一、转化生长因子抑制视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究（论文文献综述）
张阳[1]（2021）在《姜黄素、白花丹醌、藏红花酸对增殖性玻璃体视网膜病变抗增殖的效果比较及机制研究》文中认为增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是一种严重威胁视力的常见眼病,发生在5-10%的孔源性视网膜脱离患者中。该疾病的特征是视网膜前膜和/或视网膜下膜的形成,这可能会扭曲视网膜组织结构并导致再脱离。视网膜色素上皮（RPE）细胞的增殖是PVR发生的始动环节。视网膜前膜形成过程类似于RPE细胞增殖的伤口愈合反应,该细胞经历上皮-间质转化并进行迁移。PVR增殖膜形成的触发因素被认为与损伤导致的血视网膜屏障紧密连接的损害和生长因子、趋化介质和炎症细胞因子的释放有关。视网膜裂孔和脱离区域可能导致液体从玻璃体渗漏到视网膜下间隙,并为RPE细胞迁移到视网膜内表面创造了条件。在众多生长因子中,成纤维细胞生长因子2（FGF-2）在玻璃体视网膜界面的增殖过程中起重要作用,刺激RPE细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞的迁移和增殖,并可诱导实验性PVR。因此,我们使用FGF-2来诱导ARPE-19细胞和体内造模,更接近PVR的病理环境。目前,临床上尚无批准的药物治疗PVR,主要治疗方法仍是手术。手术治疗包括去除纤维膜,在某些病例中切除部分视网膜。治疗或预防PVR形成的药物可能会提高视网膜脱离后的手术成功率和保护视力。某些药物作用于PVR病理过程中的不同过程（包括细胞增殖、迁移和收缩）,将成为治疗或预防PVR形成的有潜力的治疗方法。我们团队曾对姜黄素、白花丹醌和藏红花酸分别进行了体内和体外实验研究,研究显示这三种药物对PVR均有抑制作用,且副作用小。为了找到高效安全的药物,本课题比较了这三种药物的作用效果并对最佳药物的作用机制进行研究,为防治PVR提供了新思路。第一部分姜黄素、白花丹醌、藏红花酸对FGF-2诱导的体外人视网膜色素上皮细胞增殖抑制的实验研究目的:本研究采用不同浓度的FGF-2作用于人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）,观察其促增殖作用强弱,选择最佳FGF-2浓度诱导ARPE-19细胞。研究姜黄素、白花丹醌和藏红花酸对FGF-2诱导的ARPE-19细胞增殖的抑制作用,评估最佳的抗增殖药物。方法:1.体外培养ARPE-19细胞,采用CCK-8法检测不同浓度FGF-2（1、5、10、20、40 ng/ml）在不同作用时间（24 h、48 h、72 h）对ARPE-19细胞增殖的影响。2.采用CCK-8法检测不同浓度的姜黄素（0、1、3、10、20、30、40、50、100μM）、白花丹醌（0、0.3、0.9、2.7、5、8、10μM）、藏红花酸（0、30、50、100、200、300、400、500μM）对FGF-2诱导的ARPE-19细胞作用24h后的增殖抑制影响,并比较药物作用效果强弱。结果:1.在24 h、48 h、72 h三个时间点中,各浓度FGF-2（1、5、10、20、40 ng/ml）均能诱导各组细胞增殖（P<0.05）,OD值均随孵育细胞时间的延长逐渐增高。在各时间点各浓度组中,10 ng/ml的FGF-2促增殖作用最强。2.比较各浓度的姜黄素、白花丹醌和藏红花酸对FGF-2诱导的ARPE-19细胞增殖抑制作用,CCK-8结果显示三种药物均能抑制细胞增殖（P<0.05）。其中,白花丹醌IC50值在三种药物中最小,提示其疗效最好,在低浓度时即显示出对细胞明显的抑制作用。结论:1.FGF-2作用于ARPE-19细胞的最佳浓度为10 ng/ml。2.不同浓度的姜黄素、白花丹醌、藏红花酸对FGF-2诱导的ARPE-19细胞均有抑制增殖作用。抑制细胞增殖效果最好的药物是白花丹醌。第二部分白花丹醌对FGF-2诱导的体外人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和侵袭抑制的实验研究目的:在第一部分发现白花丹醌抑制细胞增殖作用最强的基础上,进一步探讨白花丹醌对FGF-2诱导的ARPE-19细胞增殖、迁移、侵袭的影响及调控机制。方法:1.采用CCK-8法、EdU法检测ARPE-19细胞增殖。采用western blot检测不同浓度白花丹醌作用下ARPE-19细胞中PCNA蛋白含量变化情况。2.采用划痕实验和Transwell小室检测ARPE-19细胞迁移和侵袭。3.采用RT-PCR和western blot检测ARPE-19细胞MMP-2、MMP-9、Ⅰ型、Ⅳ型和Ⅵ型胶原的mRNA和蛋白的表达。4.采用western blot检测ARPE-19细胞FGFR-1/-2、ERK、p38和JNK的磷酸化情况。结果:1.采用CCK-8和EdU法检测了细胞的增殖情况。结果发现1.25和2.5μM白花丹醌对细胞活力没有显着影响,5和7.5μM白花丹醌则显着降低了细胞活力。EdU实验的结果显示FGF-2能促进ARPE-19细胞的增殖。采用western blot检测细胞PCNA蛋白的表达水平发现随着白花丹醌浓度的增加,PCNA蛋白表达水平逐渐减少（P<0.05）,呈剂量依赖性。因此,我们证明了白花丹醌能抑制FGF-2诱导的ARPE-19细胞增殖。2.采用细胞划痕实验和Transwell实验检测ARPE-19细胞迁移和侵袭。白花丹醌在细胞划痕实验中显着抑制了细胞迁移（P<0.05）。白花丹醌在Transwell实验中显着抑制了细胞侵袭（P<0.05）。3.采用RT-PCR和western blot检测了ARPE-19细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平。结果显示白花丹醌显着抑制了MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,呈剂量依赖性。采用RT-PCR和Western blotting评估FGF-2诱导的ARPE-19细胞中Ⅰ型、Ⅳ型和Ⅵ型胶原的表达水平。结果显示FGF-2可促进Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅵ型胶原的mRNA和蛋白表达（P<0.05）。白花丹醌对Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅵ型胶原mRNA和蛋白表达有剂量依赖性的抑制作用。4.采用RT-PCR和western blot检测了FGFR-1/-2、ERK、p38和JNK的磷酸化情况。结果表明FGFR-1和FGFR-2在FGF-2处理后细胞内磷酸化水平显着增加,而白花丹醌显着降低FGFR-1和FGFR-2磷酸化。FGF-2诱导ERK,p38和JNK的磷酸化水平显着提高。但是随着白花丹醌浓度的逐渐增加,ERK、p38和JNK的磷酸化水平显着下降（P<0.05）。结论:1.白花丹醌能抑制FGF-2诱导的ARPE-19细胞的增殖、迁移和侵袭。2.白花丹醌抑制ARPE-19细胞的增殖、迁移、侵袭的作用可能与抑制MMP-2/-9、Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅵ型胶原mRNA和蛋白表达有关。3.白花丹醌抑制ARPE-19细胞的增殖、迁移、侵袭的作用可能是通过抑制FGFR-1/-2、ERK、p38和JNK的磷酸化实现的。第三部分白花丹醌防治兔眼增殖性玻璃体视网膜病变的在体实验研究目的:本研究第二部分发现白花丹醌能抑制体外ARPE-19细胞的增殖迁移和侵袭。本部分实验我们采用FGF-2联合ARPE-19细胞对兔眼造模,进一步探讨白花丹醌对兔眼PVR发展是否有抑制作用。方法:1.将有色兔随机分成2组,各组5只。对照组兔眼玻璃体腔注射FGF-2（50 ng）、ARPE-19细胞和磷酸盐缓冲液（PBS）。实验组兔眼玻璃体腔注射FGF-2（50 ng）、ARPE-19细胞和白花丹醌。应用眼底照相、B超和OCT对造模前及造模后3、7、14、21、28天的兔眼进行检查。根据检查结果,依据Fastenberg分级划分各组兔眼PVR级别。2.在造模后的第28天,检查完毕后,取下兔眼组织,应用HE染色观察各组视网膜组织病理变化。应用免疫组织化学观察各组视网膜α-SMA的表达情况。结果:1.造模后第3天:对照组1只眼PVRⅠ级。实验组全部PVR 0级。造模后第7天:对照组1只眼PVRⅡ级,2只眼PVRⅠ级。实验组1只眼PVRⅠ级。造模后第14天:对照组2只眼PVRⅢ级,2只眼PVRⅡ级,1只眼PVRⅠ级。实验组1只眼PVRⅡ级,3只眼PVRⅠ级。造模后第21天:对照组2只眼PVRⅣ级,3只眼PVRⅢ级。实验组2只眼PVRⅡ级,2只眼PVRⅠ级。造模后第28天:对照组2只眼PVRⅤ级,3只眼PVRⅣ级。实验组2只眼PVRⅢ级,2只眼PVRⅡ级。对照组在造模后的第14天视网膜脱离的发生率为60%,第21天后视网膜脱离发生率为100%。实验组在造模后的第28天视网膜脱离的发生率为40%。2.HE染色见正常视网膜各层结构清晰,对照组视网膜神经节细胞层水肿,内外核层细胞排列紊乱,光感受器细胞外节丢失,实验组视网膜结构整齐,光感受器细胞外节也丢失。免疫组织化学染色中,α-SMA在正常组色素兔视网膜未见阳性染色,对照组视网膜可见强染的棕黄色,实验组视网膜可见弱染的浅棕色。结论:白花丹醌能抑制兔视网膜前膜的形成,延缓PVR的进展。
郝雨檬[2]（2021）在《华蟾素抑制人脐静脉血管内皮细胞血管生成的实验研究》文中研究说明目的:血管生成（Angiogenesis）是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管,一般包括内皮细胞移行、增殖及管道化分支形成血管环等步骤。在眼科中,源自于脉络膜毛细血管异常增殖的脉络膜新生血管（Choroidal neovascularization,CNV）是出现在许多眼底疾病中的病理过程,是视力丧失的重要原因。CNV的发病机制尚不明确,治疗上也存在许多问题。华蟾素为临床抗肿瘤药物,可抑制肿瘤细胞的增殖和血管生成。本研究拟以人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）为研究对象,在体外研究华蟾素对VEGF诱导的HUVECs的增殖、迁移及管腔形成的影响,为后续其应用于CNV的治疗研究中奠定基础。方法:根据所加入的华蟾素药物浓度的不同,依次将HUVECs细胞分为:对照组（仅含培养基）、VEGF组（仅加入50ng/ml VEGF）、VEGF+0.1μM华蟾素组（加入50ng/ml VEGF和0.1μM华蟾素）、VEGF+0.2μM华蟾素组（加入50ng/ml VEGF和0.2μM华蟾素）、VEGF+0.5μM华蟾素组（加入50ng/ml VEGF和0.5μM华蟾素）,通过CCK-8实验检测华蟾素对VEGF诱导的HUVECs活性的影响,通过Ed U实验检测华蟾素对VEGF诱导的HUVECs增殖的影响,划痕实验和Transwell实验两种方法来验证华蟾素对VEGF诱导的HUVECs迁移能力的影响,通过管腔形成实验分析华蟾素对VEGF诱导的HUVECs血管生成的影响。结果:1.VEGF组与对照组相比,细胞活性增加了6.82%,细胞增殖率增加了6.1%,细胞水平迁移率增加了11.05%,垂直迁移的细胞数增加了59.76%,形成的管的分支数量增加了1.24倍,形成的管的分支长度增加了0.67倍,差异均有统计学意义（P<0.05）;2.VEGF+0.1μM华蟾素组、VEGF+0.2μM华蟾素组、VEGF+0.5μM华蟾素组与VEGF组相比,细胞活性分别下降了16.34%、42.55%、57.45%,差异均有统计学意义（P=0.000,<0.001）,VEGF+0.1μM华蟾素组、VEGF+0.2μM华蟾素组与VEGF组相比细胞增殖率分别下降了:16.2%、19.48%,细胞水平迁移率分别下降了11.94%、19.04%,垂直迁移的细胞数下降了55.34%、68.32%,形成的管的分支数量减少了0.66倍、1.21倍,形成的管的分支长度减少了0.39倍、0.76倍,差异均有统计学意义（P<0.05）。可见华蟾素可以抑制VEGF诱导的HUVECs的增殖、迁移及管腔形成,且药物浓度越高,抑制作用越强。结论:1.华蟾素能有效抑制VEGF诱导的HUVECs的活性和增殖,且具有浓度依赖性。2.华蟾素能同时抑制VEGF诱导的HUVECs的水平和垂直迁移能力,抑制作用随药物浓度增加而增强。3.华蟾素能抑制VEGF诱导的HUVECs的管腔形成,同时抑制血管分支的长度和数量,药物浓度越高,抑制作用越强。4.华蟾素具有强效的抑制血管生成的作用,为后续其应用于CNV治疗的实验研究提供了可能性。
胡黎明[3]（2021）在《H2S保护视网膜色素上皮细胞氧化损伤的自噬和凋亡机制研究》文中研究说明年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人视力障碍和失明的主要原因。AMD的特征在于视网膜色素上皮（RPE）细胞功能异常。但是,AMD的发病机制仍不清楚,目前尚无有效的治疗方法。越来越多的证据表明,氧化应激和自噬在AMD的发展中起着至关重要的作用。H2S是一种有效的抗氧化剂,可以直接去除细胞内超氧阴离子和过氧化氢,并且相比于其他经典的抗氧化剂具有更高的清除效率。与此同时,作为小分子气体分子,H2S能够自由地扩散进入细胞。但作为良好的内源性抗氧化剂,其本身合成的胞内浓度较低,在体内很难达到较好的抗氧化效果。基于此背景,外源性H2S的补充能否提高RPE细胞的抗氧化能力,以及通过何种机制保护RPE细胞值得深入研究。材料方法:以视网膜色素上皮细胞ARPE-19为细胞模型,进行细胞生物学、分子生物学、生物物理学等实验研究。（1）MTT比色法检测ARPE-19细胞的增殖。（2）细胞形态学观察ARPE-19细胞的形态变化。（3）DCFH-DA单染法检测了细胞内活性氧水平。（4）Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平。（5）Hoechst 33342/PI双染法检测细胞死亡情况。（6）蛋白免疫印迹分析细胞内自噬标志蛋白LC3和P62的表达变化。（7）透射电子显微镜检测细胞内自噬体和自噬溶酶体形成及改变。（8）融合蛋白m Cherry-EGFP-LC3B腺病毒转染ARPE-19细胞测定细胞内自噬体形成和自噬流变化。实验结果:H2O2诱导ARPE-19细胞氧化损伤模型:（1）外源性H2S缓解H2O2诱导的ARPE-19细胞增殖抑制。（2）在显微镜下明显观测到外源性H2S改善了H2O2诱导的ARPE-19细胞形态损伤。（3）外源性H2S降低ARPE-19细胞内活性氧水平,减少H2O2诱导的细胞氧化损伤。（4）外源性H2S降低氧化应激所诱导的细胞凋亡/死亡。（5）H2O2诱导细胞自噬的发生,而外源性H2S能够降低ARPE-19细胞内自噬流。（6）自噬抑制剂降低细胞内自噬水平缓解H2O2导致的细胞增殖抑制。（7）自噬抑制后H2O2诱导的细胞形态损伤有所改善。（8）自噬抑制通过降低H2O2诱导的细胞凋亡/死亡发挥保护作用。在UV辐照诱导的ARPE-19细胞氧化损伤模型中得到了类似的证据:（1）外源性H2S降低了UV辐照诱导的细胞增殖抑制。（2）外源性H2S通过减少细胞内活性氧水平缓解了UV辐照诱导的细胞氧化损伤。（3）外源性H2S通过降低UV辐照诱导的细胞凋亡/死亡保护细胞。（4）UV辐照诱导的细胞内自噬流水平增加被外源性H2S降低。（5）细胞内自噬水平被自噬抑制剂降低后,能够缓解UV辐照诱导的细胞增殖抑制。（6）自噬抑制能够减少UV辐照诱导的细胞凋亡/死亡。结论:外源性H2S缓解了氧化应激导致的视网膜色素上皮ARPE-19细胞的增殖抑制,改善了细胞形态损伤,降低了细胞凋亡/死亡,也降低了细胞自噬水平。自噬抑制后,细胞增殖抑制和细胞凋亡得到了显着的恢复。因此,本研究证明了H2S在RPE细胞中的抗氧化作用以及自噬参与的抗氧化机制。这些发现表明自噬在AMD的发展中可能起关键作用,外源性H2S在治疗AMD中具有潜在的价值。
席晓婷[4]（2020）在《miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制糖尿病视网膜病变的作用机制研究》文中认为[背景]糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy,DR）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）的微血管并发症,是导致我国工作年龄人群失明的主要原因,且其发病率还在不断上升,给人类健康和生活质量带来严重威胁。DR的发生和发展是一个错综复杂的过程,受多因素、多基因、多分子通路的影响,其具体机制尚未完全清楚。目前的研究发现,DR可能与多元醇的代谢通路异常、蛋白质非酶糖基化产物的堆积、蛋白激酶C（PKC）的活化、血管紧张素转换酶系统的作用有关,在这些传统通路的上游途径又发现了共同启动因子活性氧（Reactive oxygen species,ROS）。据报道,在DR发病机制的上游,高血糖作为起始因素导致ROS合成增加,ROS又作为一个共同启动因子瀑布式启动相关致病分子通路,而各种通路的激活又可正反馈调节ROS的合成,导致ROS合成增加,这种逐步放大的形式则导致了 DR的发生发展。因此,高糖导致的ROS合成增加是DR发病的中心环节,阻断这一中心环节可以阻断DR的发生和病理进程。视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelial,RPE）细胞由单层紧密连接的六边形细胞组成,构成了血-视网膜外屏障。RPE细胞特殊的解剖位置和功能使其易受到血糖波动的影响,发生病理和功能的改变。在DR早期,高血糖影响RPE细胞结构,损害血-视网膜外屏障,导致RPE细胞死亡、患者视力丧失。同样,高糖可以导致RPE细胞分泌异常,视网膜血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）增多,血管渗透性增加,微血管瘤和视网膜新生血管形成,最终形成DR。DR的RPE细胞损害与早期糖尿病患者的视功能下降密切相关,探究其中的具体机制有助于DR的早期诊断及治疗。细胞焦亡（pyroptosis）又称细胞炎性坏死,是由gasdermin介导的细胞程序性坏死,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。有研究发现,ROS可以诱导细胞焦亡,导致细胞膜孔隙形成、膜破裂以及IL-1β和IL-18的释放。此外,细胞焦亡标志蛋白NOD样受体家族蛋白3（NOD-like receptors,NLRP3）、cleaved-caspase-1 及 IL-1β已被报道在链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导的大鼠视网膜、糖尿病性增生性视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）患者的玻璃体中表达增加。这表明,焦亡对于DR的发展尤为重要,可能是导致视网膜细胞死亡和视网膜功能丧失的重要因素,研究DR中ROS诱导的细胞焦亡有助于帮助我们更深入的理解DR发病机制,甚至能帮助我们找到防治DR的新突破点。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的、进化高度保守的小分子非编码RNA,广泛表达于人体多种细胞,可通过介导mRNA降解和/或翻译抑制在转录后水平上负调控基因的表达,以此参与细胞增殖、分化、侵袭、迁移、凋亡、胰岛素分泌、器官形成、造血等生物学过程的调控。miR-130a已被证实在细胞增殖、凋亡、ROS产生和细胞焦亡的过程中起着重要的调控作用,但其在DR中的作用还尚未被报道。据文献报道,TNF-α/SOD1/ROS信号通路是高糖处理的MPC5足细胞中miR-130a的下游靶标,且TNF-α和SOD1均被证实参与细胞焦亡、氧化应激等过程。因此,miR-130a可能会通过调控TNF-α/SOD1/ROS信号通路来调节视网膜细胞焦亡过程,进而调节DR发展进程。基于以上背景,本研究将采用CCK-8、RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、平板克隆形成实验、DHE染色、双荧光素酶报告基因系统、HE染色、视网膜铺片等试验方法,以miR-130a为研究重点,在细胞、动物及临床三个方面,证实miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制DR的作用机制。[目的]（1）检测miR-130a在高糖诱导的视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞、DR小鼠模型以及DR患者外周血中的表达水平;（2）寻找并证实TNF-α是miR-130a的靶基因,并验证它们的靶向关系;（3）检测高糖对TNF-α和SOD1表达的影响;（4）探究高糖条件下过表达miR-130a对ARPE-19细胞增殖活力、凋亡、克隆形成能力、氧化应激、细胞焦亡的影响及机制;（5）明确过表达miR-130a对DR小鼠模型视网膜病变的影响;（6）明确miR-130a、TNF-α和SOD1在DR患者外周血中的表达及线性关系;（7）明确miR-130a表达与DR的相关性。[方法]（1）取对数生长期的ARPE-19细胞分别用正常糖（5.5 mM）和高糖（50 mM）培养0h、24 h、48 h、72 h、96 h,在高糖条件下通过慢病毒转染的方法改变ARPE-19 细胞中 miR-130a、TNF-α和 SOD1 表达;CCK-8 检测 ARPE-19 细胞增殖活;流式细胞术检测ARPE-19细胞凋亡率;平板克隆形成实验检测ARPE-19细胞克隆形成能力;DHE染色检测ARPE-19细胞中ROS水平;丙二醛（Malondialdehyde,MDA）试剂盒检测 ARPE-19 细胞中 MDA 表达;L-012 染色检测细胞外NADPH氧化酶衍生的超氧化物水平;RT-qPCR检测ARPE-19细胞中 miR-130a、TNF-α mRNA、SOD1 mRNA 表达;Western blot 检测 ARPE-19细胞中TNF-α、SOD1、增殖相关蛋白、凋亡相关蛋白、焦亡相关蛋白表达;双荧光素酶报告基因验证miR-130a和TNF-α的靶向关系。（2）通过给小鼠腹腔注射STZ诱导建立DR小鼠模型,待成模后通过慢病毒眼内注射过表达miR-130a,在第14天后检测小鼠体重和血糖变化,并处死小鼠,取出右眼,经固定、石蜡包埋后,HE染色进行组织学分析,视网膜铺片检测小鼠视网膜血管病变;取出左眼视网膜组织,采用RT-qPCR检测miR-130a、TNF-α、SOD1 的 mRNA 表达;Western blot 检测 TNF-α、SOD1、焦亡相关蛋白表达;流式细胞术检测小鼠视网膜组织中ROS水平;MDA试剂盒检测小鼠视网膜组织中MDA含量。（3）于昆明医科大学第一附属医院眼科收集3例正常人、30例糖尿病无视网膜病变（Diabetic non-retinopathy,NO DR）患者、30例DR患者外周血,将血样在8℃下以3000 g离心10 min,收集上清,RT-qPCR检测外周血中miR-130a、TNF-α mRNA、SOD1 mRNA 表达,并分析 miR-130a 与 TNF-α以及 miR-130a 与SOD1的线性关系。[结果]（1）细胞实验部分①高糖以时间依赖性显着抑制ARPE-19细胞增殖活力、促进细胞凋亡、抑制细胞克隆形成,过表达miR-130a可以缓解高糖对ARPE-19细胞增殖活力和细胞克隆形成的抑制作用,同时,过表达miR-130a也能缓解高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡。同时过表达TNF-α或敲降SOD1可恢复以上作用。②高糖以时间依赖性促进ARPE-19细胞发生氧化应激。高糖能显着上调ARPE-19细胞中ROS和MDA水平,而用ROS清除剂NAC或焦亡抑制剂NSA分别处理ARPE-19细胞后,发现NAC显着抑制高糖诱导的ROS和MDA水平,而NSA对ROS和MDA水平无显着影响,同时,过表达miR-130a显着抑制高糖诱导的ROS和MDA水平,而过表达TNF-α或敲降SOD1恢复了过表达miR-130a的该作用。③高糖可下调miR-130a的表达、上调TNF-α的表达,抑制SOD1表达。且miR-130a靶向下调TNF-α的表达。高糖抑制miR-130a和SOD1mRNA的表达,上调TNF-αmRNA表达,而过表达miR-130a恢复了高糖对miR-130a、TNF-αmRNA和SOD1 mRNA表达的作用,过表达TNF-α或敲降SOD1又可恢复过表达miR-130a的作用;双荧光素酶报告基因和Western blot检测结果显示,miR-130a靶向下调TNF-α表达。④miR-130a通过TNF-α/SOD1/ROS信号通路抑制ARPE-19细胞焦亡。高糖显着上调 TNF-α、Caspase-3、Bax、P27、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β和IL-18的表达,抑制Bcl-2和SOD 1表达,过表达miR-130a缓解了高糖对TNF-α、Caspase-3、Bax、P27、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β、IL-18、Bcl-2和SOD1表达的作用,而过表达TNF-α或敲降SOD1恢复了过表达miR-130a的作用。（2）动物实验部分:与对照组相比,DR组、DR+Ctrl-mimic组及DR+miR-130a mimic组小鼠体重显着降低,血糖浓度显着增加;DR组中miR-130a和SOD1 mRNA的表达较对照组显着降低,TNF-α mRNA表达显着增加,而DR+miR-130 a mimic部分恢复了该作用;Western blot检测结果显示,DR组中TNF-α、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β和 IL-18 的表达较对照组显着上调,SOD1表达显着下调,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用;HE染色结果显示,与对照组相比,DR组小鼠的视网膜组织中RPE层厚度降低,细胞数量减少、排列紊乱,而DR+miR-130a mimic组部分缓解了 DR组的改变;视网膜铺片结果显示,DR组小鼠血管末端可见微血管瘤及多个无灌注区,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用;流式细胞术和MDA试剂盒检测结果显示,DR组中ROS和MDA水平较Ctrl组显着增加,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用。（3）临床样本分析结果显示:DR与患者的性别、年龄、心脏病病史以及高血压病史无关,而与患者的DM病史时间显着相关。RT-qPCR检测DR患者外周血中 miR-130a、TNF-α mRNA 及 SOD1 mRNA 的表达,结果显示,miR-130a和SOD1 mRNA在NO DR患者外周血中异常低表达,在DR患者外周血中的表达更低,TNF-α mRNA在NODR患者外周血中异常高表达,在DR患者外周血中的表达更高;且miR-130a和TNF-α mRNA表达呈负相关,TNF-α mRNA与SOD1 mRNA表达呈负相关,miR-130a与SOD1 mRNA呈正相关。[结论]（1）高糖刺激可抑制ARPE-19细胞增殖活力、抗凋亡力、克隆形成能力,并促进ARPE-19细胞中氧化应激和焦亡的发生。（2）高糖可抑制ARPE-19细胞中miR-130a和SOD1表达,上调TNF-α表达,且呈时间依赖性。（3）miR-130a靶向下调TNF-α表达;（4）miR-130a通过TNF-α/SOD1/ROS信号通路抑制ARPE-19细胞焦亡（5）在STZ诱导的DR小鼠模型视网膜组织中miR-130a表达显着下调,TNF-α和SOD1表达显着上调,且过表达miR-130a可显着抑制DR模型中氧化应激和细胞焦亡;（6）DR与患者的性别、年龄、心脏病病史以及高血压病史无关,而与患者的DM病史时间显着相关。miR-130a和SOD1 mRNA在NO DR患者外周血中异常低表达,且在DR患者外周血中表达更低,TNF-α mRNA表达在NODR患者外周血中异常高表达,且在DR患者外周血中表达更高。
陈水龄[5]（2020）在《姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究》文中指出第一章目的采用 532nm倍频激光建立实验性脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization,CNV）动物模型,为CNV的相关基础研究提供模型参考。方法1.应用532nm倍频激光光凝棕色挪威（Brown Norway,BN）大鼠建立实验性CNV模型,分别在光凝后1d、3d、5d、7d、14d、21d采用眼底照、眼底荧光血管造影（Fundus Fluorescein Angiograph,FFA）和吲哚菁绿血管造影（Indocyanine green Angiography,ICGA）观察光凝后不同时间点 CNV 的变化情况。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察光凝后不同时间点CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学染色法观察光凝后不同时间点CNV眼组织中CD105因子表达的情况。结果1.光凝后1d光斑处无荧光素渗漏;光凝后3d、5d仅有少量光斑处有荧光素渗漏。光凝后7d CNV生成率为70.18%,荧光素渗漏平均光密度值为128.30±11.21。光凝后14d CNV生成率为78.18%,平均光密度值为182.12±6.59,与光凝后7d组比较差异有统计学意义（P<0.05）。光凝后21d,CNV生成率和荧光素渗漏平均光密度值与光凝后14d组比较差异无统计学意义。2.HE染色结果显示:随着光凝后时间的增加,CNV中央厚度逐渐增加,光凝后7d CNV厚度为48.92±2.81μm,较光凝后1d显着增加（P<0.05）;光凝后14d CNV厚度为61.98±5.06μm,较光凝后7d显着增加（P<0.05）;光凝后21d CNV厚度为61.78±4.03μm,与14d组比较差异无统计学意义。3.CD105免疫组化结果显示:正常组视网膜组织CD105表达呈阴性,光凝后1d、3d、5d组光斑处可见少量棕黄色反应物表达,光凝后7d组光斑处棕黄色反应物逐渐增多（P<0.05）,光凝后14d组较光凝后7d组比较显着增加（P<0.05）,光凝后21d组与光凝后14d组比较差异无统计学意义。结论1.应用532nm激光光凝可以成功建立BN大鼠实验性CNV动物模型。2.CNV在光凝后7d至14d生长迅速,至21d逐渐稳定,此模型具有成模速度快,成模率高、重复性好、成本低的优点,可作为CNV基础研究的动物模型。3.眼底照、FFA、ICGA、HE染色和免疫组化检查可以动态观察CNV的变化。第二章目的观察中药单体姜黄素对BN大鼠实验性CNV的抑制作用,以及对AKT/p-AKT/HIF-1 α/VEGF信号通路活性的影响,为姜黄素治疗CNV提供实验依据。方法1.应用532nm倍频激光光凝诱导BN大鼠建立CNV模型,造模后的大鼠被随机分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组,在光凝后14d进行眼底照、FFA与ICGA检查。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。4.采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。5.采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的相对表达量。结果1.正常组未打激光,模型组,雷珠单抗组,姜黄素低、中、高剂量组CNV生成率分别为78.18%、73.21%、77.19%、75.86%、74.55%,组间比较差异无统计学意义;荧光素渗漏平均光密度值分别为182.12±6.59、119.22±8.03、166.45±8.33、164.34±5.69、149.22±6.45;雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）;姜黄素低、中、高剂量组较雷珠单抗组显着升高（P<0.05）,其中姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。2.HE染色结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织各层结构清晰、排列整齐。光凝后14d,雷珠单抗组CNV中央厚度较模型组显着减少（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着减少（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。3.免疫组化结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织结构中AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子表达呈阴性,未见棕黄色反应物。光凝后14d,模型组光斑处AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组低于模型组（P<0.05）;姜黄素低剂量组、中剂量组AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组的表达较模型组显着降低（P<0.05）;较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。4.mRNA结果显示:光凝后14d,模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。5.Westernblot结果显示:光凝后14d,AKT蛋白各组间比较差异无统计学意义。p-AKT蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）;雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。HIF-1α蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）,雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）,姜黄素低、中剂量与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。VEGF蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）,雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）,姜黄素低剂量组与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素中、高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。结论1.高剂量姜黄素（400mg/Kg/d）对激光诱导的BN大鼠实验性CNV的形成具有抑制作用。2.姜黄素抑制BN大鼠实验性CNV的机制可能与抑制AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路的激活,降低相关因子的表达有关。第三章目的观察姜黄素对氯化钴（CoCl2）诱导的人视网膜色素上皮细胞株-19（adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19）细胞缺氧模型中 AKT、HIF-1 α 和VEGF因子mRNA及蛋白表达的影响。方法1.采用CoCl2诱导ARPE-19细胞建立化学性缺氧模型,应用CCK-8法筛选造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素和阳性对照药雷珠单抗的浓度,同时检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响。2.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用RT-qPCR法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、HIF-1α和VEGF mRNA表达量的影响。3.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用Westernblot法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响。结果1.CCK-8细胞活性检测:随着CoCl2浓度的增加,ARPE-19细胞活性呈现先增长后抑制,当CoCl2终浓度≥200μM时,细胞活性显着降低（P<0.05）。姜黄素终浓度在0-100μM时,ARPE-19细胞活性未见异常;当浓度≥200μM时,细胞活性显着降低（P<0.05）。雷珠单抗在终浓度为20μg/mL时,细胞活性较CoCl2组显着降低（P<0.05）,与正常组比较差异无统计学意义;当浓度为40μg/mL、80μg/mL时,细胞活性较CoCl2组和正常组均显着降低（P<0.05）。因此,我们选择终浓度100μM的CoCl2作为造模浓度;终浓度6.25μM、25μM、100μM的姜黄素作为低、中、高剂量组浓度;终浓度为20μg/mL的雷珠单抗作为阳性对照药物的浓度。2.RT-qPCR结果显示:模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P<0.05）;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）;与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.Westernblot结果显示:AKT蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义。p-AKT和HIF-1α蛋白相对表达量模型组均高于正常组（P<0.05）,雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）,姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P<0.05）,姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。VEGF蛋白相对表达量模型组高于正常组（P<0.05）,雷珠单抗组低于模型组（P<0.05）,姜黄素低剂量与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中、高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.应用CoCl2可成功建立APRE-19细胞化学缺氧模型。2.CoCl2在终浓度为100μM时可增加细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量。3.高剂量姜黄素（100μM）可降低CoCl2诱导的ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和 VEGF mRNA 及 p-AKT、HIF-1α 和 VEGF 蛋白的表达。4.姜黄素（100μM）对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧具有保护作用。第四章目的观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）细胞增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。方法1.将ARPE-19细胞条件培养液分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,分别作用于HUVEC细胞;采用CCK-8法观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响。2.采用细胞划痕实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的水平迁移的影响。3.采用Transwell小室迁移实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的垂直迁移的影响。4.采用Transwell小室侵袭实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的侵袭的影响。5.采用Matrigel基质胶管腔形成实验,观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响。结果1.ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响,组间差异无统计学意义。2.HUVEC细胞水平迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞水平迁移显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组水平迁移显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）、高（100μM）剂量组水平迁移较模型组显着减少（P<0.05）,其中,高剂量组与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.HUVEC细胞垂直迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞垂直迁移显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组垂直迁移显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）剂量组垂直迁移与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素条件培养液高（100μM）剂量组垂直迁移较模型组显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。4.HUVEC细胞侵袭实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞侵袭显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组细胞侵袭显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）剂量组细胞侵袭与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素条件培养液高（100μM）剂量组较模型组细胞侵袭显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。5.HUVEC细胞管腔形成实验结果显示:模型组管腔形成较正常组显着增加（P<0.05）;雷珠单抗组管腔形成较模型组显着较少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）剂量组管腔形成与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中（25μM）、高（100μM）剂量组管腔形成与模型组比较显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.ARPE-19细胞姜黄素低（6.25μM）、中（25μM）、高剂量组（100μM）条件培养液可显着抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显着抑制HUVEC细胞垂直迁移。2.ARPE-19细胞姜黄素高剂量组（100μM）条件培养液可抑制HUVEC细胞侵袭。3.ARPE-19细胞姜黄素中（25μM）、高剂量组（100μM）条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。4.姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。
李园媛[6]（2020）在《水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究》文中研究表明目的:通过水提法制备水蛭提取液,分别采用凝血酶间接检测提取液中水蛭素含量（根据2015版药典）和高分辨液质联用QE技术检测提取液成分,以确定水蛭提取液的主要成分。通过观察水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma RB）WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响,验证水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞生长和侵袭的作用。通过水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor VEGF）、缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a HIF-1a）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9 MMP-9）的影响及对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（Phosphatidylinositol 3kinase/Protein Kinae B PI3K/AKT）通路的影响,阐明水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞可能的分子机制。通过观察水蛭提取液对人脐静脉内皮细胞（Human Vascular endothelial cells HUVEC）的活性影响及表达VEGF和血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 VEGFR2）的影响,以此来研究水蛭提取液抑制肿瘤血管生成的潜能。方法:1.水蛭提取液的制备和检测:水提法制备水蛭提取液,并利用凝血酶间接测定水蛭素的含量;高分辨液质联用-QE技术分析水蛭的主要成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 将WERI-RB-1细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 以0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响; 以2个实验浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞凋亡的影响; transwell侵袭实验检测2个实验浓度对WERI-RB-1细胞侵袭作用的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Elisa实验检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,RT-PCR检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a和MMP-9 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Western Blot检测蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a、MMP-9、PI3K、人磷酸化AKT蛋白（Human phosphorylated AKT protein p-AKT）蛋白含量的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 将HUVEC细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,RT-PCR检测水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,Western Blot检测蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2蛋白含量的影响。结果:1.水蛭提取液的制备和检测:根据2015版《中华药典》中使用凝血酶测定水蛭提取液中水蛭素的浓度,经过多次反复提取及测定,水蛭提取液中水蛭素浓度保持相对稳定。高分辨液质联用分析仪-QE分析结果表明:水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 0.04U/ml、0.08U/ml的水蛭提取液组在48h对RB细胞的抑制率分别是9.70%、9.92%,与对照组比较,差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 实验组药物浓度干预的RB细胞主要阻滞在G2/M期。对照组、0.04U/ml水蛭提取液组、0.08U/ml水蛭提取液组处于G2/M期的阳性细胞率（%）分别为3.00±2.32、12.59±5.36、14.79±4.12（对照组与水蛭提取液组比较,P<0.01）。 实验组水蛭提取液浓度均可诱导RB细胞凋亡率上调,以上3组细胞凋亡率依次分别为4.64±2.56、37.91±3.44、33.05±2.25（与对照组比较,P<0.01）。 实验组Transwell下室中移行的、每高倍视野细胞数目均较对照组显着减少,3组检测结果（OD值）依次分别为1.21±4.36、0.44±2.08、0.53±3.42（与对照组比较,P<0.01）。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: Elisa实验结果显示:与对照组比较,0.04U/ml和0.08U/ml2个水蛭提取液浓度培养基上清中VEGF的表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,HIF-1a和MMP-9 m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 0.04U/ml和0.08U/ml水蛭提取液干预WERI-RB-1细胞48h后,细胞的抑制率分别为12.96±1.59、14.81±2.17,与对照组比较差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.水提法提取的水蛭提取液中水蛭素含量相对稳定。水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液通过抑制WERI-RB-1活性、引起周期阻滞、诱导细胞凋亡、抑制细胞侵袭等作用对视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞发挥抑制作用。3.水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞,同时抑制WERI-RB-1细胞中HIF-1a、MMP-9活性。4.水蛭提取液可抑制HUVEC细胞活性,抑制HUVEC细胞表达VEGF、VEGFR2蛋白活性。综上所述,在体外实验中,水蛭提取液在一定程度上可能通过VEGF/PI3K/AKT通路和HIF-1a、MMP-9因子影响WERI-RB-1细胞周期分布、凋亡、侵袭作用,从而发挥抑制RB的作用。同时发现水蛭提取液可能通过抑制VEGF、VEGFR2表达抑制脐静脉内皮细胞。我们的研究结果表明:水蛭提取液对RB细胞具有抑制作用,同时可能对RB血管也有抑制作用。从中医理论上进一步验证了其活血化瘀、其破血消瘕的作用。以上研究结果为开发新型抗肿瘤制剂水蛭提供了一定的临床前研究资料。
韩昊特[7]（2021）在《PI3Kδ在PVR中的作用机制及视网膜病变治疗新途径研究》文中研究表明增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是与视网膜牵拉和脱离相关的临床综合征。视网膜和玻璃体腔表面具有增殖潜能的细胞增殖和收缩是其形成的主要原因。目前多数情况下,可以实现与PVR相关的视网膜的外科手术复位,但视觉恢复效果仍较差。在多达10%的视网膜脱离患者中发现,一定程度的PVR尽管进行了复杂的手术,但大多数病人仍会视力低下。糖尿病性视网膜病变,特别是其增生阶段（增殖性糖尿病性视网膜病变,proliferative diabetic retinopathy,PDR）,与病理性血管生成有关,是导致失明的第二大原因。当前,PDR治疗方法通常使用VEGF抗体（兰尼单抗或贝伐单抗）或由融合至VEGF受体胞外域的抗体Fc片段组成的重组蛋白来中和玻璃体中的血管内皮生长因子。但在许多PDR患者中都观察到了耐药性,迫切需要新的治疗方法。本论文基于CRISPR-Cas9基因编辑技术研究PI3Kδ在PVR形成中的作用机制,探索PVR基因治疗新途径;并从天然单体化合物中筛选潜在的治疗视网膜病变（如PVR和PDR）的先导化合物或药物,为视网膜疾病的治疗提供新的治疗方法。本论文的主要研究内容和结果如下:（1）应用CRISPR-Cas9基因编辑技术研究磷酸肌醇3激酶δ（PI3Kδ）在玻璃体诱导的Akt/Mdm2/p53激活和视网膜色素上皮细胞迁移中的作用磷酸肌醇3激酶（PI3K）是脂质家族蛋白激酶,其在信号传递方面起关键作用。PI3Ks包括PI3Kα,PI3Kβ,P13Kγ和PI3Kδ。PI3K在实验性增殖性玻璃体视网膜病变中起重要作用,但是,PVR涉及何种PI3K亚型尚不清楚。本章研究表明,p110δ在视网膜色素上皮RPEs细胞中特异性高表达,为了阐明PI3K亚型在PVR形成中的分子机制,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建p110δ敲减细胞系,并采用p110δ特异抑制剂Idelalisib用分子和药理学方法灭活p110δ,证明p110δ灭活可阻止玻璃体诱导的Akt/Mdm2/p53通路的激活以及在PVR形成中细胞固有的细胞应答,进而阐明了PI3K亚型在PVR形成中的分子机制。这些研究为RPE（如PVR）相关疾病的治疗提供了新的技术手段。（2）TGF-β2诱导的PI3Kδ信号转导环在PVR疾病中的作用在PVR的发展过程中,上皮间质转化（EMT）是细胞主要的应答反应,而转化生长因子（TGF）-β2是诱导EMT的关键因素。PI3K/Akt信号通路是实验性PVR的重要调节通路,而在玻璃体诱导的Akt激活中,PI3Kδ亚型起主要作用。本章研究表明,通过CRISPR/Cas9或药理学（Idelalisib抑制剂）方式使PI3Kδ失活,可有效阻断TGF-β2诱导的Akt激活以及EMT。Idelalisib对PI3Kδ的抑制作用还可以防止在小鼠中实验性诱导的PVR形成。进一步研究发现TGF-β2诱导PI3Kδ/Akt/Mdm2/NF-κB途径控制PI3K的催化亚基p110δ的表达,并产生正反馈回路,这一通路的发现为阐明PVR的发病机理奠定了基础。（3）Chalcomoracin预防玻璃体诱导的Akt活化和视网膜色素上皮细胞迁移为了寻找治疗视网膜病变新的药物或先导化合物,本章选用实验室从真菌感染的桑叶分离得到的天然单体化合物Chalcomoracin（CMR）,研究其抑制玻璃体诱导的信号转导通路和PVR固有的细胞反应。研究表明,CMR对ARPE-19细胞IC50在72小时为35.5μM,而5μM的CMR则可显着抑制玻璃体诱导的Akt激活和p53抑制。此外,还发现CMR能有效地阻断玻璃体刺激的ARPE-19细胞的增殖,迁移和收缩,表明CMR是一种潜在的PVR预防剂。（4）Capilliposide B在人原代视网膜微血管内皮细胞中阻断VEGF诱导的体外血管生成异常的血管生成与PDR的形成有关。本章探讨天然产物对PDR的治疗的可行性。Capilliposide B（CPS-B）是一种来源于细梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl）的齐墩果三萜皂苷,可以抑制血管内皮生长因子诱导的血管生成信号通路和人视网膜微血管内皮细胞（HREC）在PDR中的细胞响应。研究表明,CPS-B对HREC细胞IC50在72小时为8.5μM,而1μM CPS-B则可特异性抑制VEGF诱导的VEGFR2及其下游信号转导酶Akt和Erk的活化。发现CPS-B有效地阻断了VEGF刺激的HREC增殖,迁移和管形成,表明CPS-B是一种潜在的血管新生相关疾病（如增殖性糖尿病性视网膜病）的预防剂。
张赫[8]（2020）在《藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的防治效果及分子机制研究》文中指出增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是孔源性视网膜脱离或严重眼外伤的严重并发症,且预后较差。PVR是视网膜脱离（retinal detachment,RD）复位手术失败的主要原因,发生于视网膜神经上皮层前、后面及玻璃体后表面形成的一层纤维细胞组织膜,膜的增生、收缩形成视网膜的固定皱褶,并发展为视网膜多种形式收缩、牵拉,其发病率为5-10%。增生性玻璃体视网膜病变实际上是一种组织损伤、修复反应的病理生理过程,其形成机制极为复杂。疾病的发病机制主要参与者视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial,RPE）的增殖和移行是发病的关键,整个病理机制由多种生物因子,细胞因子和炎症因子参与。RPE细胞在眼球发育和神经视网膜正常运作和维护中发挥着重要作用,它位于Bruch膜和视网膜中间,是一种高度分化的单层细胞。可以把营养物质从脉络膜运输到光感受器,吞噬脱落的光感受器外节,维持血-视网膜屏障等重要作用。当视网膜脱离发生后,血-视网膜屏障破坏,RPE细胞暴露在血清和玻璃体中。玻璃体中多种细胞因子刺激RPE细胞移行进入玻璃体腔内,进而增殖和转化,形成视网膜前增殖膜。此外,既往研究表明PVR患者玻璃体视网膜牵拉膜中存在细胞凋亡。细胞凋亡在某些眼科疾病的发展中起重要作用。在生长因子中,血小板衍生因子（PDGF）包括:PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD,通过二硫键形成同型或异型二聚体（PDGF-AA,-BB,-AB,-CC,和-DD）。PDGF参与细胞分化、增殖、凋亡和移行等多种重要的生物学活动。在眼科学研究表明,PDGF增强了成纤维细胞和RPE细胞的收缩。各项体内研究中发现,PVR患者及动物模型的玻璃体中均能检测出PDGF含量增多,在做了激光手术后的视网膜脱离患者和PVR小鼠模型的RPE细胞中,检测出PDGF表达是提高的。PDGF-BB作用于血管细胞、RPE细胞和神经胶质细胞的增殖和迁移,而PDGF-AA作用于非血管细胞的增殖和迁移。藏红花酸,藏红花的提取物之一,是一种类胡萝卜素物质,已被证明有多种生物学功能,如对多种细胞有抗增殖,抗炎等作用。在我们之前的研究中已经证实藏红花酸对ARPE-19细胞的增殖、迁移及间质转化有抑制作用。在本次研究,我们在体外试验中为ARPE-19细胞提供稳定的病理环境即加入稳定剂量的PDGF-BB,研究藏红花酸对PDGF-BB诱导下ARPE-19细胞作用及机制,在体内试验中拟以兔眼PVR模型为研究对象,在体内和体外两个层面加以研究。第一部分藏红花酸对体外培养的ARPE-19细胞在PDGF-BB诱导下的增殖,迁移及凋亡的影响及机制目的:本实验研究藏红花酸对体外培养的ARPE-19细胞在PDGF-BB诱导下的增殖,迁移和凋亡的影响及相关机制。方法:首先设置不同的药物浓度梯度（0μM,10μM,30μM,100μM,200μM,300μM,400μM,500μM和1000μM）,通过计算IC50筛选出实验中藏红花酸的作用浓度。将不同浓度的藏红花酸（0μM、100μM、200μM、400μM）和PDGF-BB作用于ARPE-19细胞,应用CCK-8实验检测藏红花酸对被PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞增殖的影响;用Ed U试剂盒进一步证明藏红花酸的抑制作用;用划痕实验和Transwell实验验证藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞迁移的作用;用Annexin V-FITC/PI双标法流式细胞术检测藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞凋亡的影响;用Western blot检测不同浓度的藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞凋亡的相关蛋白Bax、Bak（促凋亡蛋白）和Bcl-2、Bcl-x L（抗凋亡蛋白）表达的影响。结果:低浓度的藏红花酸（100μM）的细胞增殖抑制率在72h时有明显的提高,而中浓度藏红花酸（200μM）和高浓度藏红花酸（400μM）干预后的细胞增殖抑制率升高呈浓度依赖和时间依赖性;被藏红花酸作用的细胞的Ed U转染概率比对照组降低了,且呈浓度依赖性,结果与CCK-8相符;划痕实验中,作用48小时和72小时,各种浓度的药物对细胞的迁移有明显抑制;Transwell实验结果分析,我们发现藏红花酸对细胞迁移的抑制作用呈浓度依赖;Annexin V-FITC/PI双标法流式细胞术检测发现藏红花酸诱导了PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡,且随浓度的增加促进细胞凋亡的能力越强;western blot蛋白检测藏红花酸能够显着的抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x L的表达（P<0.01）,并且增加了促凋亡蛋白Bax、Bak的表达（P<0.01）,均呈浓度依赖性。小结:藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞的增殖和迁移,并且诱导PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡。第二部分藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活目的:验证藏红花酸可能参与的信号通路。方法:使用western blot蛋白检测不同浓度藏红花酸（0μM、100μM、200μM、400μM）对PDGF-BB诱导的PDGFR磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活的影响。结果:不同浓度的藏红花酸均能抑制PDGFRβ的磷酸化,且对下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活均有显着的抑制作用。小结:藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活。第三部分藏红花酸治疗兔眼玻璃体视网膜病变的实验研究目的:进一步检测藏红花酸对治疗兔眼玻璃体视网膜病变的相关研究。方法:选用20只成年色素兔,随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组玻璃体腔内注射2×105cells/0.1ml DMEM/F12的ARPE-19细胞悬液、2.5μl 20μg/m L的PDGF-BB、0.4μmol藏红花酸,对照组玻璃体腔注射ARPE-19细胞、2.5μl 20μg/m L的PDGF-BB、0.1ml PBS（含2%DMSO）。于3天、7天、14天及28天对其进行裂隙灯和眼底镜检查。于7天、14天及28天行暗适应视网膜电图检查和OCT检查,第28天处死实验兔取眼球标本作组织学检测,检测指标为p-AKT、p-p38、p-PI3K、p-ERK和p-JNK。结果:各组实验动物眼底情况在不同的时间点根据Fastenberg分级并进行统计学分析。造模后第7天:对照组0级4只,1级3只,2级2只;实验组0级8只,1级1只。造模后第14天:对照组1级5只,2级3只,3级1只;实验组0级2只,1级6只,2级1只。造模后第28天:对照组2级1只,3级2只,4级3只,5级3只;实验组1级2只,2级5只,3级2只。眼底相和OCT显示:造模后第7天,对照组玻璃体混浊较实验组严重,可以观察到增殖膜,实验组玻璃体轻度混浊,视网膜结构正常。造模后第14天,对照组玻璃体混浊,可见灰白色纤维条索和增殖膜,髓线处视网膜有脱离,实验组玻璃体轻度混浊,可观察到增殖膜。造模后第28天,对照组可见广泛的视网膜皱褶和脱离,实验组可见增殖膜及牵拉导致的视网膜脱离。ERG检查结果:第7天注药后的眼睛b波振幅较对侧眼没有明显变化,14天和28天后注药的眼睛b波振幅较对侧眼轻度下降,而对照组在第14天和28天后b波振幅较对侧眼明显下降。组织病理学结果:HE染色对照组神经节细胞层水肿,内外核层细胞排列混乱,光感受器细胞外节丢失。实验组视网膜全层结构清晰,形态正常,视神经节细胞层、内外核层细胞排列整齐。p-Akt、p-ERK和p-JNK免疫组织化学染色,对照组视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见强表达,实验组的视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见较低表达。视网膜未见阳性染色。p-PI3K和p-p38免疫组织化学染色,对照组视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见弱表达,实验组除了增殖膜中的血管管壁有阳性表达外,视盘前和视网膜前增殖膜均未见阳性染色,视网膜未见阳性染色。小结:藏红花酸抑制了兔PVR的发病进展,对视功能有保护作用,并且降低了视网膜增殖膜中p-Akt、p-PI3K、p-p38、p-ERK和p-JNK的表达。结论:1.红花酸抑制了PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞的增殖和迁移,并且诱导PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡。2.藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活。3.藏红花酸抑制了兔PVR的发生进展,对视功能有保护作用,并且降低了视网膜增殖膜中p-Akt、p-PI3K、p-p38、p-ERK和p-JNK的表达。
刘晓清[9]（2019）在《散血明目片对兔PVR中MAPK及PI3K/Akt信号通路的影响》文中指出目的:通过建立兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变模型,观察散血明目片对其视网膜增殖膜中PI3K、AKT、MEK、P38MAPK蛋白的表达影响。方法:将42只新西兰大白兔随机分为A、B、C、D、E、F、G组,共7组每组6只。分别为:A组:空白组（正常组）;B组:模型组;C组:散血明目片组;D组:PD98059组;E组:LY294002组;F:MK-2206组;G组:抑制剂混合组。造模后30min,向D组、E组、F组、G组分别向玻璃体腔注射0.1ml的PD98059、LY294002、MK-2206及三种混合抑制剂。B、C组则予以玻璃体腔内注射0.1ml生理盐水。术后第一天散血明目片组予以散血明目片10mg/kg溶液灌胃,除A组其余组以生理盐水10mL/kg灌胃,连续灌胃28天。造模后第1、3、7、14、21、28天分别用手持裂隙灯、直接眼底镜观察眼前节、眼底情况,眼底照相、眼部B超、三面镜记录眼底情况。28天后处死,取材将视网膜增殖膜送检,分别在光镜下观察视网膜各层的形态结构,免疫组化法检测各组视网膜增殖膜中PI3K、AKT、MEK、P38MAPK在视网膜各层的表达情况,qPCR法、Western Blot法检测各组视网膜增殖膜的PI3K、AKT、MEK、P38MAPK表达情况。结果:1.眼前节情况:术后各造模兔眼结膜不同程度出现充血,个别角膜出现水肿、前房有少量浮游物,个别兔眼出现晶状体混浊。术后第7天,各症状得以改善,眼前节炎症消除。2.眼底情况:成模后28天,造模组中玻璃体有不同程度混浊,明显可见增殖膜、增殖条索的形成,对局部视网膜有牵拉作用,并造成视网膜脱离。散血明目片组中玻璃体腔内可见少量的增生痕迹,未见明显的增殖条索,未有视网膜脱离。3.光镜下观察视网膜组织结构:模型组中视网膜水肿、各层结构紊乱,可见增生组织、大量的炎性细胞浸润以及胶原纤维的形成。散血明目片组中视网膜结构大致正常,可见少量炎性细胞,未见明显的增生。4.免疫组化法观察各指标在组织中的表达情况:模型组各层大都可见有棕黄色颗粒,以视网膜色素上皮层、视神经纤维层、节细胞以及增生组织中表达增多。散血明目片组表达较弱,以视网膜色素上皮层以及节细胞层表达居多。5.Western blot法检测指标蛋白在组织中的表达情况:用药28天后,可见各治疗组蛋白含量与模型组相比均有所降低。PI3K蛋白表达中:空白组与抑制剂混合组相比不具有统计学意义（P>0.05）,与其他比较有差异（P<0.05或P<0.01）。PI3K蛋白在模型组中大量表达,散血明目片组以及四组抑制剂组与模型组比较,可见表达量明显弱于模型组,差异具有统计学意义（P<0.01）。药物干预组中,散血明目片组与抑制剂混合组相不具有统计学意义（P>0.05）。散血明目片与其他三组抑制剂相比表达量低,差异具有统计学意义（P<0.01）。AKT蛋白表达中:散血明目片组分别与抑制剂混合组、空白组比较表达相似,无统计学意义（P>0.05）。造模组中,各用药干预组蛋白表达量与模型组相比均低,有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。散血明目片组与抑制剂混合组比较无统计学意义（P>0.05）。散血明目片组与其余三组抑制剂组相比,表达量明显低于三组,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。MEK蛋白表达中:各造模组中MEK蛋白含量均明显提高,模型组表达含量最高,与空白组比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。造模各组中,与模型组比较均有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。在药物干预组中,散血明目片与抑制剂混合组、PD98059组比较表达量高,差异具有统计学意义（P<0.05）,散血明目片组表达量明显低于LY294002组、MK2206组,较差异均有统计学意义（P<0.01）。P38MAPK蛋白表达中:各造模组与空白组比较,统计均有意义（P<0.01或P<0.05）。造模组中各组与模型组相比,表达量均比模型组低,差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）,各用药干预组中,四组抑制剂组与散血明目片组相比表达量均高于散血明目片组,具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。6.qPCR检测各指标在组织中的表达情况:PI3K mRNA表达情况:抑制剂混合组与空白组比较无统计学意义（P>0.05）,其余六组与空白组比较有差异,具有统计学意义（P<0.01）。造模组中,药物干预组与模型组相比其表达量均有不同程度的降低,相比均有差异具有统计学意义（P<0.01）。各药物干预组中,散血明目片组与抑制剂混合组相比,表达相似,无统计学意义（P>0.05）。余组与散血明目片组比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。AKT mRNA表达情况:各造模组的AKT mRNA表达均有不同程度的提高,其中散血明目片组、抑制剂混合组与空白组比较无统计学意义（P>0.05）。造模组中,各药物干预组与模型组比较,表达量均比模型组低具有显着统计学意义（P<0.01或P<0.05）。各用药物干预组中,散血明目片组与抑制剂混合组比较无统计学意义（P>0.05）。散血明目片组与其它组相比表达量低,有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。MEK mRNA表达情况:造模组与空白组相比,均有差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,各造模组中,模型组表达MEK mRNA显着,其余干预组与模型组相比,均具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。各用药干预组中,散血明目片组与抑制剂混合组、PD98059组比表达量高（P<0.05）,与余干预组比较表达量低（P<0.01）。P38MAPK mRNA表达情况:各造模组均有不同程度的表达,模型组表达量最多。与空白组比较均有差异,具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。造模组中各组表达量均比模型组低,与模型组相比有差异,有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。各药物干预组中,散血明目片组与四组抑制剂相比表达量低,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论:1.散血明目片能改善兔PVR中视网膜的各层结构,减少炎性细胞浸润、减轻组织水肿、抑制增生组织的产生。2.散血明目片能够有效降低兔视网膜增殖膜中PI3K、AKT、MEK、P38MAPK的表达,但对其中MEK作用弱。3.散血明目片对PVR的防治可能与MAPK、PI3K/Akt信号通路有关。
闫磐石[10]（2005）在《脑源性神经营养因子及转化生长因子-β2在形觉剥夺性近视中作用的实验研究》文中认为近视是眼科的常见病、多发病,尤其是高度近视又称病理性近视或变性近视,因常伴有并发症,矫正视力多不理想,常影响患者的学习、工作及生活。近视发生机制至今尚未完全明了。形觉剥夺性近视（form deprivation myopia,FDM）模型的建立,使人们对近视的发生、发展有了进一步了解。形觉剥夺主要通过视网膜上的多种神经递质与生长因子水平的改变,调控邻近巩膜的生长,这些神经递质与生长因子通过互相平行或彼此交叉的途径发挥作用。 脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）是神经营养素家族成员之一,研究表明单眼剥夺可使剥夺眼对侧视皮质内及剥夺眼视网膜神经节细胞 BDNFmRNA表达水平降低。转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）是一个多功能的生长因子超家族,眼部生物学活性以TGF-β2为主。研究表明单眼剥夺使剥夺眼视网膜-视网膜色素上皮-脉络膜TGF-β mRNA表达水平及TGF-β蛋白水平降低。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases-2,MMP-2）与其组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP-2）之间的动态平衡参与调节巩膜细胞外基质（extracellular material,ECM）重塑,巩膜的病理改变是近视发生的重要机制,有报道形觉剥夺性近视巩膜MMP-2含量增加而TIMP-2含量减少。 许多药物在动物实验中证明对近视有抑制作用,但临床应用仍未有重大突破。生长因子在许多眼科疾病的作用逐渐被人们认识,但其口服难吸收,无法通过血-视网膜屏障,效力维持时间短,经常性眼内注射给药可引起并发症。人们设想把生长因子与基因治疗相结合,生长因子基因真核表达载体构建及基因转染
二、转化生长因子抑制视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转化生长因子抑制视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
（1）姜黄素、白花丹醌、藏红花酸对增殖性玻璃体视网膜病变抗增殖的效果比较及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 姜黄素、白花丹醌、藏红花酸对FGF-2 诱导的体外人视网膜色素上皮细胞增殖抑制的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 白花丹醌对FGF-2 诱导的体外人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和侵袭抑制的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 白花丹醌防治兔眼增殖性玻璃体视网膜病变的在体实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 增殖性玻璃体视网膜病变的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）华蟾素抑制人脐静脉血管内皮细胞血管生成的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中药对脉络膜新生血管抑制作用的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）H2S保护视网膜色素上皮细胞氧化损伤的自噬和凋亡机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 视网膜病变AMD |
| 1.1.1 视网膜结构与功能简介 |
| 1.1.2 现代科技对视网膜的影响 |
| 1.1.3 视网膜疾病AMD的常见病因 |
| 1.1.4 AMD体外细胞模型 |
| 1.2 自噬与视网膜疾病AMD |
| 1.2.1 自噬的发生及功能 |
| 1.2.2 自噬的分子机制 |
| 1.2.3 自噬与氧化应激 |
| 1.2.4 自噬与AMD |
| 1.3 细胞自噬的研究方法 |
| 1.3.1 自噬的干预手段 |
| 1.3.2 自噬的检测方法 |
| 1.4 细胞凋亡与视网膜疾病AMD |
| 1.4.1 凋亡机制与功能 |
| 1.4.2 凋亡与氧化应激 |
| 1.4.3 凋亡与AMD |
| 1.4.4 凋亡与自噬的关系 |
| 1.5 H2S与视网膜疾病AMD |
| 1.5.1 H_2S的产生及其生理功能 |
| 1.5.2 H2S与AMD |
| 1.6 选题背景及研究意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 化合物 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 细胞冻存与复苏 |
| 2.3.2 细胞传代及培养 |
| 2.3.3 细胞活性检测实验 |
| 2.3.4 细胞形态学观察 |
| 2.3.5 细胞凋亡检测 |
| 2.3.6 Hoechst33342/PI双染法快速检测细胞死亡 |
| 2.3.7 细胞内自噬标志蛋白检测实验 |
| 2.3.8 细胞内自噬泡检测实验 |
| 2.3.9 细胞内自噬流检测实验 |
| 2.3.10 数据分析及统计 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 H_2S对H_2O_2诱导的ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用 |
| 3.1.1 H_2S缓解H_2O_2诱导的ARPE-19细胞增殖抑制 |
| 3.1.2 H_2S改善H_2O_2诱导的ARPE-19细胞形态损伤 |
| 3.1.3 H_2S降低ARPE-19细胞内活性氧水平 |
| 3.1.4 H_2S减少H_2O_2诱导的ARPE-19细胞凋亡 |
| 3.1.5 H_2S挽救H_2O_2诱导的ARPE-19细胞死亡 |
| 3.1.6 H_2S抑制H_2O_2诱导的ARPE-19细胞自噬 |
| 3.1.7 自噬抑制缓解H_2O_2诱导的ARPE-19细胞增殖抑制 |
| 3.1.8 自噬抑制改善H_2O_2诱导的ARPE-19细胞形态学损伤 |
| 3.1.9 自噬抑制降低H_2O_2诱导的ARPE-19细胞凋亡率 |
| 3.1.10 自噬抑制减少H_2O_2诱导的ARPE-19细胞死亡 |
| 3.2 H_2S对 UV辐照诱导细胞氧化损伤的保护作用 |
| 3.2.1 H_2S缓解UV辐照诱导的ARPE-19细胞损伤 |
| 3.2.2 H_2S减少UV辐照诱导的ARPE-19细胞凋亡 |
| 3.2.3 H_2S降低UV辐照诱导的ARPE-19细胞活性氧水平 |
| 3.2.4 H_2S影响UV辐照诱导的ARPE-19细胞自噬 |
| 3.2.5 自噬抑制缓解UV辐照诱导的ARPE-19细胞增殖抑制 |
| 3.2.6 自噬抑制减少UV辐照诱导的ARPE-19细胞凋亡 |
| 3.2.7 自噬抑制减少UV辐照诱导的ARPE-19细胞死亡 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 氧化应激模型 |
| 4.2 保护氧化损伤缓解AMD病发 |
| 4.3 H_2S影响细胞内氧化应激的作用机制 |
| 4.4 H_2S影响细胞内自噬水平的直接或间接作用机制的探讨 |
| 4.5 细胞内自噬与凋亡的相互串扰 |
| 4.6 展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制糖尿病视网膜病变的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 miR-130a通过调控TNF-α/SOD1缓解高糖诱导的视网膜色素上皮细胞死亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二章 miR-130a通过调控TNF-α/SOD1对小鼠糖尿病视网膜病变的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 miR-130a在DR患者血清中的表达及对DR病变生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 总结与展望 |
| 综述 糖尿病视网膜病变对视网膜色素上皮(RPE)细胞功能影响的研究进展 |
| 引言 |
| 一、糖尿病视网膜病变(DR)对RPE细胞的屏障功能的影响 |
| 二、糖尿病视网膜病变(DR)对RPE细胞的分泌功能的影响 |
| 三、总结、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 532nm倍频激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管模型的建立 |
| 1. 实验动物、仪器、耗材与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 532nm倍频激光建立CNV模型 |
| 2.3 眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化 |
| 2.4 制备病理学标本 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学检测 |
| 3. 图像分析与统计学方法 |
| 3.1 眼底照、FFA及ICGA图像 |
| 3.2 HE染色图像 |
| 3.3 免疫组化图像 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4. 结果 |
| 4.1 眼底照、FFA与ICGA结果 |
| 4.2 HE染色结果 |
| 4.3 CD105免疫组化结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 CNV模型建立的方法 |
| 5.2 532nm倍频激光诱导BN大鼠建立实验性CNV模型的机制 |
| 5.3 532nm倍频激光诱导BN大鼠CNV模型的评价 |
| 6. 结论 |
| 第二章 姜黄素通过AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路抑制BN大鼠CNV的实验研究 |
| 1. 实验动物、仪器、耗材与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器与耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.0 实验药物配制 |
| 2.1 实验分组及给药 |
| 2.2 532nm倍频激光建立实验性CNV模型 |
| 2.3 眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化 |
| 2.4 病理学标本制备 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学检测 |
| 2.7 RT-qPCR检测mRNA表达 |
| 2.8 Westernblot检测蛋白表达 |
| 3. 图像分析与统计学方法 |
| 3.1 眼底照、FFA与ICGA图像 |
| 3.2 HE染色图像 |
| 3.3 免疫组化图像 |
| 3.4 RT-qPCR结果分析 |
| 3.5 Westernblot结果分析 |
| 3.6 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 眼底照、FFA与ICGA结果 |
| 4.2 HE染色结果 |
| 4.3 免疫组化结果 |
| 4.4 RT-qPCR结果 |
| 4.5 Westernblot结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 新生血管与中药单体 |
| 5.2 姜黄与姜黄素 |
| 5.3 姜黄素与眼部新生血管 |
| 5.4 CNV的中医认识 |
| 5.5 姜黄素抑制CNV的机制 |
| 6. 结论 |
| 第三章 姜黄素对CoCl_2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型中AKT、HIF-1α和VEGF因子的影响 |
| 1. 实验细胞、试剂、药物及仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验药物及溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 ARPE-19细胞复苏、传代与冻存 |
| 2.2 造模试剂CoCl_2、实验药物姜黄素及阳性对照药雷珠单抗浓度的筛选 |
| 2.3 实验分组与干预 |
| 2.4 CCK-8法检测实验各组ARPE-19细胞的活性 |
| 2.5 RT-qPCR检测 |
| 2.6 Westernblot检测 |
| 3. 结果分析与统计学方法 |
| 3.1 CCK-8检测细胞活性结果分析 |
| 3.2 RT-qPCR结果分析 |
| 3.3 Westernblot结果分析 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 正常ARPE-19细胞形态 |
| 4.2 CoCl_2对ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.3 姜黄素对ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.4 雷珠单抗对CoCl_2诱导的ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.5 RT-qPCR结果 |
| 4.6 Westernblot结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 细胞缺氧模型的建立 |
| 5.2 CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧模型的机制 |
| 5.3 姜黄素对CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧的保护作用 |
| 6. 结论 |
| 第四章 非接触共培养体系观察ARPE-19细胞姜黄素的条件培养液对HUVEC细胞形态学的影响 |
| 1. 实验细胞、药物、试剂及仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验试剂的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 HUVEC细胞株复苏培养、传代与冻存 |
| 2.2 CCK-8检测 |
| 2.3 划痕实验检测细胞水平迁移 |
| 2.4 Transwell小室法检测细胞垂直迁移 |
| 2.5 Transwell小室法检测细胞侵袭 |
| 2.6 Matrigel基质胶法检测细胞管腔形成 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 正常HUVEC细胞形态 |
| 4.2 CCK-8结果 |
| 4.3 划痕实验细胞水平迁移结果 |
| 4.4 Transwell小室实验细胞垂直迁移结果 |
| 4.5 Transwell小室实验细胞侵袭结果 |
| 4.6 Matrigel基质胶实验细胞管腔形成结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 细胞迁移 |
| 5.2 细胞侵袭 |
| 5.3 细胞管腔形成 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 创新性 |
| 不足与展望 |
| 综述一 脉络膜新生血管的发病机制及中西医治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 姜黄素在眼科疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间学术表现 |
| 致谢 |
| 附: 查新报告 |
（6）水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 水蛭提取液的制备和主要成分分析的初步研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法与步骤 |
| 1.2.1 水蛭提取液的制备和含量检测 |
| 1.2.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 水蛭提取液的制备和水蛭素含量测定 |
| 1.3.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液主要成 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 水蛭提取液的制备和检测的初步研究 |
| 1.4.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 第二部分 水蛭提取液对WERI-Rb-1 细胞活性、周期、凋亡、侵袭的影响 |
| 2.1 实验细胞、试剂及配制、仪器设备和耗材 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要实验设备仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养、传代和冻存 |
| 2.2.1 细胞培养和传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 CCK-8法检测水蛭提取液对细胞的活性影响 |
| 2.3.2 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞周期的影响 |
| 2.3.3 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.4 水蛭提取液对 WERI-RB-1 侵袭能力的影响 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 不同浓度药物对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.5.2 流式细胞技术检测药物对细胞周期的影响 |
| 2.5.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡的影响 |
| 2.5.4 transwell 实验检测水蛭提取液对 WER-Rb-1 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.6.2 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞周期的影响 |
| 2.6.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡影响 |
| 2.6.4 细胞凋亡与增殖 |
| 2.6.5 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞侵袭能力的影响 |
| 第三部分 水蛭提取液对WER-Rb-1 细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究 |
| 3.1 实验细胞、试剂、耗材和仪器设备 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要实验设备仪器 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 Elisa 实验检测水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞表达 VEGF 的影响 |
| 3.2.2 HIF-1a、MMP-9、VEGFR2 的实时定量RT-PCR检测 |
| 3.2.3 Western Blot法检测HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白表达 |
| 3.3 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Elisa 检测培养基上清中 VEGF 蛋白的表达 |
| 3.4.2 HIF-1a基因表达 |
| 3.4.3 MMP-9基因表达 |
| 3.4.4 Western Blot 检测各组 PI3K 和 p-AKT 蛋白的表达 |
| 3.4.5 Western Blot 检测各组 HIF-1a 和 MMP-9 蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 VEGF、HIF-1a和 MMP-9 在肿瘤生成中的作用 |
| 3.5.2 PI3K/AKT信号通路在肿瘤疾病中的作用 |
| 3.5.3 水蛭素通过VEGF/PI3K/AKT通路及HIF-1a、MMP-9 因子抑制RB细胞 |
| 第四部分 水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响 |
| 4.1 实验细胞、试剂和仪器设备 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验设备仪器 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性的影响 |
| 4.2.2 RT- PCR 检测 VEGF 和 VEGFR2 基因表达 |
| 4.2.3 Western Blot法检测VEGF、VEGFR2 的蛋白表达 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性及抑制率的影响 |
| 4.4.2 VEGFR2基因表达 |
| 4.4.3 VEGF基因表达 |
| 4.4.4 水蛭提取液对 HUVEC 细胞表达 VEGF 和 VEGFR2 蛋白的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 VEGF和 VEGFR2对血管生成的调控 |
| 4.5.2 水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和 VEGFR2的影响 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件 1 文献综述 水蛭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二 文献综述 视网膜母细胞瘤的生物标志物 |
| 参考文献 |
| 附件3 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
| 附件4 倒置显微镜下细胞形态 |
（7）PI3Kδ在PVR中的作用机制及视网膜病变治疗新途径研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 PVR和 PDR简介 |
| 1.1.1 增殖性玻璃体视网膜病变(PVR) |
| 1.1.2 增殖性糖尿病型视网膜病变(PDR) |
| 1.1.3 PVR和 PDR临床治疗策略 |
| 1.2 CRISPR-Cas9 基因编辑技术 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas9 作用原理 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas9 在基因治疗中的应用 |
| 1.3 上皮间充质转化(EMT) |
| 1.3.1 EMT发生过程 |
| 1.3.2 EMT调控网络 |
| 1.3.3 EMT在眼科疾病中的信号调控 |
| 1.4 Capilliposide B和 Chalcomoracin天然化合物简介 |
| 1.5 本文的研究内容与意义 |
| 2 磷酸肌醇3 激酶δ在PVR模型中调控视网膜色素上皮细胞增殖迁移的作用机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 材料和实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 SgRNA设计与目标基因载体克隆 |
| 2.2.5 慢病毒的包装 |
| 2.2.6 p110δ的重新表达 |
| 2.2.7 Western Blotting |
| 2.2.8 免疫荧光 |
| 2.2.9 MTT法 |
| 2.2.10 细胞增殖试验 |
| 2.2.11 细胞迁移试验 |
| 2.2.12 胶原收缩试验 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PI3Kδ在 RPE中高度表达 |
| 2.3.2 CRIS PR/Cas9 建立p110δ敲减细胞系 |
| 2.3.3 P110δ敲减可减轻玻璃体诱导的AKT和 MDM2 的激活以及p53 的抑制 |
| 2.3.4 P110δ的再表达恢复了玻璃体诱导的AKT和 MDM2 的激活和p53 的减少 |
| 2.3.5 PI3Kδ的化学抑制有效地阻止了玻璃体诱导的Akt和 Mdm2 的激活和 p53 的减少 |
| 2.3.6 PI3Kδ失活可防止玻璃体刺激的RPEs增殖 |
| 2.3.7 PI3Kδ的失活阻碍了玻璃体诱导的RPEs的迁移 |
| 2.3.8 PI3Kδ失活可消除玻璃体引起的RPE收缩 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 基于CRISPR-Cas9基因编辑技术研究PI3Kδ信号转导环在PVR疾病中的关键作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 材料和实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 细胞培养 |
| 3.2.4 DNA的构建 |
| 3.2.5 慢病毒包装 |
| 3.2.6 Western blotting |
| 3.2.7 免疫荧光检测 |
| 3.2.8 细胞迁移实验 |
| 3.2.9 荧光素酶测定-PI3Kδ报告基因 |
| 3.2.10 实验性PVR模型建立 |
| 3.2.11 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PI3Kδ失活阻止TGF-β2 诱导的Akt激活和 Mdm2和NF-κB/p65 的蛋白表达 |
| 3.3.2 PI3Kδ失活可防止TGF-β2诱导的EMT |
| 3.3.3 阻断Mdm2 可抑制TGF-β2 诱导的Akt激活,p110δ和NF-κB/p65 的表达和细胞EMT |
| 3.3.4 NF-κB/p65 的消耗减弱了TGF-β2 诱导的Akt激活,p110δ和 Mdm2 的表达以及抑制EMT |
| 3.3.5 PI3Kδ的失活阻止了TGF-β2 诱导的ARPE-19 细胞迁移 |
| 3.3.6 抑制PI3Kδ可防止实验性PVR |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 Chalcomoracin在预防治疗PVR疾病中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 材料与实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 Western blotting |
| 4.2.5 细胞活力测定 |
| 4.2.6 形态学观察 |
| 4.2.7 细胞增殖测定 |
| 4.2.8 细胞迁移测定 |
| 4.2.9 胶原蛋白收缩测定 |
| 4.2.10 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 玻璃体诱导ARPE-19 细胞中AKT的活化并抑制p53 的表达 |
| 4.3.2 CMR可阻止玻璃体诱导的AKT激活和p53 的降低 |
| 4.3.3 CMR预防玻璃体引起的ARPE-19 增殖 |
| 4.3.4 CMR阻断玻璃体诱导的ARPE-19 迁移 |
| 4.3.5 CMR阻滞玻璃体引起的ARPE-19 收缩 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 Capilliposide B在预防治疗PDR疾病中的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 材料与实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 细胞培养 |
| 5.2.4 免疫荧光 |
| 5.2.5 Western blot |
| 5.2.6 细胞活力测定 |
| 5.2.7 形态学观察 |
| 5.2.8 细胞迁移测定 |
| 5.2.9 Tube formation实验 |
| 5.2.10 统计分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CPS-B阻止VEGF诱导的VEGFR2 信号转导 |
| 5.3.2 CPS-B可阻止VEGF诱导的HREC增殖 |
| 5.3.3 CPS-B阻断VEGF诱导的HREC迁移 |
| 5.3.4 CPS-B阻断VEGF诱导的HRECs管形成 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 6 全文总结 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（8）藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的防治效果及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 藏红花酸对体外培养的ARPE-19 细胞在PDGF-BB诱导下增殖,迁移及凋亡的影响及机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体(PDGFR)磷酸化和下游的PI3k/Akt和 MAPK信号通路激活 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 藏红花酸治疗兔眼玻璃体视网膜病变的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 增生性玻璃体视网膜病变模型的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）散血明目片对兔PVR中MAPK及PI3K/Akt信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.指标检测 |
| 4.统计学处理 |
| 第二部分 结果及分析 |
| 1.观察各组兔眼前节、玻璃体及眼底情况 |
| 2.光镜下观察各组视网膜情况 |
| 3.免疫组化法检测视网膜增殖膜组织PI3K、Akt、MEK、P38MAPK表达情况 |
| 4.Western blot 法检测视网膜增殖膜组织中 PI3K、Akt、MEK、P38MAPK 蛋白的相对表达量 |
| 5.Western blot 检测各组增殖膜中 PI3K、AKT、MEK、P38MAPK蛋白表达图谱 |
| 6.qPCR 检测视网膜增殖膜中 PI3K、AKT、MEK、P38MAPK mRNA 的表达 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.中医对PVR的认识及其研究 |
| 2.PVR模型的建立 |
| 3.PVR中 MAPK及 PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 4.散血明目片防治PVR的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间科研奖励、发表论文及着作情况 |
| 致谢 |
（10）脑源性神经营养因子及转化生长因子-β2在形觉剥夺性近视中作用的实验研究（论文提纲范文）
| 论文 脑源性神经营养因子及转化生长因子-β_2在形觉剥夺性近视中作用的实验研究 |
| 引言 |
| 第一部分 脑源性神经营养因子在形觉剥夺性近视表达的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 转化生长因子-β_2在形觉剥夺性近视表达的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在形觉剥夺性近视巩膜表达的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四部分 脑源性神经营养因子和转化生长因子-β_2基因真核表达载体构建及基因转染 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 生长因子在形觉剥夺性近视形成中的作用 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表的论文及承担的科研项目 |
| 致谢 |
| 英文缩写词索引 |
四、转化生长因子抑制视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究（论文参考文献）
- [1]姜黄素、白花丹醌、藏红花酸对增殖性玻璃体视网膜病变抗增殖的效果比较及机制研究[D]. 张阳. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]华蟾素抑制人脐静脉血管内皮细胞血管生成的实验研究[D]. 郝雨檬. 河北医科大学, 2021(02)
- [3]H2S保护视网膜色素上皮细胞氧化损伤的自噬和凋亡机制研究[D]. 胡黎明. 兰州大学, 2021(09)
- [4]miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制糖尿病视网膜病变的作用机制研究[D]. 席晓婷. 昆明医科大学, 2020
- [5]姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究[D]. 陈水龄. 中国中医科学院, 2020(01)
- [6]水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究[D]. 李园媛. 成都中医药大学, 2020(01)
- [7]PI3Kδ在PVR中的作用机制及视网膜病变治疗新途径研究[D]. 韩昊特. 浙江大学, 2021(01)
- [8]藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的防治效果及分子机制研究[D]. 张赫. 河北医科大学, 2020(01)
- [9]散血明目片对兔PVR中MAPK及PI3K/Akt信号通路的影响[D]. 刘晓清. 湖南中医药大学, 2019(02)
- [10]脑源性神经营养因子及转化生长因子-β2在形觉剥夺性近视中作用的实验研究[D]. 闫磐石. 郑州大学, 2005(08)