淋巴细胞性病毒。目前已知,EBV感染与多种人类恶性肿瘤如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金病及非霍奇金淋巴瘤等密切相关。1993年,Tokunaga等通过原位杂交技术证实胃癌细胞内存在EBV编码的小RNA,将之定义为EBV相关性胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）。2014年癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）根据分子水平的差异将胃癌分为四种分子病理亚型,包括EB病毒感染型、基因组稳定型、染色体不稳定型及微卫星不稳定型。其中,EBVaGC以其区别于其他类型胃癌的多种特质引起了广泛关注。据统计,EBVaGC约占全世界胃癌发病率的10%,且在不同地域间存在差异（[6]）。全面认识EBVaGC对胃癌发生机制研究及临床诊治有重要指导意义。表型特征是生物体从宏观到微观（即分子组成）、从胚胎发育到出生、成长、衰老乃至死亡过程中,形态特征、功能、行为、分子组成规律等所有生物、物理和化学特征的集合。全景解析人类表型特征,建立宏观表型与微观表型间多维度关联,是解析生命科技的重要线索。目前,对EBVaGC分子表型及临床表型特征等已有所了解,比如,EBVaGC中显示出PIK3CA的反复突变、DNA甲基化以及JAK2,PD-L1和PDL2过表达扩增等。然而,EBVaGC的分子模式非常复杂,包含多种遗传学和表观遗传学变异、转录组学及蛋白组学变异等,对此,我们的认知还十分有限,尚需深入探索,EBVaGC主要临床表型特征及具体发病机制也需要进一步深入研究。全面阐释EBVaGC表型特征可提供潜在的新型胃癌治疗靶标和路线图,可为制定胃癌精准诊治策略提供参考。EBVaGC致癌原因与EB病毒感染有关。病原微生物感染的基因组学和蛋白质组学研究旨在找出在病原体感染和宿主防御整个过程中影响重要生物学活动的关键蛋白以及这些蛋白的功能机制。对重要微生物的基因组学和蛋白质组学差异的鉴定不仅有助于深入了解其发病机制,还可为相关疾病的治疗提供新靶点。然而对于EBV感染导致的胃癌,目前几乎所有基因和蛋白水平的研究均聚焦于单一因素或基于生物信息学数据库的大样本数据集,仍缺乏通过独立采集质谱技术检测蛋白质组学变化建立的对EBVaGC基因和蛋白表达谱的综合研究。血清学检测,作为一种方便、非侵入性和成本效益高的检测手段,在人群流行病学调查、疾病过程的动态监测和风险预测方面显示出显着的优势。到目前为止,EBV血清学检测已经广泛应用于Burkitt淋巴瘤,鼻咽癌,霍奇金或非霍奇金淋巴瘤,睾丸癌等疾病的风险预测及早期诊断。然而,很少有研究集中于EBV血清学与胃癌风险的关系。此外,目前尚不清楚EBV血清学检测是否具有GC预测和预后的潜能。综上,本研究试图从基因变异、蛋白表达、病理组织学形态、血清抗体表达等不同层面,多维度探讨EBVaGC表型特征并筛选鉴定EBVaGC关联蛋白。对于已鉴定出的EBVaGC关联蛋白,我们进一步探究了其在EBV相关性胃癌中的分子调控机制。本研究为进一步探讨EBVaGC关联蛋白的作用机制奠定基础。研究目的:1.明确EBVaGC的表型特征。2.EBVaGC关联蛋白的筛选鉴定。3.明确EBVaGC关联蛋白GBP5的作用机制。研究方法:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别（一）EBVaGC差异表达基因分析利用公共数据资源GEO数据库检索包含EBV相关性胃癌信息的基因表达谱芯片,确定GSE51575作为分析芯片。该芯片包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本基因表达信息。采用GEO2R分析出该表达谱芯片的差异表达基因,|FC|>2.0,P<0.05为具有统计学意义。（二）EBVaGC差异表达蛋白筛选验证a)收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织共计132例。b)应用EBV编码RNA（EBER）原位杂交（ISH）技术对胃癌样本进行EBV原位检测。c)利用EBV阳性与阴性胃癌组织进行DIA-相对定量蛋白质组学分析,筛选具有差异表达水平的蛋白。（三）EBVaGC病理组织学特征分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织及其癌旁正常组织标本共计132例。通过患者病历收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、淋巴结外肿瘤种植等临床病理信息。2.通过原位杂交检测EBV原位感染情况,进行分析。（四）EBVaGC血清EBV抗体表达分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年11月至2020年6月的胃癌手术患者以及庄河胃癌高发现场患者血样本,其中包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎以及胃癌病例共计1790例。在患者病历中收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、节外种植等临床病理信息。本研究获得中国医科大学第一附属医院研究所医学伦理委员会的批准,所有受检者均提供书面知情同意书。2.利用血清定量检测不同EBV-VCA IgG抗体滴度,分析其表达水平与EBV相关性胃癌发病风险、预后及临床病理参数的相关性。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究（一）GBP5原位表达与胃癌发病风险、临床病理参数及预后关系利用免疫组化技术对255对胃癌组织以及癌旁正常对照组织进行免疫组化染色,分析其与胃癌之间的关系。（二）GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响1.GBP5过表达和沉默质粒的构建:分别选取GV146和GV102为GBP5的过表达以及沉默质粒载体,并经过酶切确认。化学合成GBP5基因序列,用Kpn I/Bam HI酶切含有目的基因的质粒,将酶切产物连接入线性化表达载体,经PCR鉴定。2.根据文献报道,选取EBV阳性SNU719胃癌细胞系以及EBV阴性AGS胃癌细胞系,并经过Real-time PCR确认EBV的表达,进行后续实验。3.采用CCK-8进行细胞增殖效应的检测。（三）GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响1.EBVaGC差异表达免疫相关基因的确定本研究经查阅文献后共总结出47个免疫相关基因,进一步将GSE51575中差异表达基因与47个基因取交集后筛选出差异表达的免疫相关基因。P<0.05被认为具有统计学意义。2.确定EBVaGC与GBP5相关的免疫基因采用斯皮尔曼相关分析方法分析GBP5与EBVaGC差异表达相关的免疫相关基因的相关情况。|r|>0,P<0.05具有统计学意义。3.验证EBVaGC免疫相关基因差异表达本研究收集GBP5过表达和沉默的SNU719和AGS细胞系培养液上清进行酶联免疫吸附实验对预测的GBP5相关的免疫基因进行验证。利用SPSS Statistics 24和Graph Pad Prism 8进行统计分析。P<0.05为具有统计学意义。（四）GBP5表达调控网络分析1.EBV相关性胃癌中GBP5蛋白互作网络构建本研究利用STRING在线工具（v11.0,https://string-db.org）预测GBP5蛋白互作网络。将GSE51575中差异表达基因与预测出的GBP5互作蛋白取交集,筛选出差异表达的GBP5互作蛋白,P<0.05被认为具有统计学意义。2.EBVaGC中GBP5与互作蛋白间的关联分析本研究利用斯皮尔曼相关分析计算GSE51575数据集中GBP5与其差异表达互作蛋白间的相关性。|r|>0,P<0.05被认为具有统计学意义。3.EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析对GBP5及其具有显着相关性的互作蛋白进行GO（包括生物学过程、分子功能和细胞组成）和KEGG富集分析,P<0.05具有统计学意义。研究结果:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别1.EBVaGC关联基因表达特征（EBV+胃癌vs EBV-胃癌差异表达基因）对包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本的基因表达谱芯片GSE51575进行差异分析,结果显示在EBVaGC中共有1088个基因上调,879个基因下调表达（|FC|>2.0,P<0.05）,其中排位前者包括CXCL17、GBP5、DMBT1、SLC6A8等。将EBVaGC表达的关联基因进行通路富集分析,结果表明统计学差异最显着的前10条通路均与机体免疫功能相关,例如抗原加工和呈递;辅助性T细胞1、辅助性T细胞2以及辅助性T细胞17分化、移植物抗宿主反应等。2.EBVaGC关联蛋白表达特征（EBV+胃癌vs EBV—胃癌差异表达蛋白）2.1基于EBV检测的金标准EBER-ISH,EBV感染细胞在遵照试剂盒说明书处理过后细胞核可以被显着棕染。结果显示132例胃癌样本中共有7例组织标本具有阳性EBER信号。2.2 EBVaGC的蛋白质组学研究采用上述7例EBV+胃癌样本及与之年龄性别临床病理参数匹配的7例EBV—胃癌样本进行DIA-相对定量蛋白质组学分析。结果显示与EBV-阴性胃癌组相比,在EBV-阳性胃癌组中共鉴定出137个差异表达蛋白。其中,GBP5、C5AR1、THRAP3、P3H3和MDK为47个上调蛋白中差异前五的蛋白。2.3本研究将GSE51575中差异表达的基因分别与鉴定出的差异表达蛋白取交集。结果发现共有25个基因在两组数据中均差异表达,其中GBP5在25个差异表达蛋白中差异表达倍数最高,其在EBV-阳性胃癌中相较EBV-阴性胃癌同样显着上调（P=1.19E-03,log2FC=3.21）,提示GBP5可能是一种与EBVaGC高度相关的蛋白。3.EBVaGC临床病理参数分析我们进一步对EBVaGC的组织病理学特征进行了分析。首先利用EBV原位杂交实验检测132例胃癌组织,结果显示7例具有阳性信号,EBVaGC检出率为5.3%。全部EBV+胃癌病例为中老年男性。其基本病理学特征为:全部病例为中晚期胃癌,多发于胃体部位（4/7,57.14%）;大体分型以溃疡/溃疡浸润型为主（6/7,85.71%）;组织学分型以中分化及低分化腺癌为主（6/7,85.71%）;绝大多数呈浸润性性生长（6/7,85.71%）;淋巴结转移多见（5/7,71.43%）;所有病例均存在癌周淋巴细胞浸润。免疫组化染色结果显示,Ki67指数较高,多伴有P53阳性表达（5/7,71.43%）以及EGFR与VEGF表达（4/7,57.14%）。EBV-阳性胃癌与EBV-阴性胃癌相比,临床病理参数未见显着差异（P>0.05）。4.EBV血清抗体表达与胃癌风险/预后的相关性在发病风险方面,分析1790例EBV-VCA IgG感染状态与不同胃疾病的组间比较发现,萎缩性胃炎组和胃癌组的EBV-VCA IgG阳性率均显着高于对照组（AG:40.0%vs.30.5%;GC:38.6%vs.30.5%）。经年龄和性别校正后,研究发现EBV-VCA IgG感染者罹患萎缩性胃炎和胃癌的风险分别提高到1.55倍和1.36倍（分别为P=0.001,95%CI=1.21-1.99;P=0.011,95%CI=1.07-1.72）。在胃癌预后方面,对临床病理资料齐全的234例胃癌患者进行了随访。结果发现,在肠型胃癌亚组,EBV-VCA IgG感染状态与总生存期有关,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差（Mean survival month:49.2 vs.61.3,P=0.009,HR=3.50,95%CI=1.37-8.94）。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究1.GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性我们首先探讨了GBP5蛋白表达与胃癌组织病理学特征的关系,结果提示GBP5蛋白表达水平与浸润深度、脉管癌栓、淋巴结外肿瘤种植存在显着相关,在其他病理学参数的分组中未发现GBP5蛋白存在差异表达（P>0.05）。我们还分析了GBP5蛋白表达对胃癌预后的影响,单因素与多因素COX回归分析均未发现GBP5蛋白表达与胃癌预后具有相关性（P>0.05）。2.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响EBV+SNU719和EBV—AGS细胞系中转染GBP5过表达质粒和对照质粒以及沉默和沉默对照质粒,分别观察两组细胞在24h、48h、72h的细胞活性。结果发现SNU719细胞系中,GBP5过表达组72h时的细胞活性较阴性对照组升高（P=0.001）,GBP5沉默组细胞活性较沉默对照组降低（P<0.001）。3.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响采用GSE51575芯片数据,利用GEO2R分析GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫基因表达的影响,结果显示共有1088个基因上调,879个基因下调表达（|FC|>2.0,P<0.05）。进一步将47个免疫相关基因与GSE51575中差异表达基因取交集后发现23个基因在该芯片中存在差异表达,且均为上调表达,例如CXCL17等。4.GBP5表达与EBV相关性胃癌调控网络的关联分析本研究采用Sanger Box预测GBP5互作蛋白并确定其在EBVaGC中的差异表达情况,结果显示FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2和OASL可能为GBP5互作蛋白,且其在EBVaGC中均为上调表达,与GBP5存在显着的正相关关系。富集分析表明GBP5及其潜在的互作蛋白（OAS2、GBP2）可参与寡聚化核苷酸结合结构域样受体信号通路,提示EBVaGC中差异表达的GBP5、OAS2和GBP2可能通过影响此通路活性从而促进EBV相关性胃癌进展。研究结论:1.EBVaGC关联基因表达差异显着者有GBP5、CXCL17等,功能分析显示均与机体免疫功能相关。2.EBVaGC关联蛋白表达差异显着者有GBP5、C5AR1等,功能分析显示可能与乙醇降解Ⅱ类蛋白具有富集效应。3.EBV-阳性胃癌多见于中老年男性;胃体部位多发;溃疡/溃疡浸润型多见;中低分化腺癌多见,淋巴结转移多见。4.携带血清EBV-VCA IgG抗体者罹患胃癌发病风险升高;在肠型胃癌亚组中,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差。5.GBP5原位表达与胃癌不良临床病理参数正相关,尤其是与浸润深度、脉管癌栓以及结外肿瘤种植显着相关。6.GBP5可促进EBV阳性胃癌细胞增殖活性。7.在EBVaGC中,GBP5与23个免疫相关基因存在显着的相关性,其中CXCL17、IL-17、1L-8已经血清学表达实验证实。8.在EBVaGC中,GBP5表达调控通路生信分析结果提示,GBP5可与FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2、OASL互作。GBP5可能通过影响寡聚化域样受体信号通路活性从而促进肿瘤进展。
俞泽元[7]（2021）在《新型UBE2T抑制剂通过阻止RACK1泛素化抑制Wnt/β-catenin信号通路激活及胃癌生长》文中研究表明第一章Wnt/β-catenin信号通路异常激活及抑制剂在胃癌中的作用目的:研究Wnt/β-catenin信号通路异常激活在胃癌中的作用,探究目前处于临床或临床前研究中的Wnt抑制剂对胃癌细胞生长增殖的影响。方法:利用Oncomine platform和GEPIA公共数据库挖掘探讨β-catenin m RNA在胃癌组织中的表达水平。免疫组化实验检测β-catenin在胃癌与癌旁组织中蛋白表达水平。MTT实验检测九种抑制剂对胃癌细胞和正常胃黏膜细胞活力的影响。结果:Oncomine platform数据库中的五个基因组芯片数据分析显示胃癌组织中β-catenin m RNA水平显着高于癌旁组织,这与GEPIA数据库分析结果一致。免疫组化染色实验证实β-catenin的蛋白表达水平在胃癌组织中的表达明显升高。MTT试验结果显示三种抑制剂（NCB-0846,nicosamide,and PRI-724）对正常胃黏膜细胞有显着细胞毒性,而另外六种抑制剂（IWP-2,LF3,ethacrynic acid,ETC-159,LGK-974,and Wnt-C59）不仅不能抑制胃癌细胞的生长,还对正常胃黏膜细胞具有较高细胞毒性。结论:过度激活Wnt/β-catenin信号通路在胃癌的发生发展中起着重要作用。目前应用于其他癌症中临床前或临床研究的Wnt通路抑制剂要么具有较高的细胞毒性,要么对抑制胃癌细胞生长无效。第二章基于Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin破坏复合物组分胃癌新靶点的筛选及验证目的:探讨β-catenin破坏复合物组分RACK1在胃癌组织中下调的调控机制。方法:利用免疫组化方法在胃癌组织中筛选β-catenin破坏复合物主要组分,应用免疫组化,q RT-PCR,West blotting实验检测RACK1在胃癌中的表达水平。大量液相色谱-串联质谱分析寻找与RACK1相互作用的互作蛋白。免疫共沉淀及MST实验证实UBE2T与RACK1直接相互作用。泛素化实验验证UBE2T介导的RACK1泛素化。结果:免疫组化及West blotting实验证实RACK1蛋白水平在胃癌中低表达,并且胃癌中低表达RACK1与胃癌患者总体生存呈负相关,而q RT-PCR实验显示RACK1m RNA水平在胃癌与胃癌癌旁组织表达相似。通过大量质谱分析,我们鉴定出与RACK1相互作用的泛素结合酶UBE2T。免疫共沉淀及微量热运动实验证实了UBE2T与RACK1存在直接相互作用。我们通过泛素化实验数据显示UBE2T促进RACK1的泛素化。结论:β-catenin破坏复合物中重要组分RACK1在胃癌中通过泛素蛋白酶途径调节。第三章UBE2T通过泛素化调控RACK1降解激活Wnt/β-catenin信号通路的机制研究目的:探讨UBE2T通过泛素化调控RACK1激活Wnt/β-catenin信号通路的机制。方法:在HEK-293T细胞中,分别瞬时感染RACK1质粒和不同浓度UBE2T质粒,Western blot分析RACK1蛋白表达水平。利用Western blotting实验检测UBE2T敲除对RACK1蛋白水平表达的影响,IP实验检测RACK1的具体泛素链。应用胃癌病例石蜡样本连续切片,研究UBE2T与RACK1及β-catenin在胃癌组织中蛋白表达水平的相关性。通过免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）和WB方法分析UBE2T活性位点C86对RACK1泛素化水平的调控作用。在无E3参与情况下,体外泛素化实验检测UBE2T对RACK1泛素化影响。应用分子克隆技术构建RACK1的截断体,通过免疫沉淀和Western blotting方法分析UBE2T催化RACK1泛素化的具体赖氨酸位点。在HEK-293T细胞中瞬时感染RACK1及UBE2TC86突变质粒后,提取细胞浆蛋白及核蛋白,用Western blot检测β-catenin蛋白表达水平。结果:Western blotting实验显示UBE2T过表达可导致RACK1蛋白的减少,且在UBE2T敲除的胃癌细胞株AGS中RACK1蛋白升高,UBE2T通过K48泛素链催化RACK1的多聚泛素化。免疫组化实验结果显示胃癌组织中UBE2T与RACK1表达水平呈负相关,而与β-cateninin表达水平呈正相关。UBE2T促进RACK1的多聚泛素化降解依赖于UBE2T活性位点半胱氨酸C86位点,主要通过RACK1的赖氨酸位点K172,K225及K257促进其降解的,且这个过程不依赖于E3酶。UBE2T通过诱导RACK1降解促进β-catenin进入核细胞激活Wnt/β-catenin信号通路导致胃癌的发展。结论:UBE2T在缺少E3的情况下,通过RACK1赖氨酸位点K172,K225及K257促进RACK1的泛素化降解,继而导致Wnt/β-catenin信号通路激活。第四章泛素结合酶UBE2T在胃癌中的表达及其对胃癌细胞功能的研究目的:探究UBE2T对胃癌进展的影响。方法:利用Oncomine platform和GEPIA公共数据库挖掘探讨UBE2T在胃癌及多种癌组织中的表达水平。应用Western Blotting和q RT-PCR方法检测胃癌标本及癌旁组织中UBE2T表达水平情况。免疫组化检测UBE2T在胃癌及胃癌癌旁组织中的蛋白表达水平,分析UBE2T蛋白表达水平与临床病理参数的相关性。Western Blotting方法检测UBE2T在胃癌细胞株和正常胃黏膜细胞中的表达水平情况。通过CRISPR/Cas9敲除技术,应用克隆形成及裸鼠成瘤实验方法,检测UBE2T对胃癌细胞增殖和肿瘤生长的影响。结果:来自Oncomine及GEPIA数据库的数据显示胃癌组织中UBE2T m RNA表达水平较胃癌癌旁组织表达水平明显升高,且在24种癌中UBE2T m RNA水平也明显升高。免疫组化检测结果显示UBE2T蛋白表达水平与肿瘤大小,T分期,淋巴结转移数,临床病理分期及较差预后呈正相关。克隆形成实验证实敲除UBE2T后胃癌细胞生长增殖能力明显减弱。敲除UBE2T基因表达可显着抑制胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:敲除UBE2T能够抑制胃癌生长,UBE2T有望成为治疗胃癌的靶点.第五章新型UBE2T小分子抑制剂的发现及其对胃癌细胞作用的研究目的:UBE2T抑制剂的发现及其对胃癌细胞的抗肿瘤效应。方法:应用虚拟筛选软件Schrodinger（薛定谔）软件在Chemdiv和SPECS小分子化合物数据库中筛选靶向UBE2T的抑制剂进行分子对接并评分,选择评分较高的化合物。利用MTT实验检测18种化合物对三种胃癌细胞株的抑制作用,筛选目标化合物并测量IC50。应用微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）实验测定分析UBE2T蛋白和化合物之间的相互作用。通过免疫沉淀和WB方法分析小分子抑制剂对RACK1泛素化水平的影响。利用Western blot检测加入小分子抑制剂后β-catenin在胃癌细胞核蛋白,胞浆蛋白及总蛋白的表达水平。应用克隆形成,Traswell实验及裸鼠成瘤实验方法,检测UBE2T抑制剂对胃癌细胞增殖侵袭能力和肿瘤生长的影响。结果:本实验通过计算机虚拟筛选出18个UBE2T小分子抑制剂。MTT实验显示仅有小分子抑制剂M435-1279能够显着抑制三种胃癌细胞株生长。研究结果也证实小分子抑制剂M435-1279不能够阻碍UBE2T与RACK1的结合,但是能够显着抑制RACK1的泛素化水平,继而抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。UBE2T小分子抑制剂M435-1279能够在体外显着抑制胃癌细胞生长迁移能力,抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:M435-1279有望成为针对泛素结合酶UBE2T治疗胃癌的有效小分子抑制剂。
韩艳艳[8]（2020）在《PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究》文中研究表明目的:分析PIK3CA基因在鼻咽癌组织中表达差异及表观遗传学甲基化水平,阐述鼻咽癌组织中PIK3CA表达与鼻咽癌临床恶性表型、预后的关系;探讨PIK3CA表达模式对于鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响。在此基础上进一步探究PIK3CA上游调控PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和放疗抵抗的作用及其内在调控机制,为揭示鼻咽癌发生发展及放疗抵抗分子机制和个体化治疗靶点的筛选奠定科学基础。方法:第一部分:（1）组织水平,利用免疫组织化学SP染色法检测鼻咽癌及鼻咽正常粘膜组织标本PIK3CA表达水平差异,并分析鼻咽癌组织内PIK3CA表达水平与临床病理参数间的相关性,采用Kaplan-Meier法分析PIK3CA表达水平对鼻咽癌预后的影响;（2）体外细胞水平通过特异性si RNA转染鼻咽癌细胞下调PIK3CA表达,检测PIK3CA表达水平对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移等细胞功能的影响;（3）利用焦磷酸盐测序法检测鼻咽癌及正常鼻咽粘膜组织中PIK3CA基因启动子区甲基化水平差异。第二部分:（1）利用star Base生物信息学分析预测PIK3CA和mi R-515-5p之间的潜在靶位点,构建载有mi R-515-5p结合位点PIK3CA 3’UTR的野生型序列插入p GL3载体,采用双荧光素酶报告基因验证mi R-515-5p调控PIK3CA基因表达结合位点,并通过抗Ago2进行RIP检测并分析mi R-515-5p与PIK3CA的相互作用。（2）组织水平利用q RT-PCR法检测鼻咽癌和正常鼻咽粘膜组织中PIK3CA的m RNA表达水平,并在细胞水平采用western blot法分析PIK3CA基因在鼻咽癌细胞系及正常鼻咽粘膜细胞系中蛋白表达差异;并采用western blot法分析mi R-515-5p敲减后的NPC细胞中PIK3CA蛋白表达调控。（3）用CCK8法检测转染PIK3CA+mi R-515-5p的NPC细胞监测细胞增殖趋势。采用细胞克隆形成实验及流式细胞仪分析不同辐照剂量（0、2、4、6、8 Gy）下转染PIK3CA+mi R-515-5p的NPC细胞相较PIK3CA的存活分数及凋亡情况,并通过western blot法检测不同辐照剂量（0和8Gy）下以上两种细胞的细胞周期蛋白D1和Bax的蛋白水平,从而揭示mi R-515-5p调控PIK3CA对鼻咽癌细胞放疗抵抗水平影响。第三部分:（1）组织水平采用q RT-PCR检测NPC和正常组织中PVT1的表达及不同TNM分期的PVT1表达差异,并分析其表达与预后相关性;细胞水平采用q RT-PCR检测正常粘膜细胞系和NPC细胞系中的PVT1水平差异。（2）采用携带sh RNA的慢病毒转染敲减PVT1,通过q RT-PCR验证PVT1的敲减效率;使用CCK8法评估PVT1表达对细胞增殖水平影响。进行细胞克隆形成能力检测、细胞周期蛋白检测、流式细胞仪检测及western blot法,分析鼻咽癌细胞在不同辐照剂量（0,2,4,6,8Gy）下的存活分数、凋亡情况及细胞周期蛋白水平。（3）用star Base预测了PVT1与mi R-515-5p结合位点;采用双荧光素酶报告基因和抗Ago2法进行混合靶点阳性候选基因的单靶点验证。构建慢病毒载体,采用q RT-PCR评估NPC组织和细胞中转染mi R-515-5p和PVT1表达调控关系。（4）采用CCK8法检测转染mi R-515-5p、mi R-515-5p+PVT1的鼻咽癌细胞增殖情况,采用细胞克隆形成实验及流式细胞仪分析不同辐照剂量下（0、2、4、6、8 Gy）转染PVT1+mi R-515-5p的NPC细胞相较PIK3CA的存活分数及凋亡情况,并通过western blot法检测不同辐照剂量下（0和8 Gy）,以上两种细胞的细胞周期蛋白D1和Bax的蛋白水平,从而揭示PVI1调控mi R-515-5p对鼻咽癌细胞放疗抵抗水平影响。（5）通过western blot检测转染sh-PVT1、sh-PVT1+Anti-mi R-515-5p的鼻咽癌中PIK3CA、AKT和p-AKT的蛋白质水平,确定PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴调节关系。（6）为了验证PVT1在体内的功能,通过转染sh-PVT1或sh-Control的C666-1细胞建立异种移植小鼠模型,动态监测瘤体在裸鼠皮下成瘤及生长情况,验证PVT1对鼻咽癌细胞在体内生长的影响。结果:第一部分:（1）PIK3CA蛋白在71例鼻咽癌组织中的表达率为81.69%,高于正常鼻咽粘膜组织31.25%,差异具有统计学意义;PIK3CA在鼻咽癌中的表达与鼻咽癌患者的性别、年龄、病理类型、Ki-67等均无统计学相关性,与肿瘤T分期（P=0.000）、N分期（P=0.008）及临床分期（P=0.002）有相关性,经Kaplan-Meier生存曲线分析发现PIK3CA蛋白强表达的鼻咽癌患者的生存率低于低表达及中等表达的患者（Log Rank检验结果:?2=7.995,P<0.05）;（2）敲减PIK3CA的si RNA转染鼻咽癌细胞后,MTT实验显示鼻咽癌细胞的增殖活性受抑制;细胞划痕和transwell小室实验显示,CNE1细胞的迁移和侵袭能力在敲减PIK3CA后受到了的抑制（P<0.05）。（3）焦磷酸盐测序检测PIK3CA基因启动子甲基化水平,在启动子区发现4个甲基化位点,其中3个位点鼻咽癌组甲基化水平高于正常鼻咽粘膜组织组（P<0.05）。第二部分:（1）利用star Base预测mi R-515-5p和PIK3CA之间的潜在靶位点,双荧光素酶报告基因和RIP检测证实了mi R-515-5p是通过该结合位点调控鼻咽癌细胞中PIK3CA基因的表达;使用western blot法分析其调控关系,结果显示转染mi R-515-5p的鼻咽癌细胞较正常鼻咽粘膜细胞中PIK3CA的蛋白水平下调（P<0.05）,提示mi R-515-5p在体外负性调控PIK3CA的表达。（2）CCK8法检测结果提示,转染mi R-515-5p后鼻咽癌细胞较PIK3CA组增殖下降（P<0.05）,提示mi R-515-5p逆转了PIK3CA对细胞增殖的促进作用。（3）转染mi R-515-5p后,鼻咽癌细胞随辐射量的增加细胞存活分数降低,PIK3CA组较对照组存活分数下降幅度小,差异具有统计学意义（P<0.05）,PIK3CA促进鼻咽癌细胞的放疗抵抗,mi R-515-5p的上调逆转了PIK3CA诱导的对放疗抵抗的增强作用。流式细胞仪和western blot检测结果提示,PIK3CA过表达可抑制放疗导致的NPC细胞凋亡（P<0.05）,而转染mi R-515-5p后PIK3CA抑制放射线所致的凋亡作用被消除（P<0.05）。综上所述,PIK3CA促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡,而mi R-515-5p在调节NPC细胞增殖、凋亡和放疗抵抗中与PIK3CA起着相反的作用。第三部分:（1）组织水平,与配对正常对照组织相比,NPC组织中PVT1上调,晚期（III+IV）的PVT1表达水平高于早期（P<0.05）;而细胞水平,鼻咽癌中PVT1较鼻咽上皮细胞中上调,PVT1水平越高,细胞存活率越低（P<0.05）,以上结果提示PVT1可能是鼻咽癌的癌基因,其高表达导致了NPC的预后不良。（2）通过sh-PVT1瞬时转染鼻咽癌细胞,细胞增殖CCK8试验提示鼻咽癌细胞中PVT1下调抑制NPC癌细胞的增殖;细胞克隆形成实验显示,细胞随辐照剂量（0,2,4,6,8Gy）的增高sh-PVT1组较sh-Control组存活分数下降（P<0.05）,提示敲减PVT1后明显促进NPC细胞的辐射敏感性。流式细胞仪和western blot法检测发现,不同辐照剂量（0和8 Gy）下PVT1敲减后鼻咽癌细胞凋亡率升高,sh-Control组较sh-PVT1组细胞周期蛋白D1的增加、Bax水平的下降（P<0.05）,PVT1沉默降低了细胞周期蛋白D1的水平,增加了放疗后Bax在NPC细胞中的表达。综上所述,敲减PVT1在体外抑制NPC细胞的增殖和放疗抵抗,并诱导细胞凋亡。（3）通过star Base发现mi R-515-5p载有PVT1的靶位点,双荧光素酶报告基因和RIP检测证实mi R-515-5p是PVT1的靶点。经q RT-PCR证实mi R-515-5p在体外受到NPC细胞中PVT1的负调控。（4）CCK8法检测结果提示,鼻咽癌细胞转染mi R-515-5p后增殖水平下降（P<0.05）,但转染mi R-515-5p+PVT1后的鼻咽癌细胞较mi R-515-5p组增殖增加（P<0.05）,PVT1的表达逆转mi R-515-5p对细胞增殖抑制。克隆形成实验及流式细胞仪检测同样提示,PVT1通过反向调控mi R-515-5p的作用,促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡。（5）经western blot检测发现,在鼻咽癌细胞水平,sh-PVT1组较对照组PIK3CA和p-AKT的蛋白质表达水平低（P<0.05）,PVT1的下调降低了PIK3CA和p-AKT的水平;转染sh-PVT1+Anti-Control组较sh-PVT1+Anti-mi R-515-5p组逆转了这种作用（P<0.05）。结果表明,通过与NPC细胞中mi R-515-5p相互作用,PVT1在体外诱导了AKT通路。（6）裸鼠异种移植瘤模型实验证实,敲减PVT1在体内通过与PIK3CA发生作用,抑制了肿瘤的生长。结论:（1）PIK3CA蛋白在鼻咽癌组织中高表达,并与鼻咽癌的不良预后相关,PIK3CA基因表达下调能抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;鼻咽癌中PIK3CA存在异常甲基化,且其甲基化水平高于鼻咽正常粘膜组织。（2）mi R-515-5p在体外靶向调控PIK3CA,并负性调节PIK3CA的表达。PIK3CA促进NPC细胞的增殖及放疗抵抗,抑制了NPC细胞的凋亡,而Mi R-515-5p逆转了PIK3CA的作用。（3）PVT1在NPC组织中高表达,并与NPC的不良预后相关。mi R-515-5p是PVT1的靶点,并且在体外受到NPC细胞中PVT1的负调控。PVT1通过与mi R-515-5p相互作用,促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡。在体外PVT1通过与NPC细胞中mi R-515-5p相互作用,诱导了AKT通路,促进鼻咽癌细胞增殖和放疗抵抗。敲减PVT1在体内通过与PIK3CA发生作用,抑制了肿瘤的生长。PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移,并诱导鼻咽癌细胞放疗抵抗,导致鼻咽癌预后不良,本研究为鼻咽癌的发病机制和个体化靶向治疗关键分子筛查提供了新的靶点和思路。
杨小进[9]（2020）在《长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究》文中研究表明目的:结直肠癌是世界范围内最常见的第三种肿瘤类型,也是全球癌症相关致死的第四大因素。结直肠癌对人类健康构成了极大的威胁。结直肠癌的发病机制仍不明确,普遍认为是环境因素和基因遗传共同长期作用的结果。研究显示KRAS等多种肿瘤致病基因的突变、P53等抑癌基因突变和表观遗传学修饰、信号通路调节异常、非编码RNA对基因表达的多层面调控等多种因素均与结直肠癌的发生发展相关。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是非编码RNA的主要类型,是一种至少包含200个核苷酸且不编码蛋白的RNA,通过基因表达调控在结直肠癌的许多生物学过程中发挥着重要作用。LncRNA-DANCR被证明在多种肿瘤中扮演原癌基因的作用,但其在结直肠癌中的生物学功能和机理不清楚。方法:我们依托所在医院收集了 20对结直肠癌旁正常组织和癌组织,以及84个包含病人5年生存期的结直肠癌组织,然后利用RNA-FISH对结直肠癌组织和癌旁组织中DANCR的表达情况进行了检测。在此基础上,我们依据DANCR的表达情况对DANCR与病人预后的相关性进行了统计分析。我们利用定量PCR对正常人结直肠上皮细胞和多株结直肠癌肿瘤细胞中DANCR的表达情况进行了检测,并利用RNA-FISH对DANCR在结直肠癌细胞中的分布情况进行了检测。为研究DANCR对结直肠癌细胞生长的调控作用,我们利用慢病毒介导的shRNA特异性的敲除SW480和HCT15细胞中DANCR的表达,然后在细胞水平利用CCK-8实验、克隆形成实验、流式凋亡检测和Hoechst染色对细胞的增殖能力、克隆形成和凋亡情况进行了检测。在动物水平的研究中,我们利用稳定敲除DANCR的SW480和HCT15细胞分别建立了皮下移植瘤模型,然后绘制肿瘤生长曲线,统计肿瘤重量。在明确DANCR促进结直肠癌生长的作用的基础上,我们利用western blotting对稳定敲除DANCR的SW480和 HCT15 细胞中 Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、p53、cyto C、Bcl-2 和 Bcl-xL 的表达情况进行了检测;并利用免疫组化染色对SW480和HCT15皮下移植瘤组织中Caspase 3、p53和cyto C的表达情况进行了检测。结果:1)DANCR在结直肠癌组织中高表达,且与病人预后负相关:在对20对结直肠癌组织和癌旁正常组织的RNA-FISH染色结果表明DANCR在结直肠癌组织中显着高表达;DANCR在结直肠癌肿瘤细胞中高表达,且主要表达在细胞浆中;进一步的生存期分析表明DANCR高表达的结直肠癌病人常伴随更差的5年生存期。2)敲除DANCR通过促进细胞凋亡发生抑制结直肠癌细胞生长:利用慢病毒介导的shDANCR稳定感染SW480和HCT15细胞能显着抑制SW480和HCT15细胞中DANCR的表达;稳定敲除DANCR的表达在细胞水平上能显着抑制结直肠癌增殖和克隆形成,促进结直肠癌细胞凋亡发生;稳定敲除DANCR的表达在动物水平能通过促进结直肠癌皮下移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡的发生抑制结直肠癌细胞皮下移植瘤的生长。3)敲除DANCR促进线粒体相关凋亡蛋白和p53蛋白的表达:敲除DANCR促进 SW480 和 HCT15 细胞中 Caspase 3、Caspase 8 和 Caspase 9 蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多Caspase 3阳性的细胞;敲除DANCR促进SW480和HCT15细胞中p53蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多p53阳性的细胞;敲除DANCR促进SW480和HCT15细胞中Cyto C蛋白的表达,同时抑制Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表达,DANCR敲除的SW480和HCT15皮下移植瘤肿瘤组织中有更多Cyto C 阳性的细胞。结论:DANCR在结直肠癌组织中高表达,其表达情况与结直肠癌病人的良好预后呈显着负相关。DANCR主要定位于结直肠癌细胞的胞浆中,敲除DANCR的表达能通过促进线粒体相关凋亡的发生来抑制结直肠癌细胞的生长。以上研究表明DANCR是一个结直肠癌治疗和预后的潜在靶点。
沈二栋[10]（2020）在《MiR-93-5p靶向调控AHNAK介导Wnt信号通路对胃癌上皮间质转化的影响》文中进行了进一步梳理目的:胃癌（gastric cancer）是最常见的消化道肿瘤之一,其发病率在世界范围内排第4,死亡率排癌症死因的第2位。在我国,胃癌也严重威胁着人们的健康,给人们造成严重的经济负担,根据2015年全国肿瘤登记中心发布的数据,我国胃癌发病人数约为67.9万,死亡人数约为49.8万,其发病率和死亡率都仅次于肺癌而位居第二。因此,胃癌的防控仍是我国面临的一个重大的卫生问题。微小RNA（MicroRNA,miRNA）是一种内源性的单链非编码RNA,类似于s iRNA的小RNA分子,由高等真核生物基因组编码、非编码蛋白,存在于大多数真核生物中,长度大约为22个核苷酸RNA片段,通过核酸序列的互补性结合到特定的靶mRNA上,miRNA主要通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区或者编码序列的互补序列特异性结合而识别靶标,并通过RNA诱导沉默复合物来降解靶mRNA或者抑制翻译过程,从而达到调控基因表达的目的。Mi R-93-5p位于染色体11q22.1,该基因常作为致癌因素,参与了多种肿瘤的发生发展过程。已有研究表明,miR-93-5p在恶性肿瘤中作为癌基因直接靶向调控AHNAK促进肿瘤的发生发展。基于此,本论文拟研究miR-93-5p在胃癌中的表达情况并探索miR-93-5p靶向调控AHNAK介导Wnt信号通路影响胃癌的上皮间质转化的作用机制。研究方法:1、利用GEO数据库,检索获取胃癌相关miRNA及mRNA表达芯片,并进行差异分析。对差异miRNA取交集,确认后续研究对象。进一步利用TargetScan数据库对miRNA靶基因进行预测,并将预测结果与mRNA表达芯片分析结果取交集,确认后续研究基因。2、收集2012年1月到2013年12月的胃癌患者95例癌组织和癌旁组织,qRTPCR检测组织中miR-93-5p的表达情况,结合临床资料,采用Kaplan-Meier法进行总体生存期（overall survival,OS）和无病生存期（disease-free survival,DFS）分析。3、生信分析和荧光素双报告基因系统验证miR-93-5p与AHNAK的靶向关系,T ranswell实验检测迁移和侵袭,细胞形态观察miR-93-5p对胃癌细胞上皮间质转化的影响。Western blot检测胃癌细胞中AHNAK、wnt-1、β-catenin、p-β-catenin、Kremen、Axin2、LRP5和LRP6及EMT相关因子E-cadherin、Vimentin和Snail的变化。4、免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin和Snail表达,TOP/FOP荧光素酶实验检测AHNAK是否可以与β-catenin的结合。结果:1、对胃癌miRNA表达芯片分析结果取交集,确认后续研究对象为miR-93-5p。2、对该miRNA在Target Scan数据库的预测结果与mRNA表达芯片中显着下调的基因进行Venn分析,最终获得2个潜在靶基因。进一步对两个基因进行分析,发现AHNAK在胃癌中的表达水平显着下调。胃癌组织中miR-93-5p高表达,并且与患者的OS和DFS生存期差相关。3、生信网站预测与荧光素双报告基因实验验证AHNAK是miR-93-5p的直接靶基因,抑制miR-93-5p可上调AHNAK的表达。迁移侵袭实验表明,下调miR-93-5p和过表达AHNAK均能够抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力;而过表达AHNAK则可以逆转miR-93-5p对胃癌细胞的迁移和侵袭能力的增强。4、MiR-93-5p调控AHNAK促进胃癌细胞的上皮间质转化。MiR-93-5p通过靶向抑制AHNAK调控Wnt信号通路。结论:本研究发现miR-93-5p可能通过靶向抑制AHNAK,进而激活Wnt信号通路,提高胃癌细胞增殖和迁移能力,并促进上皮间质转化。MiR-93-5p在胃癌中充当促癌因子的角色,而AHNAK在胃癌中发挥抑癌因子作用,它们可能是今后胃癌诊治的重要分子靶标。
二、鼻咽癌、胃癌中抑癌基因ING1的突变检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼻咽癌、胃癌中抑癌基因ING1的突变检测（论文提纲范文）
（1）1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 |
| 导论 |
| 1. 膀胱癌概述 |
| 2. 基因拷贝数变异的生物学意义 |
| 3. 基因拷贝数变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. 膀胱癌中的基因拷贝数异常 |
| 5. 问题与展望 |
| 6. 本项研究的目的和基本策略 |
| 结果 |
| 第一节 本研究入组病例及其临床病理特征 |
| 1. 膀胱癌肿瘤组织病例 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织病例的临床病理特征 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织病例随访情况 |
| 2. 膀胱癌尿样本 |
| 2.1 膀胱癌尿样本病例的临床病理特征 |
| 2.2 膀胱癌尿样本病例随访情况 |
| 第二节 膀胱癌组织中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织中的DNA拷贝数异常 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. DNA拷贝数异常与患者预后的相关性分析 |
| 2.1 DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 2.2 DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3. 基于临床病理风险因素与DNA拷贝数异常的预后预测模型 |
| 3.1 Cox风险比例回归分析影响膀胱癌患者无瘤生存期的独立预后因素 |
| 3.2 基于膀胱癌独立预后因素构建预后预测模型 |
| 3.2.1 构建非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.2 构建肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.3 高风险非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测 |
| 第三节 基于Real-time PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 2.1 术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的关系 |
| 2.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发的相关性 |
| 2.3 构建非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发预测模型 |
| 第四节 基于3D数字PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 3D数字PCR与real-time PCR对尿液中拷贝数变异分子的检测效能比较 |
| 2.1 受试者工作曲线分析比较两者检测效能 |
| 2.2 构建基于3D数字PCR的术前尿样本诊断模型 |
| 3. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 3.1 尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3.2 尿样本中DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 讨论 |
| 1. 膀胱癌相关分子标志物研究的策略 |
| 2. 组织中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 3. 尿液中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 4. 3D数字PCR在膀胱癌患者尿液检测中的应用 |
| 5. CEP63、FOSL2及PAQR6的异常改变与肿瘤的关系 |
| 6. 本项研究的局限性 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、研究病例和实验材料 |
| 1. 膀胱癌患者及其生物学样品 |
| 2. 生物样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 3. 实时荧光定量PCR |
| 4. 3D数字PCR |
| 5. 引物序列 |
| 6. 主要仪器和设备 |
| 7. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 尿沉渣DNA提取 |
| 2. 实时荧光定量PCR |
| 3. 扩增产物质量检测 |
| 4. 引物扩增标准曲线 |
| 5. 3D数字PCR |
| 6. 统计学方法 |
| 第二章 EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义 |
| 导论 |
| 1. EB病毒概述 |
| 2. EB病毒相关的上皮性恶性肿瘤 |
| 3. EB病毒编码基因及其变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. EB病毒编码的小RNA与恶性肿瘤的关系 |
| 5. 本项研究的目的和策略 |
| 结果 |
| 第一节 EB病毒编码的miRNA在胃癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、EB病毒相关胃癌中病毒及宿主miRNA的表达 |
| 1. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.1 miRNA芯片质量控制 |
| 1.2 EB病毒相关胃癌肿瘤组织中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌细胞系中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.4 EB病毒相关胃癌中高表达的病毒miRNA |
| 1.5 探索EB病毒相关胃癌中高表达病毒miRNA的靶基因及其功能 |
| 2. EB病毒相关胃癌中宿主miRNA的表达 |
| 2.1 EB病毒相关胃癌组织中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.2 EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.3 EB病毒相关胃癌中与病毒有关的宿主miRNA |
| 3. EB病毒编码的miRNA与宿主miRNA的相关性分析 |
| 3.1 探索EB编码的miRNA与宿主细胞miRNA表达的相关性 |
| 3.2 探索与EB病毒miRNA与相关宿主miRNA结构的相关性 |
| 3.3 探索与EB病毒相关的宿主miRNA的靶基因及其功能 |
| 三、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA对宿主基因表达的影响 |
| 1. EB病毒相关胃癌中差异表达的宿主基因 |
| 1.1 转录组测序EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.2 公共数据库中EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌与EB病毒阴性胃癌中宿主基因的差异表达 |
| 2. 差异表达的宿主基因与病毒miRNA的相关性 |
| 2.1 从差异表达的宿主基因中筛选病毒与宿主miRNA的共同靶基因 |
| 2.2 病毒与宿主miRNA共同靶基因KEGG信号通路富集 |
| 四、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART1-3p和miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. EB病毒miRNA对胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞增殖能力的影响 |
| 3. EB病毒miRNA对胃癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞周期的影响 |
| 4. EB病毒miRNA对胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞迁移能力的影响 |
| 第二节 EB病毒编码的miRNA在鼻咽癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、鼻咽癌中EB病毒miRNA的表达 |
| 三、鼻咽癌中EB病毒miR-BART7-3p的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 3. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 4. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 讨论 |
| 1. 临床相关研究质量控制 |
| 2. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的研究 |
| 3. 本项研究中病毒miRNA在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义 |
| 4. 鼻咽癌中病毒miRNA的研究 |
| 5. 本项研究中病毒miRNA在鼻咽癌中的表达及其意义 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. EB病毒相关胃癌患者及其生物学样品 |
| 2. 鼻咽癌相关患者及其生物学样品 |
| 3. 临床样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 4. 主要试剂盒 |
| 5. 实时定量荧光PCR试剂 |
| 6. 细胞培养和miRNA转染 |
| 7. 常用试剂配制 |
| 8. 细胞培养用主要器皿 |
| 9. 主要仪器 |
| 10. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 基因表达谱芯片技术 |
| 2. 芯片数据读取 |
| 3. 芯片数据预处理和标准化 |
| 4. 第二代测序 |
| 5. miRNA实时定量荧光PCR |
| 6. 总RNA样品的提取、制备及质量鉴定 |
| 7. 细胞生物学实验方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（2）ING3在乳腺癌中的表达及功能研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ING3在恶性肿瘤研究中的新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）第一部分：AHR介导黄曲霉毒素B1在肝细胞癌中的毒性研究 第二部分：靶向测序对多种EBV感染相关恶性肿瘤中EBV整合位点分析研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 第一部分: AHR介导黄曲霉毒素B1在肝细胞癌中的毒性研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验试剂及设备 |
| 3.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. AHR是AFB1在肝癌细胞中发挥毒性的关键分子 |
| 2. AHR的缺失提高了肝癌细胞对AFB1的耐受能力 |
| 3. AFB1增加了由AHR活性诱导的长链脂肪酸的积累 |
| 4. AFB1可以提高AHR及其下游基因的表达水平 |
| 5. AFB1诱导了AHR蛋白的入核且可以与AHR蛋白的N端结合 |
| 6. AHR在黄曲霉相关肝癌中高表达 |
| 7. AHR的激活可以增加抗PD-L1治疗效果 |
| 讨论 |
| 第二部分: 靶向测序对多种EBV感染相关恶性肿瘤中EBV整合位点分析研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验试剂及设备 |
| 3.实验流程及方法 |
| 实验结果 |
| 1. EBV整合位点在人基因组中的分布情况 |
| 2. EBV整合位点常分布于肿瘤抑癌基因和炎症相关基因附近 |
| 3. EBV整合对CDK15,TNFAIP3和PARK2基因表达的影响 |
| 4. EBV整合位点在EBV基因组中的分布情况 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 芳香烃受体在肿瘤发生发展中的研究 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（4）双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.1.1 胃癌的治疗现状 |
| 1.1.2 应激反应与Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中的作用 |
| 1.2 双硫仑的研究进展 |
| 1.2.1 双硫仑的抗肿瘤作用 |
| 1.2.2 双硫仑联合铜的抗肿瘤作用 |
| 1.3 本文的研究内容与目标 |
| 第二章 双硫仑联合铜对人胃癌细胞的体外作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验药物 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 实验相关抗体 |
| 2.1.7 相关液体的配置及保存方式 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 CCK-8细胞增殖(活力)检测 |
| 2.2.3 细胞克隆形成检测 |
| 2.2.4 细胞划痕实验 |
| 2.2.5 细胞Transwell迁移实验 |
| 2.2.6 细胞凋亡检测 |
| 2.2.7 细胞自噬检测 |
| 2.2.8 活性氧的检测 |
| 2.2.9 免疫印迹法检测凋亡、自噬、DNA损伤修复及Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达 |
| 2.2.10 糖酵解和线粒体呼吸的检测 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 双硫仑联合铜对胃癌细胞增殖活性的作用 |
| 2.3.2 双硫仑联合铜抑制胃癌细胞克隆形成 |
| 2.3.3 双硫仑联合铜对胃癌细胞划痕愈合能力的作用 |
| 2.3.4 双硫仑联合铜对胃癌细胞中的侵袭效应 |
| 2.3.5 双硫仑联合铜对胃癌细胞凋亡效应的调控 |
| 2.3.6 双硫仑联合铜对胃癌细胞自噬的影响 |
| 2.3.7 双硫仑联合铜对胃癌细胞氧化应激和DNA损伤的影响 |
| 2.3.8 双硫仑联合铜对胃癌细胞能量代谢的影响 |
| 2.3.9 双硫仑联合铜对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 2.4 实验小结 |
| 第三章 双硫仑联合铜对人胃癌细胞的体内作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验相关仪器 |
| 3.1.4 实验相关抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胃癌皮下移植瘤的建立及药物干预 |
| 3.2.2 苏木精-伊红染色 |
| 3.2.3 Tunel染色 |
| 3.2.4 免疫组化染色 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 双硫仑联合铜对胃癌皮下移植瘤的生长抑制效应 |
| 3.3.2 双硫仑联合铜对胃癌皮下移植瘤凋亡和自噬效应 |
| 3.3.3 双硫仑联合铜对裸鼠胃癌皮下移植瘤中应激反应与Wnt/β-catenin通路的影响 |
| 3.4 实验小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附 缩略词简表 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）miR-148a-3P在HeLa源性宫颈癌干性维持中的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 文献回顾 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新性及不足 |
| 参考文献 |
| 综述 Mir-148a在癌症中的研究进展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（6）EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 EBV相关性胃癌差异表达基因分析 |
| 2.2 EBV相关性胃癌差异表达蛋白筛选分析 |
| 2.2.1 样品准备 |
| 2.2.2 胃癌组织EBV原位杂交检测 |
| 2.2.3 EBVaGC定量蛋白质组学检测 |
| 2.2.4 蛋白组学数据分析 |
| 2.2.5 免疫组化检测蛋白表达 |
| 2.3 EBV相关性胃癌临床病理参数分析 |
| 2.4 胃癌及癌前疾病血清EBV抗体表达分析 |
| 2.4.1 血清EBV抗体的筛选 |
| 2.4.2 胃癌及癌前疾病血清EBV-VCA IgG抗体表达分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EBV相关性胃癌关联基因表达特征 |
| 3.2 EBV相关性胃癌关联蛋白表达特征 |
| 3.2.1 EBVaGC研究对象的确定 |
| 3.2.2 EBVaGC蛋白质谱特征 |
| 3.2.3 EBVaGC中转录组和蛋白组交集蛋白的筛选验证 |
| 3.3 EBV相关性胃癌临床病理特征 |
| 3.4 血清EBV抗体表达与胃癌风险/预后的相关性 |
| 3.4.1 研究对象的基本信息 |
| 3.4.2 血清EBV-VCA IgG抗体人群分布特征 |
| 3.4.3 血清EBV-VCA IgG与胃癌及萎缩性胃炎发病风险的关系 |
| 3.4.4 血清 EBV-VCA IgG与血清 HP-IgG的关系 |
| 3.4.5 血清EBV-VCA IgG与胃癌临床病理参数的关系 |
| 3.4.6 血清EBV-VCA IgG与胃癌预后的关系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EBVaGC关联基因表达特征及功能分析 |
| 4.2 EBVaGC关联蛋白表达特征及功能分析 |
| 4.3 EBVaGC临床病理特征 |
| 4.4 血清EBV-VCA IgG抗体与胃癌发病风险与预后的关系 |
| 4.4.1 血清EBV-VCA IgG抗体人群分布特征 |
| 4.4.2 血清EBV-VCA IgG与胃癌及萎缩性胃炎发病风险的关系 |
| 4.4.3 血清 EBV-VCA IgG与血清 HP-IgG的关系 |
| 4.4.4 血清EBV-VCA IgG与胃癌临床病理参数及预后的关系 |
| 5 结论 |
| 第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料和设备 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 GBP5原位表达与胃癌风险/病理参数/预后的相关性研究 |
| 2.2.1 免疫组化检测 |
| 2.3 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞生物学行为的影响研究 |
| 2.3.1 质粒构建 |
| 2.3.2 摇菌和质粒提取 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 瞬时转染 |
| 2.3.5 细胞总RNA提取及反转录cDNA |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.3.7 细胞增殖活性检测 |
| 2.4 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响研究 |
| 2.4.1 EBVaGC关联免疫相关基因的确定 |
| 2.4.2 EBVaGC与GBP5表达相关的免疫基因的确定 |
| 2.4.3 验证EBVaGC免疫相关基因差异表达 |
| 2.5 GBP5表达与EBVaGC调控网络的关联分析 |
| 2.5.1 EBVaGC中GBP5蛋白互作网络构建 |
| 2.5.2 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的关联分析 |
| 2.5.3 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性 |
| 3.2 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 3.2.1 GBP5在胃癌细胞中的过表达和沉默效率 |
| 3.2.2 GBP5表达对EBVaGC细胞增殖活性的影响 |
| 3.3 GBP5影响不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因的表达 |
| 3.3.1 确定EBVaGC中差异表达免疫相关基因 |
| 3.3.2 EBVaGC中GBP5与免疫相关基因表达的相关性 |
| 3.3.3 EBVaGC中GBP5与免疫相关基因相关性验证 |
| 3.4 GBP5表达与EBVaGC调控网络的关联分析 |
| 3.4.1 EBVaGC中GBP5蛋白互作网络 |
| 3.4.2 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的关联 |
| 3.4.3 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 EBV感染与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）新型UBE2T抑制剂通过阻止RACK1泛素化抑制Wnt/β-catenin信号通路激活及胃癌生长（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略语对照 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 Wnt/β-catenin信号通路异常激活及抑制剂在胃癌中的作用 |
| 1.研究材料和方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 经典Wnt/β-catenin信号通路异常激活参与胃癌的发生发展 |
| 2.2 目前临床前或临床研究中Wnt抑制剂对胃癌的作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin破坏复合物组分胃癌新靶点的筛选及验证 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 Wnt/β-catenin信号通路中β-Catenin破坏复合物关键组分在胃癌中的作用 |
| 2.2 β-Catenin破坏复合物稳定蛋白RACK1与β-Catenin表达水平相关性 |
| 2.3 敲除RACK1 促进胃癌细胞生长增殖能力 |
| 2.4 胃癌中β-Catenin破坏复合物关键调控成分RACK1 的降解途径 |
| 2.5 UBE2T与RACK1相互作用并介导RACK1泛素化修饰 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 UBE2T通过泛素化降解RACK1 激活Wnt/β-catenin信号通路的机制研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 泛素结合酶UBE2T介导RACK1 的泛素化降解不依赖泛素连接酶E3 |
| 2.2 RACK1 泛素化的具体赖氨酸位点鉴定 |
| 2.3 基于UBE2T-RACK1-β-catenin轴激活Wnt/β-catenin信号通路 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 泛素结合酶UBE2T在胃癌中的表达及对胃癌细胞功能的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 生物信息数据库中UBE2T在胃癌组织及多种癌症中的表达情况 |
| 2.2 UBE2T在胃癌临床样本中表达情况及与临床病理、患者生存预后的相关性 |
| 2.3 CRISPR/Cas9 技术敲除UBE2T抑制胃癌细胞增殖能力 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 UBE2T抑制剂的筛选及其对胃癌细胞生长增殖的抑制作用 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 泛素结合酶UBE2T小分子抑制剂的筛选 |
| 2.2 UBE2T小分子抑制剂M435-1279 通过阻碍β-catenin入核而抑制胃癌进展 |
| 2.3 小分子抑制剂M435-1279 对胃癌细胞生长及侵袭能力的影响 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述 人泛素偶联酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 PIK3CA基因表达模式及其对鼻咽癌发生发展和细胞生物学行为的作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计分析 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 miR-515-5p在 PIK3CA诱导的鼻咽癌细胞增殖、凋亡和放疗抵抗中作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 使用试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 NPC细胞中PVT1/miR-515-5p-PIK3CA轴调控机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学处理 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 PIK3CA 基因与头颈部肿瘤发病相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（9）长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料及主要试剂 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.3.2 慢病毒制备及感染细胞 |
| 2.3.3 RNA提取 |
| 2.3.4 RNA的质量检测 |
| 2.3.5 定量PCR实验 |
| 2.3.6 蛋白提取 |
| 2.3.7 BCA蛋白定量 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.3.9 细胞增殖活性检测 |
| 2.3.10 细胞克隆形成实验 |
| 2.3.11 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.12 Hoechst染色检测细胞凋亡 |
| 2.3.13 皮下移植瘤实验 |
| 2.3.14 TUNEL实验 |
| 2.3.15 免疫组化实验 |
| 2.3.16 FISH染色(细胞爬片) |
| 2.3.17 FISH染色(结直肠癌组织) |
| 2.3.18 siRNA瞬时转染 |
| 2.3.19 质粒瞬时转染 |
| 2.3.20 统计分析 |
| 实验结果 |
| lncRNA-DANCR在结直肠癌中高表达 |
| lncRNA-DANCR表达情况与结直肠癌进展相关 |
| lncRNA-DANCR在结直肠癌细胞中高表达,定位于胞浆中 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌细胞生长 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞凋亡的发生 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制结直肠癌皮下移植瘤生长 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤中细胞凋亡发生 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞中Caspase凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤组织中Caspase凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌细胞中p53蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达促进结直肠癌皮下移植瘤组织中p53蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达抑制调控结直肠癌细胞中线粒体相关凋亡蛋白表达 |
| 敲除lncRNA-DANCR表达调控结直肠癌皮下移植瘤组织中线粒体相关凋亡蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结直肠癌相关长链非编码RNA研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论文 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
（10）MiR-93-5p靶向调控AHNAK介导Wnt信号通路对胃癌上皮间质转化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分:MiR-93-5p在胃癌组织中的表达及其生物学功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 GEO数据库芯片数据分析 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 细胞株 |
| 2.4 主要试剂 |
| 2.5 主要仪器 |
| 2.6 主要溶液的配制 |
| 2.7 实验方法 |
| 2.7.1 qRT-PCR法检测miR-93-5p基因的表达 |
| 2.7.2 MiRNAs表达水平的结果判定 |
| 2.7.3 细胞复苏、培养及冻存 |
| 2.7.4 细胞转染 |
| 2.7.5 Transwell实验 |
| 2.7.6 胃癌细胞上皮间质转化形态观察 |
| 2.7.7 免疫荧光实验 |
| 2.7.8 Western blot检测细胞中蛋白的表达 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 胃癌相关miRNAs筛选 |
| 3.2 胃癌组织及胃癌细胞系中miR-93-5p表达上调 |
| 3.3 下调miR-93-5p抑制HGC-27 细胞迁移、侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:MiR-93-5p靶向AHNAK调控胃癌上皮间质转化的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及耗材 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 胃癌相关mRNA预测 |
| 2.2.3 预测miR-93-5p的靶基因预测 |
| 2.2.4 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.5 质粒提取 |
| 2.2.6 Western blot检测不同细胞系中靶基因的蛋白表达水平 |
| 2.2.7 Western blot检测HGC-27 细胞中靶基因的蛋白表达水平 |
| 2.2.8 Transwell实验检测细胞迁移能力 |
| 2.2.9 TOP/FOP荧光素酶实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 AHNAK是 miR-93-5p的靶基因 |
| 3.2 MiR-93-5p通过调控AHNAK促进HGC-27 细胞的上皮间质转化 |
| 3.3 MiR-93-5p靶向抑制AHNAK调控Wnt信号通路 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、鼻咽癌、胃癌中抑癌基因ING1的突变检测（论文参考文献）
- [1]1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义[D]. 蔡曌. 北京协和医学院, 2021
- [2]ING3在乳腺癌中的表达及功能研究[D]. 李回梦. 昆明医科大学, 2021(01)
- [3]第一部分：AHR介导黄曲霉毒素B1在肝细胞癌中的毒性研究 第二部分：靶向测序对多种EBV感染相关恶性肿瘤中EBV整合位点分析研究[D]. 朱青. 北京协和医学院, 2021
- [4]双硫仑联合铜通过调控应激反应与Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞生长[D]. 王玲. 兰州大学, 2021(09)
- [5]miR-148a-3P在HeLa源性宫颈癌干性维持中的作用[D]. 黄伦. 广州医科大学, 2021(02)
- [6]EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究[D]. 王泽洋. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]新型UBE2T抑制剂通过阻止RACK1泛素化抑制Wnt/β-catenin信号通路激活及胃癌生长[D]. 俞泽元. 兰州大学, 2021(09)
- [8]PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究[D]. 韩艳艳. 新疆医科大学, 2020(03)
- [9]长链非编码RNA-DANCR促进结直肠癌生长的作用及机制研究[D]. 杨小进. 苏州大学, 2020(06)
- [10]MiR-93-5p靶向调控AHNAK介导Wnt信号通路对胃癌上皮间质转化的影响[D]. 沈二栋. 中国医科大学, 2020(01)