一、EFFECT OF ELECTROACUPUNCTURE ON SERUM IL-1β AND TNF-α CONTENTS IN CEREBRAL ISCHEMIA-REPERFUSION RATS（论文文献综述）
侯坤[1]（2021）在《IL-4诱导小胶质细胞向M2表型极化对缺血性卒中的影响及其机制研究》文中指出背景和目的:小胶质细胞是神经系统的固有免疫细胞,在中枢神经系统多种疾病的发生、发展中扮演重要的角色。缺血性脑卒中发生后,受缺血部位微环境的动态变化的影响,小胶质细胞的不同极化表型对损伤的发展和神经恢复的结局是至关重要的。既往研究发现,人为将M1型小胶质细胞诱导成M2型小胶质细胞细胞,可减轻短暂性脑缺血小鼠模型的梗死面积并促进神经功能恢复。小胶质细胞具有不同的极化表型,可以解释小胶质细胞在同一疾病的作用双重性。因此,有目的地抑制小胶质细胞由M2型向M1型极化,或诱导M1型向M2型极化,或降低M1型/M2型的比值,是缺血性脑卒中治疗的重要研究方向之一。IL-4主要由活化的T细胞产生,对体内多种免疫细胞均有调节作用。IL-4可刺激巨噬细胞和小胶质细胞向抗炎表型转化,从而抑制炎症进展,促进组织修复并发挥神经保护作用。目前,IL-4已应用于脑出血、脊髓损伤、癫痫、阿尔兹海默病等诸多神经系统疾病的研究。本研究拟探讨IL-4在缺血性卒中的治疗价值。方法:1、构建大鼠脑缺血再灌注（transient middle cerebral artery occlusion,t MCAO）模型,分假手术组与模型组,ELISA法检测大鼠外周血TNF-α、IFN-γ、IL-4、TGF-β和BDNF等炎症因子的变化。免疫荧光检测大鼠小胶质细胞极化表型的变化。取脑梗死患者和健康成人对照的外周血,ELISA法检测上述炎症因子的变化。2、构建大鼠t MCAO模型,分为假手术组、模型组、IL-4组和IL-4+AS1517499组。3天后予神经功能评分。取大鼠外周血,检测炎症因子的变化。处死大鼠,TTC染色,计算梗死容积,免疫荧光检测大鼠小胶质细胞极化表型的变化,TUNEL染色检测缺血半暗带组织细胞凋亡,Nissl染色法检测缺血半暗带神经元损伤。3、培养HAPI小胶质细胞系,对小胶质细胞进行氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）处理,分为Control组、OGD组、OGD+IL-4组、OGD+IL-4+AS1517499组。ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β,IL-2,TNF-α,IL-10,TGF-β,BDNF等炎症因子的变化。Western blot检测JAK1、p-JAK1、STAT6、p-STAT6的表达水平变化。免疫荧光染色,检测小胶质细胞系极化表型的变化。荧光微球法检测小胶质细胞内吞能力的变化。4、培养RN-C神经元细胞系,建立神经元OGD培养模型,与预处理后的小胶质细胞共培养,分为Control组,OGD组,IL-4组,IL-4+AS1517499组。流式细胞术评价RN-C的凋亡,Western blot法检测RN-C凋亡相关蛋白的表达。5、统计分析使用Graph Pad Prism9进行。连续变量以“均数±标准差”表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。神经功能评估采用非参数检验（Kruskal-Wallis检验）,多组间比较采取Dunn’s多组比较,P<0.05被认为有统计学差异。结果:1、与健康对照相比,脑梗塞患者血液中IFN-γ、TNF-α、TGF-β、BDNF和IL-4均明显升高,其中IFN-γ、TNF-α、BDNF和IL-4梗塞后第一天升高最明显,梗塞后第三天开始下降,但仍明显高于健康对照。2、相较于假手术组,模型组大鼠外周血中IFN-γ、TNF-α和IL-4水平均上升,BDNF水平下降。给予IL-4后,IL-1β,IL-2,TNF-α水平下降,IL-10,TGF-β,BDNF水平上升,联合给予IL-4+AS1517499后,IL-1β,IL-2,TNF-α水平上升,IL-10,TGF-β,BDNF水平下降。3、与假手术组相比,模型组缺血半暗带中小胶质细胞活化增加,M1与M2表型均增加。给予IL-4后,M2表型小胶质细胞增多,给予IL-4+AS1517499后,M2表型小胶质细胞减少。4、相较于假手术组,各模型组均出现明显的脑梗死。与模型组相比,给予IL-4后,脑梗死容积减少,联合给予IL-4+AS1517499后,大鼠脑脑梗死容积增加。5、TUNEL染色法检测细胞凋亡,与假手术组相比,模型组缺血半暗带细胞凋亡明显增加,给予IL-4后,细胞凋亡显着减少,同时给予IL-4+AS1517499后,凋亡明显增加。尼氏染色法检测神经元修复情况,与假手术组相比,模型组神经元尼氏小体明显减少,给予IL-4后尼氏小体增加,给予IL-4+AS1517499后,尼氏小体减少。6、与正常组和OGD组相比,给予IL-4后,CD163表达上升,给予IL-4+AS1517499后,CD163表达下降。与正常组和OGD组相比,给予IL-4后,小胶质细胞JAK1磷酸化（p-JAK1）增加、STAT6磷酸化（p-STAT6）增加,给予STAT6磷酸化抑制剂AS1517499后,JAK1磷酸化水平无变化,STAT6磷酸化水平降低。与正常组和OGD组相比,给予IL-4后,IL-1β、IL-2、TNF-α表达显着下调,IL-10,TGF-β,BDNF表达显着上升。给予IL-4+AS1517499后,IL-1β、IL-2、TNF-α表达上升,IL-10,TGF-β,BDNF表达下降。7、与正常组和OGD组相比,给予IL-4后,小胶质细胞的内吞能力增加,给予AS1517499后,内吞作用降低。8、在小胶质细胞、神经元共培养模型中,与Control组相比,OGD组RN-C细胞明显增加,IL-4处理后,RN-C的凋亡明显减少,凋亡蛋白表达下调,与IL-4组相比,IL-4+AS1517499组凋亡增加,凋亡蛋白表达增加。结论:1、IL-4通过JAK1-p JAK1-STAT6-p STAT6信号通路促进小胶质细胞向M2表型极化。2、IL-4促进小胶质细胞向M2表型极化,对缺血性卒中大鼠发挥神经保护作用。3、给予IL-4后,小胶质细胞分泌的促炎因子（IL-1β,IL-2,TNF-α）下降,抗炎因子（IL-10,TGF-β,BDNF）上升,吞噬能力增强,进而减少神经元凋亡与损伤,发挥神经保护作用。
Jing-Jun Zhao,Zheng-Hui Wang,Ying-Jie Zhang,Wen-Jing Wang,Ai-Fang Cheng,Pei-Jing Rong,Chun-Lei Shan[2]（2022）在《The mechanisms through which auricular vagus nerve stimulation protects against cerebral ischemia/reperfusion injury》文中研究表明Previous studies have shown that vagus nerve stimulation can improve patients’ locomotor function.The stimulation of the auricular vagus nerve,which is the only superficial branch of the vagus nerve,may have similar effects to vagus nerve stimulation.However,the precise mechanisms remain poorly understood.In this study,rat models of cerebral ischemia/reperfusion injury were established by modified Longa ligation.Twenty-four hours later,7-day auricular vagus nerve stimulation was performed.The results showed that auricular vagus nerve stimulation promoted the secretion of acetylcholine,inhibited the secretion of interleukin-1β,interleukin-6,and tumor necrosis factor-α,and reduced connexin 43 phosphorylation in the ischemic penumbra and motor cortex,promoting locomotor function recovery in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.These findings suggested that auricular vagus nerve stimulation promotes the recovery of locomotor function in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury by altering the secretion of acetylcholine and inflammatory factors and the phosphorylation of connexin 43.This study was approved by the Animal Use and Management Committee of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine on November 8,2019（approval No.PZSHUTCM191108014）.
张继瑶[3]（2021）在《电针预处理调控肠道菌群与Th17/Treg免疫平衡降低大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制研究》文中研究指明实验一电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群结构的影响目的:观察电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠神经功能和肠道菌群结构的影响。方法:将36只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组,即假手术组、模型组、电针预处理组,每组12只。电针预处理组给予2周的百会穴和足三里穴电针预处理,其余两组仅给予同等条件的抓取。制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,激光多普勒血流监测仪监测缺血侧脑血流变化,缺血2h后拔出鱼线恢复再灌注。再灌注12h、1d、3d、7d,采用改良神经功能缺损评分评价大鼠的神经功能、大小鼠抓力测定仪对大鼠的前肢抓握力量进行测定并统计和记录大鼠再灌注7 d内的存活率;再灌注7 d,采用TTC染色测定脑梗死体积,应用HE染色观察缺血侧皮层及结肠组织病理损伤程度,应用高通量16S rDNA V3-V4区测序分析肠道菌群多样性。结果:1.改良神经功能缺损评分:再灌注12 h、1d、3d、7 d,与假手术组比较,模型组大鼠改良神经功能缺损评分显着升高（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠改良神经功能缺损评分显着降低（P<0.05）。2.前肢抓握力量测试:再灌注12 h、1d、3d、7 d,与假手术组比较,模型组大鼠前肢抓握力量显着降低（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠前肢抓握力量显着升高（P<0.05）。3.存活率:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠存活率（46.15%）显着降低（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠存活率（80.00%）显着升高（P<0.05）。4.TTC染色:再灌注7d,与假手术组比较,模型组大鼠脑梗死体积显着增大（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组脑梗死体积显着缩小（P<0.05）。5.HE染色:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显加重;与模型组比较,电针预处理组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显减轻。6.16S rDNA V3-V4 区测序:从门水平上看,与假手术组比较,模型组大鼠盲肠内容物内变形菌门（Proteobacteria）,TM7和柔壁菌门（Tenericutes）的相对丰度显着升高（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠盲肠内容物内变形菌门（Proteobacteria）,TM7和柔壁菌门（Tenericutes）的相对丰度显着降低（P<0.05）。从科水平上看,与假手术组比较,模型组大鼠盲肠内容物内毛螺菌科（Lachnospiraceae）和双歧杆菌科（Bifidobaceartaceie）的相对丰度显着降低（P<0.05）,明串珠菌科（Leuconostocaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的相对丰度显着升高（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠盲肠内容物内明串珠菌科（Leuconostocaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的相对丰度显着降低（P<0.05）。从属水平上看,与假手术组比较,模型组大鼠盲肠内容物内乳酸杆菌（Lactobacillus）,粪球菌属（Coprococcus）,双歧杆菌属（Bifidobacterium）,布劳特氏菌属（Blautia）和普雷沃氏菌（Prevotella）的相对丰度显着降低（P<0.05）,ClostridaceaeClotridium和瘤胃球菌属[Ruminococcus]的相对丰度显着升高（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠盲肠内容物内乳酸杆菌（Lactobacillus）,布劳特氏菌属（Blautia）和普雷沃氏菌（Prevotella）的相对丰度显着升高（P<0.05）,ClostridiaceaeClostridium和瘤胃球菌属[Ruminococcus]的相对丰度显着降低（P<0.05）。肠道菌群与mNSS评分相关性分析显示,在门水平上,变形菌门（Proteobacteria）、TM7和柔壁菌门（Tenericutes）的相对丰度与mNSS评分呈正相关（P<0.05）;在科水平上,明串珠菌科（Leuconostocaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的相对丰度与mNSS评分呈正相关（P<0.05）;在属水平上,ClostridiaceaeClostridium和瘤胃球菌属Ruminococcus]的相对丰度与mNSS评分呈正相关（P<0.05）,乳酸杆菌（Lactobacillus）,布劳特氏菌属（Blautia）和普雷沃氏菌（Prevotella）的相对丰度与mNSS评分呈负相关（P<0.05）。结论:电针预处理可下调脑缺血/再灌注大鼠盲肠内容物内变形菌门（Proteobacteria）,TM7、柔壁菌门（Tenericutes）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、肠杆 菌科（Enter obacteriaceae）、Clostridiaceae Clostridium和瘤胃球菌属[Ruminococcus]的相对丰度,上调乳酸杆菌（Lactobacillus）、布劳特氏菌属（Blautia）和普雷沃氏菌（Prevotella）的相对丰度,减轻缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度,缩小脑梗死体积,降低死亡率及神经功能缺损。实验二电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠Th17/Treg免疫平衡的影响目的:观察电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠Th17/Treg免疫平衡及相关炎症因子表达的影响。方法:将36只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组,即假手术组、模型组、电针预处理组,每组12只。电针预处理组给予2周的百会穴和足三里穴电针预处理,其余两组仅给予同等条件的抓取。制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,激光多普勒血流监测仪监测缺血侧脑血流变化,缺血2 h后拔出鱼线恢复再灌注。再灌注7 d,采用免疫组化检测缺血侧皮层、结肠组织IL-17A、IL-10蛋白的表达,采用Western blotting检测缺血侧皮层和结肠组织中IL-17A、IL-10蛋白的表达,及缺血侧皮层、脾脏和胸腺组织中RORγt、Foxp3蛋白的表达,应用Elisa测定大鼠腹主动脉血清IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-βl的含量,分析缺血侧皮层RORγt、Foxp3蛋白表达与mNSS评分的相关性。结果:1.免疫组化:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织中IL-17A,IL-10蛋白的平均光密度值显着升高（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠缺血侧皮层及结肠组织中IL-17A蛋白的平均光密度值显着降低,IL-10蛋白的平均光密度值显着升高（P<0.05）。2.IL-17A、IL-10蛋白表达:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织内IL-17A、IL-10蛋白表达量显着增加（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠缺血侧皮层及结肠组织内IL-17A蛋白表达量显着减少,IL-10蛋白表达量显着增加（P<0.05）。3.RORγt、Foxp3蛋白表达:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层、脾脏和胸腺组织内RORγt、Foxp3蛋白表达量显着增加（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠缺血侧皮层、脾脏和胸腺组织内RORγt蛋白表达量显着减少,Foxp3蛋白表达量显着增加（P<0.05）。4.血清Elisa:再灌注7d,与假手术组比较,模型组大鼠腹主动脉血清内炎性因子IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1的含量均显着增加（P<0.05）;与模型组比较,电针预处理组大鼠腹主动脉血清内促炎因子IL-17A、IL-23含量显着减少,抗炎因子IL-10、TGF-β1的含量显着增加（P<0.05）。5.RORγt、Foxp3蛋白与mNSS评分相关性分析:再灌注7d,缺血侧皮层RORγt、Foxp3蛋白的表达与mNSS评分呈正相关（P<0.05）;电针干预下,缺血侧皮层RORγt蛋白的表达与mNSS评分呈正相关（P<0.05）,Foxp3蛋白的表达与mNSS评分呈负相关（P<0.05）。结论:1.电针预处理可下调缺血侧皮层及结肠组织内IL-17A表达,上调IL-10表达,降低外周IL-17A、IL-23含量,升高IL-10、TGF-β1含量,减轻脑缺血后肠道-中枢炎症损伤;2.电针预处理可下调缺血侧皮层、脾脏和胸腺组织内RORγt表达、上调Foxp3表达,调控Th17/Treg免疫平衡,发挥脑-肠保护作用。实验三电针预处理通过肠道菌群诱导脑缺血耐受的免疫机制研究目的:观察菌群剔除及菌群移植（电针预处理2周后菌群）对脑缺血/再灌注大鼠神经功能及相关炎症因子表达的影响。方法:将60只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为5组,即假手术组、模型组、ABX-Pre+模型+FMT组、ABX-Pre+模型+PBS组、ABX+模型组,每组12只。整个实验过程中,假手术组、模型组给予无菌饮水;ABX-Pre+模型+FMT组、ABX-Pre+模型+PBS组在造模前给予2周的抗生素饮水,模型制备后给予无菌饮水;ABX+模型组在造模前给予2周的抗生素饮水,模型制备后继续给予抗生素饮水。制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型,激光多普勒血流监测仪监测缺血侧脑血流变化,缺血2 h后拔出鱼线恢复再灌注。再灌注12 h、1d、3d、7 d,采用改良神经功能缺损评分评价大鼠神经功能、大小鼠抓力测定仪对大鼠的前肢抓握力量进行测定;再灌注7 d,应用HE染色观察缺血侧皮层及结肠组织病理损伤程度,采用免疫组化检测缺血侧皮层IL-17A、IL-10蛋白的表达,应用Elisa测定大鼠腹主动脉血清 IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1 的含量。结果:1.改良神经功能缺损评分:再灌注12 h、1d、3d、7 d,与假手术组比较,模型组大鼠改良神经功能缺损评分显着升高（P<0.05）;与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠改良神经功能缺损评分显着降低（P<0.05）,ABX-Pre+模型+PBS组大鼠改良神经功能缺损评分显着升高（P<0.05）;与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠改良神经功能缺损评分显着升高（P<0.05）。2.前肢抓握力量测试:再灌注12 h、1d、3d、7 d,与假手术组比较,模型组大鼠前肢抓握力量显着降低（P<0.05）;与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠前肢抓握力量显着升高（P<0.05）,ABX-Pre+模型+PBS组大鼠前肢抓握力量显着降低（P<0.05）;与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠前肢抓握力量显着降低（P<0.05）。3.HE染色:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显加重;与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显减轻,ABX-Pre+模型+PBS组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显加重;与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠缺血侧皮层及结肠组织的病理损伤程度明显加重。4.免疫组化:再灌注7 d,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧皮层IL-17A,IL-10蛋白的平均光密度值显着升高（P<0.05）;与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠缺血侧皮层IL-17A蛋白的平均光密度值显着降低,IL-10蛋白的平均光密度值显着升高（P<0.05）,ABX-Pre+模型+PBS组大鼠缺血侧皮层IL-17A蛋白的平均光密度值显着升高,IL-10蛋白的平均光密度值显着降低（P<0.05）;与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠缺血侧皮层IL-17A蛋白的平均光密度值显着升高,IL-10蛋白的平均光密度值显着降低（P<0.05）。5.血清Elisa:再灌注7d,与假手术组比较,模型组大鼠腹主动脉血清内炎性因子IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1的含量均显着增加（P<0.05）;与模型组比较,ABX-Pre+模型+FMT组大鼠腹主动脉血清内促炎因子IL-17A、IL-23的含量显着减少,抗炎因子IL-10、TGF-β1的含量显着增加（P<0.05）,ABX-Pre+模型+PBS组大鼠腹主动脉血清内促炎因子IL-17A、IL-23的含量显着增加,抗炎因子IL-10、TGF-β1的含量显着减少（P<0.05）;与ABX-Pre+模型+PBS组比较,ABX+模型组大鼠腹主动脉血清内促炎因子IL-17A、IL-23的含量显着增加,抗炎因子IL-10、TGF-β1的含量显着减少（P<0.05）。结论:电针预处理可通过肠道菌群减轻脑缺血/再灌注大鼠缺血侧皮层和结肠组织的病理损伤程度及肠道-中枢炎症损伤,改善神经行为学功能。
周雪灵[4]（2021）在《电针调控ABIN1表达对局灶脑缺血/再灌注大鼠神经炎性损伤的影响及机制研究》文中提出在缺血性脑卒中中,梗死核心区与正常脑组织间存在一个过渡区域被称为缺血半暗带。低灌注的缺血半暗带存有濒临死亡的神经元,所以及早恢复缺血区域的血流、挽救半暗带的神经元是脑卒中治疗的重点。然而,再灌注还有助于活性氧的产生,从而激活免疫反应,导致神经炎症,加重脑组织损伤。脑缺血/再灌注后过度激活的小胶质细胞产生包括促炎因子在内的细胞毒性物质加重了神经元的损伤,受损或死亡的神经元释放“危险信号”又促进了小胶质细胞的激活。因此,抑制脑缺血/再灌注早期强烈的神经炎症是减轻缺血半暗带受损的关键。核因子κB（Nuclear factor kappa B,NF-κB）调控数百个与炎症相关的基因,是神经炎症起始、扩大的重要分子,所以抑制NF-κB的过度激活可能是有效减轻神经炎症的策略之一。A20结合抑制NF-κB激活因子1（A20-binding inhibitor of NF-κB 1,ABIN1）作为NF-κB的负性调控者,是极具潜力的抗炎分子。然而,对ABIN1的认识还很少,目前尚无ABIN1在脑缺血/再灌注中的研究报道。电针（Electroacupuncture,EA）是补充医学中一种最常见的治疗方式,已被众多研究支持具有脑保护及抗炎作用。虽然关于电针通过调控NF-κB发挥抗炎作用的研究日益增多,但电针对ABIN1的调控未见相关报道。因此,在本研究中我们首先建立大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）SD大鼠模型,检测ABIN1在大脑皮质缺血周边区的表达,并通过慢病毒介导抑制ABIN1表达,观察ABIN1沉默对大鼠神经功能缺损、脑梗死体积及神经炎症反应的影响。此外,给予MCAO/R大鼠电针治疗,并观察电针对ABIN1表达的调控,以及ABIN1沉默对电针发挥抗神经炎症、减轻脑缺血/再灌注损伤的影响。第一部分ABIN1在局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血周边区的表达及影响目的:建立局灶脑缺血/再灌注大鼠模型,检测ABIN1在大脑皮质缺血周边区的表达及对再灌注后神经炎性损伤的影响。方法:建立MCAO/R大鼠模型,SD大鼠被随机分为六组:假手术组（sham）、脑缺血/再灌注组（MCAO/R）、脑缺血/再灌注+电针组（MCAO/R+EA）、脑缺血/再灌注+假电针组（MCAO/R+sham EA）、脑缺血/再灌注+空载组（MCAO/R+LV-Scramble）、脑缺血/再灌注+ABIN1沉默组（MCAO/R+LV-sh ABIN1）,电针组给予每日一次的电针治疗。采用RT-q PCR、Western blotting分别检测ABIN1 m RNA及蛋白于不同时间点的表达;通过免疫荧光双标观察ABIN1的细胞定位;慢病毒介导沉默ABIN1的表达,应用改良神经功能缺损严重程度评分（Modified Neurological Severity Score,m NSS）及改良贴纸实验（Modified Sticky-Tape Test,MST）、TTC染色分别观察大鼠神经功能缺损、脑梗死体积,通过免疫荧光、ELISA分别检测小胶质细胞的激活及促炎因子肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）的表达,进一步探讨ABIN1在局灶脑缺血/再灌注神经炎性损伤中的作用。结果:与sham组相比,MCAO/R组于12 h至72 h ABIN1 m RNA及蛋白表达增加（P<0.01）,并于24 h达峰值,但6 h及7 d ABIN1的表达水平与sham组无明显差异（P>0.05）;与MCAO/R组相比,电针刺激促进大脑皮质缺血周边区ABIN1 m RNA及蛋白于再灌注6 h至7 d的表达进一步增加（P<0.05）,但假电针组与MCAO/R组相比无明显差异（P>0.05）。免疫荧光结果进一步表明,再灌注后24 h大脑皮质缺血周边区MCAO/R组较sham组ABIN1+细胞明显增加（P<0.01）,MCAO/R+EA组较MCAO/R组ABIN1+细胞明显增加（P<0.01）,假电针组与MCAO/R组相比无明显差异（P>0.05）;ABIN1主要与神经元及小胶质细胞共标,其中ABIN1+Neun+细胞占ABIN1+细胞的70.22±1.71%,ABIN1+Iba-1+细胞占ABIN1+细胞的26.83±2.75%,在星形胶质细胞中几乎无ABIN1的表达。通过RT-q PCR及Western blotting检测ABIN1的表达证明ABIN1基因被成功沉默。与MCAO/R组相比,MCAO/R+LV-sh ABIN1组再灌注后72 h神经功能缺损增加（P<0.05）。局灶脑缺血/再灌注后72 h TTC染色,sham组未见脑梗死,MCAO/R+LV-sh ABIN1组较MCAO/R组梗死体积增加（P<0.05）。ELISA结果表明,促炎因子（TNF-α、IL-1β、MCP-1）在MCAO/R组的浓度显着高于Sham组（P<0.01）,ABIN1沉默后这些促炎因子表达进一步增加（P<0.01）。Iba-1免疫荧光染色观察再灌注后24 h小胶质细胞,sham组小胶质细胞数量较少,多呈静息状态（分支状）;MCAO/R组大脑皮质缺血周边区小胶质细胞数目增加、胞体变大、突触减少,多呈激活状态。通过对小胶质细胞形态分析提示MCAO/R组较sham组分支末端数量及突起长度减少（P<0.01）,ABIN1沉默使小胶质细胞分支末端数量及突起长度进一步减少（P<0.01）。结论:再灌注后早期大鼠大脑皮层缺血周边区ABIN1表达上调,且电针进一步促进ABIN1的表达。神经元和小胶质细胞均为ABIN1的主要细胞来源。ABIN1沉默使神经功能缺损加重、脑梗死体积扩大、小胶质细胞的激活及促炎因子的表达增加,提示ABIN1具有抗神经炎症的作用。第二部分ABIN1在电针抗局灶脑缺血/再灌注后神经炎症中的作用目的:探讨ABIN1对电针发挥抗炎作用、抑制NF-κB信号通路的影响。方法:建立MCAO/R大鼠模型,SD大鼠被随机分为四组:脑缺血/再灌注组（MCAO/R）、脑缺血/再灌注+电针组（MCAO/R+EA）、脑缺血/再灌注+电针+空载组（MCAO/R+EA+LV-Scramble）、脑缺血/再灌注+电针+ABIN1沉默组（MCAO/R+EA+LV-sh ABIN1）,电针组给予每日一次的电针治疗。应用m NSS、MST、TTC染色观察各组大鼠神经功能缺损、脑梗死体积,通过免疫荧光、ELISA分别检测小胶质细胞激活及促炎因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达,探究ABIN1沉默对电针抑制神经炎性损伤的作用。采用Western blotting检测再灌注后24 h大脑皮质缺血周边区ABIN1、A20（又称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3,TNF inducible protein 3,TNFAIP3）、NF-κB抑制蛋白α（Inhibitor kappa B,IκBα）、p-IκBα以及胞浆和胞核NF-κB p65蛋白的表达水平;通过免疫荧光观察NF-κB p65的核转位及A20与ABIN1的共定位,免疫共沉淀进一步检测ABIN1、A20及NF-κB必须调节因子（NF-κB essential modulator,NEMO）。结果:与MCAO/R组相比,MCAO/R+EA组再灌注后72 h神经功能缺损改善（P<0.05）。MCAO/R+EA+LV-sh ABIN1组与MCAO/R+EA组相比,局灶脑缺血/再灌注72 h神经功能缺损增加（P<0.05）。再灌注后72 h TTC结果发现MCAO/R+EA组较MCAO/R组脑梗死体积显着减少（P<0.01）,MCAO/R+EA+LV-sh ABIN1组较MCAO/R+EA组脑梗死体积增加（P<0.05）。再灌注后24 h大脑皮质缺血周边区TNF-α、IL-1β及MCP-1的浓度:MCAO/R+EA组较MCAO/R组表达水平明显减少（均为P<0.01）,MCAO/R+EA+LV-sh ABIN1组较MCAO/R+EA组表达水平增加（分别为P<0.01,P<0.05,P<0.05）。再灌注后24 h Iba-1免疫荧光染色观察到MCAO/R+EA组较MCAO/R组小胶质细胞分支末端数量及突起长度增加（均为P<0.01）,MCAO/R+EA+LV-sh ABIN1组较MCAO/R+EA组分支末端数量及突起长度减少（P<0.05）。MCAO/R+EA组与MCAO/R相比A20及ABIN1蛋白表达水平增加（P<0.05）,p-IκBα/IκBα显着减少（P<0.01）,胞核/胞浆NF-κB p65显着降低（P<0.01）、核转位减少;MCAO/R+EA+LV-sh ABIN1组与MCAO/R+EA组相比ABIN1蛋白表达水平减少（P<0.01）,p-IκBα/IκBα增加（P<0.05）,胞核/胞浆NF-κB p65显着增加（P<0.01）、核转位增加。此外,再灌注后24 h大脑皮质缺血周边区免疫荧光染色观察到ABIN1及A20共同表达于胞浆,免疫共沉淀结果进一步提示ABIN1和A20、NEMO相互结合。结论:在局灶脑缺血/再灌注中,电针可通过抑制NF-κB活化来减轻神经炎症从而发挥脑保护作用,ABIN1沉默部分削弱了电针的作用,提示电针可能通过上调ABIN1的表达抑制NF-κB激活。此外,ABIN1可能协同A20抑制NF-κB的激活。
李相国[5]（2021）在《基于TLR4/NF-κB通路探究鬼箭羽醇提物对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响与机制》文中研究指明目的:通过TLR4/NF-κB通路探究鬼箭羽醇提物（Ethanolic Extracts of Euonymus Alatus,EEEA）对大鼠脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）的影响及作用机制。方法:150只SD雄性大鼠,随机分为假手术组（Sham operation group,SG）、模型组（Model group,MG）、瑞舒伐他汀组（Rosuvastatin Calcium group,RG）、鬼箭羽醇提物低、中、高剂量组（EEEA-L、EEEA-M、EEEA-H）,每组25只。EEEA-L、EEEA-M、EEEA-H分别按0.05g·kg-1、0.1g·kg-1、0.2g·kg-1的剂量给予EEEA混悬液灌胃,RG按5mg·kg-1的剂量给予瑞舒伐他汀钙片混悬液灌胃,SG、MG给予等容量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃,每日1次,连续给药7d。末次给药后2h,制备MCAO/R模型。再灌注后24h,对大鼠进行m NSS评分。取脑组织做TTC染色计算脑梗死体积百分比,HE染色法观察缺血侧皮质区病理形态变化,采用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的变化,采用Western Blot法及RT-q PCR法检测脑缺血半暗带区TLR4、NF-κBp65蛋白及mRNA的表达水平。结果:（1）mNSS评分结果示:与SG比较,其他各组大鼠神经功能缺损评分显着升高（P<0.05）;与MG比较,EEEA-H大鼠神经功能缺损评分明显降低（P<0.05）。（2）TTC染色结果示:与MG相比,EEEA-M、EEEA-H大鼠脑梗死体积百分比显着降低（P<0.05）。（3）HE染色结果示:SG神经元细胞均匀分布,细胞形态正常。MG脑组织出现坏死液化,形成网状软化灶,神经元数目减少,结构排列紊乱。EEEA各组脑组织软化灶、镂空状空洞、固缩变性神经元呈现剂量依赖性的减少,且正常的神经元数目也呈剂量依赖性的明显多于MG组。（4）ELISA结果示:与SG比较,MG大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量显着升高（P<0.05）;与MG相比,EEEA各组和大鼠血清TNF-α和IL-1β含量明显降低（P<0.05）,EEEA-M、EEEA-H大鼠血清IL-6含量也明显降低（P<0.05）。（5）Western Blot结果示:与SG比较,其他各组大鼠的TLR4、NF-κBp65蛋白表达均明显升高（P<0.05）;与MG相比,EEEA各组大鼠的TLR4蛋白表达显着下降（P<0.05）,EEEA-M、EEEA-H大鼠的NF-κBp65蛋白表达也明显降低（P<0.05）。（6）RT-q PCR结果示:与SG比较,其余各组大鼠TLR4、NF-κBp65的mRNA表达显着升高（P<0.05）;与MG相比,EEEA各组大鼠的TLR4、NF-κBp65的mRNA表达明显降低（P<0.05）。结论:EEEA可呈剂量依赖性减轻CIRI模型大鼠的神经功能缺损症状,减少脑梗死体积,改善缺血侧皮质区的病理损伤程度,从而发挥神经保护作用。其机制可能与抑制TLR4、NF-κBp65蛋白和mRNA的表达和降低血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量水平有关。
Bing-Qian Cao,Feng Tan,Jie Zhan,Peng-Hui Lai[6]（2021）在《Mechanism underlying treatment of ischemic stroke using acupuncture:transmission and regulation》文中研究说明The inflammatory response after cerebral ischemia/reperfusion is an important cause of neurological damage and repair. After cerebral ischemia/reperfusion, microglia are activated, and a large number of circulating inflammatory cells infiltrate the affected area. This leads to the secretion of inflammatory mediators and an inflammatory cascade that eventually causes secondary brain damage, including neuron necrosis, blood-brain barrier destruction, cerebral edema, and an oxidative stress response. Activation of inflammatory signaling pathways plays a key role in the pathological process of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that acupuncture can reduce the inflammatory response after cerebral ischemia/reperfusion and promote repair of the injured nervous system. Acupuncture can not only inhibit the activation and infiltration of inflammatory cells, but can also regulate the expression of inflammation-related cytokines, balance the effects of pro-inflammatory and anti-inflammatory factors, and interfere with inflammatory signaling pathways. Therefore, it is important to study the transmission and regulatory mechanism of inflammatory signaling pathways after acupuncture treatment for cerebral ischemia/reperfusion injury to provide a theoretical basis for clinical treatment of this type of injury using acupuncture. Our review summarizes the overall conditions of inflammatory cells, mediators, and pathways after cerebral ischemia/reperfusion, and discusses the possible synergistic intervention of acupuncture in the inflammatory signaling pathway network to provide a foundation to explore the multiple molecular mechanisms by which acupuncture promotes nerve function restoration.
彭哲[7]（2020）在《miR-211-5p通过下调COX2的表达改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤》文中研究指明第一部分mi R-211-5p对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑损伤的影响目的:筛选出在局灶性脑缺血再灌注（MCAO/R）大鼠脑中有明显表达变化的mi RNAs;观察mi R-211-5p与COX2在MCAO/R大鼠皮层和海马再灌注时间不同情况下的表达变化,并分析其相关性;通过给予mi R-211-5pagomir和antagomir进行干预观察其对MCAO/R大鼠脑损伤的影响,以及对COX2及其下游产物、相关炎症因子的影响。方法:1.生物信息学初筛mi RNAs在本研究中,我们希望找到靶向COX2内源性表达的mi RNAs以抑制炎症。我们使用靶标预测数据库（Target Scan,mi RBase和mi Randa）评估哪些mi RNAs能靶向COX2基因。在三个数据库中均能被检索到的mi RNA用于缺血再灌注损伤大鼠脑组织表达检测,以确定后续观察研究采用的mi RNA。2.MCAO/R大鼠脑卒中模型建立雄性8周龄SD大鼠,用1%戊巴比妥钠（45mg/kg）腹腔麻醉,于右侧颈总动脉插入尼龙栓线（L3600,广州佳灵）至大脑中动脉起始段（栓线插入深度约18mm）,阻塞右侧大脑中动脉血流90min,拔出栓线并缝合切口。再灌注时间的选择,根据不同部分实验需要可分别为6h、12h、24h、48h、72h。动物给药均在造模前24小时进行侧脑室注射。3.实验分组（1）实验动物共分为三个批次。为了筛选出有明显表达差异的mi RNAs,第一批分为三个组:正常组（normal）、假手术组（sham）、再灌注24小时组（24h）、n=3。（2）为了观察mi R-211-5p与COX2在再灌注时间不同情况下的表达变化,SD大鼠分为六个组:假手术组、再灌注6小时组（6h）、再灌注12小时组（12h）、再灌注24小时组（24h）、再灌注48小时组（48h）、再灌注72小时组（72h）,n=3。（3）为了观察mi R-211-5p干预观察对MCAO/R大鼠脑损伤的影响,SD大鼠共分为六个组:假手术组、MCAO/R+溶剂组、MCAO/R+mi R-211-5p agomir组、MCAO/R+agomir阴性对照（nagetive control,NC）组、MCAO/R+antagomir组、MCAO/R+antagomir NC组,n=10。造模前一天给予mi R-211-5p相关的试剂侧脑室注射。3.主要观察方法及指标通过彩色激光多普勒血流仪在造模时检测其血流的变化;通过神经功能缺损评分0-5分法评价其变化;通过TTC染色检查脑梗死情况,并计算梗死面积;采用HE染色,观察海马及皮层病理学改变;采用免疫荧光观察COX2在神经元中的变化;ELISA法检测大鼠海马及皮层中PGD2、PGE2、TNF-α、IL-1β的含量;q-PCR检测mi R-211-5p和COX2 m RNA的变化;Western blot检测COX2蛋白表达。结果:1.与正常组相比,假手术组无明显差异;与假手术组相比,再灌注24小时组大鼠皮层mi R-211-5p明显下调,海马mi R-211-5p明显上调。2.随着再灌注时长的不同,mi R-211-5p在皮层呈现先降低后上升的趋势,在12小时达到谷值;mi R-211-5p在PC12细胞中也呈现先升高后降低的趋势,在48小时达峰值。COX2在皮层及海马均为先上升后降低的趋势。3.与假手术组相比,MCAO/R+溶剂组大鼠神经功能缺损评分明显升高,脑梗死面积显着增大,皮层及海马空泡现象、核深染和固缩现象明显增多;皮层及海马COX2 m RNA和蛋白的表达均明显上升,皮层及海马PGD2、PGE2、IL-1β、TNF-α含量明显升高;与MCAO/R+假手术组相比,MCAO/R+mi R-211-5p agomir组大鼠神经功能缺损评分明显降低,脑梗死面积显着减小,皮层及海马空泡现象、核深染和固缩现象明显减少;皮层及海马COX2 m RNA和蛋白的表达均明显下降,皮层PGE2、IL-1β、TNF-α含量以及海马PGD2、IL-1β、TNF-α含量明显减少。与溶剂组相比,MCAO/R+mi R-211-5p antagomir组大鼠神经功能缺损评分明显增加,脑梗死面积显着增大,皮层及海马空泡现象、核深染和固缩现象明显增多;皮层及海马COX2 m RNA和蛋白的表达均明显上升,皮层PGE2、IL-1β、TNF-α含量明显升高,海马PGD2、IL-1β、TNF-α含量明显升高。与MCAO/R+溶剂组相比,MCAO/R+agomir NC组与MCAO/R+antagomir NC组均无明显差异。结论:1.mi R-211-5p在MCAO/R处理的大鼠皮层及血浆表达明显降低,而在海马表达明显增加。2.mi R-211-5p与COX2 m RNA的表达呈负相关。3.mi R-211-5p对CIRI有神经保护作用,其机制可能与抑制COX2表达,进而降低下游产物及炎症因子水平有关。第二部分mi R-211-5p对氧糖剥夺处理致PC12细胞损伤的影响目的:观察mi R-211-5p对氧糖剥夺处理致PC12细胞损伤的影响,从COX2内源性表达调控探讨其机制。方法:1.OGD/R致PC12细胞损伤模型建立PC12细胞在无糖DMEM培养基,95%N2、5%CO2的三气培养箱中37℃培养2h,然后将细胞培养基换为正常培养基并转移至含95%空气和5%CO2的普通培养箱中37℃培养复氧24小时（OGD/R）2.实验分组（1）为了观察mi R-211-5p与COX2在体外的时间依赖性表达,第一批细胞分为六个组:正常组、OGD/R 0h组、OGD/R 3h组、OGD/R 6h组、OGD/R 12h组、OGD/R 24h组、OGD/R 72h组。（2）为了观察mi R-211-5p对OGD/R致PC12细胞损伤的影响并分析其可能存在的机制,第二批细胞分为六个组:正常组、OGD/R组、OGD/R+mi R-211-5p mimic组、OGD/R+mimic阴性对照（nagetive control,NC）组、OGD/R+inhibitor组、OGD/R+inhibitor NC组。（3）为了探究mi R-211-5p的作用是否会被COX2 si RNA逆转,第三批细胞分为四个组:正常组、OGD/R组、OGD/R+mi R-211-5p inhibitor组、OGD/R+mi R-211-5p inhibitor+COX2 si RNA组。3.主要观察方法及指标:MTT法及LDH法检测细胞增殖与存活情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;q-PCR检测mi R-211-5p和COX2 m RNA的变化;Western blot检测COX2蛋白表达;ELISA法检测PC12细胞PGD2、PGE2的含量;双荧光素酶报告基因法检测COX2 m RNA上是否有mi R-211-5p的结合位点。结果:1.与正常对照组相比,OGD/R组细胞凋亡率、LDH释放率明显上升,增殖率明显下降,COX2 m RNA及蛋白表达明显上升,PGD2、PGE2的含量明显上升。与OGD/R组相比,mi R-211-5p mimic组细胞凋亡率、LDH释放率明显下降,增殖率明显上升,COX2 m RNA及蛋白表达明显下降,PGD2、PGE2的含量明显下降;与OGD/R组相比,mi R-211-5p inhibitor组细胞凋亡率、LDH释放率明显上升,增殖率明显下降,COX2 m RNA及蛋白表达明显上升,PGD2、PGE2的含量明显上升;与OGD/R组相比,mimic NC组与inhibitor NC组无明显差异。2.与mi R-211-5p inhibitor组相比,mi R-211-5p inhibitor+COX2 si RNA组细胞LDH释放率明显下降,增殖率明显上升,COX2 m RNA及蛋白表达明显下降。3.双荧光素酶报告基因法证实COX2 m RNA的非编码区有mi R-211-5p的结合位点。结论:1.mi R-211-5p mimic对OGD/R致PC12细胞损伤具有保护作用,并且降低了COX2及其下游产物的表达;mi R-211-5p inhibitor对OGD/R致PC12细胞损伤具有加重作用,并且升高了COX2及其下游产物的表达;表明mi R-211-5p可能通过调控COX2参与OGD/R损伤。2.双萤光素酶实验证实COX2的非编码区存在mi R-211-5p的结合位点,并且COX2 si RNA可以显着地逆转mi R-211-5p inhibitor的作用。进一步说明mi R-211-5p是通过内源性靶向抑制COX2表达,进而发挥对OGD/R致PC12细胞损伤的保护作用
李帆[8]（2020）在《失笑散调控NLRP3炎性小体保护脑缺血再灌注损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理脑卒中（Stroke）,又称中风,是一种严重威胁人类健康的脑血管疾病,具有高发病率、高致残率、高死亡率等特点。缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS）,是脑卒中最常见的类型,已成为研究的热点和大多数药物试验的目标。脑缺血后,血液及周围组织释放的有害物质会对脑产生损伤,即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）。国内外众多研究表明,炎症在CIRI中起到重要的作用,但其潜在机制尚未完全阐明。近年来,NLRP3（nucleotide binding domain（NOD）-like receptor protein 3）炎性小体在IS中的作用受到越来越多的关注。NLRP3炎性小体能够感知各种刺激,形成半胱天冬酶-1（Caspase-1）活化的分子平台,进而处理和释放白介素-1（interleukin-1,IL-1）和IL-18,增强炎症反应。失笑散是中医临床常用的活血化瘀方剂,具有活血化瘀、散结止痛的功效,但其对于CIRI的研究尚未见报道。故本研究拟通过构建体内外CIRI模型,以失笑散提取液进行干预,探讨失笑散对体内外CIRI的保护作用及其机制。目的:建立大鼠脑缺血再灌注损伤（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型和BV2细胞氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型,分别以失笑散药物水煎液及提取液进行干预,探究失笑散对体内外CIRI的保护作用及可能的潜在机制。方法:（1）体内实验:选择清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,以线栓法建立MCAO模型。大鼠随机分为假手术组、模型组、失笑散水煎液低、中、高浓度治疗组,每组15只。在造模前灌胃给药,每日两次,连续给药5天。造模24小时后,进行神经功能评分,然后将大鼠麻醉后处死,收集缺血脑皮质及外周血。1、TTC染色测定脑梗死体积;2、实时定量 PCR 检测大鼠缺血脑皮质中 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-αmRNA的表达。3、ELISA法检测大鼠缺血脑皮质及血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达。（2）体外实验:将BV2细胞分为对照组,模型组（OGD/R组）及失笑散提取液处理组。用不同浓度的提取液预处理BV2细胞2小时后,缺氧处理4小时。对照组以正常培养基培养,不给药,不进行OGD;模型组不给药,与药物组同时进行OGD,缺氧结束后重新复氧24小时,收集细胞上清与细胞裂解液检测。1、CCK-8法检测BV2细胞活力值;2、流式细胞仪检测BV2细胞凋亡比例;3、实时定量PCR检测BV2细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IIL-18、TNF-α mRNA的表达。4、ELISA法检测BV2细胞上清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 的表达。结果:1、神经功能评分结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠得分显着升高（P<0.001）,三组失笑散治疗组大鼠的神经功能评分则显着降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）,但三组两两之间无明显差异。2、TTC染色:与假手术组相比,模型组大鼠脑皮质梗死面积为49.8%（P<0.001,）,而失笑散低、中、高浓度组大鼠脑部梗死面积分别为19.6%、15.4%、4.1%,明显缩小（P<0.001、P<0.001、P<0.001）,高浓度结果明显优于低、中浓度组组。3、ELISA结果显示,与假手术组对比,模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子表达明显增加（P<0.001、P<0.01、P<0.01、P<0.01）,脑皮质中炎症因子表达也明显增加（P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.001）。而且,与模型组对比,失笑散治疗组大鼠血清中炎症因子表达减少（P<0.001、P<0.05、P<0.05、P<0.05）,但组间无明显差异,脑皮质中炎症因子表达明显下降（P<0.001）,但组间差异不显着。4、RT-PCR法检测大鼠缺血脑缺血组织中炎症因子NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-αmRNA的表达水平。结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠缺血脑缺血组织中炎症因子表达水平显着上升（P<0.001、P<0.01、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001）,与模型组相比,失笑散能明显降低炎症因子表达水平（P<0.001、P<0.01、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001）,但无明显组间差异。5、使用CCK-8法检测BV2细胞活力值。结果显示,与空白组相比,不同浓度失笑散干预的BV2细胞活力值无明显变化,各组之间无明显差异,提示失笑散提取液无明显细胞毒性。6、采用流式细胞仪检测BV2细胞凋亡。结果发现,与对照组相比,模型组细胞凋亡比例显着增大（P<0.01）,与模型组相比,失笑散能减少BV2细胞凋亡（P<0.05）。7、ELISA法检测BV2细胞上清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的表达。ELISA结果显示,与空白对照组相比,模型组细胞上清中炎症因子表达增多（P>0.05、P<0.05、P<0.001、P<0.001）,与模型组相比,失笑散能降低炎症因子表达水平（P<0.05、P<0.05、P<0.001、P<0.001）,但各治疗组间无明显差异。8、采用 RT-PCR 检测 BV2 细胞 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA的表达。从PCR结果看出,与假手术组相比,模型组细胞NLRP3、Caspase-I、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA 的表达升高（P>0.05、P<0.05、P<0.001、P<0.05、P<0.05、P<0.01）与模型组相比,失笑散提取液能降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-αmRNA 的表达（P>0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.01、P<0.05、P<0.01）,但组间差异不明显。结论:失笑散可改善神经功能,缩小脑梗死面积,降低大鼠缺血脑组织及血清中炎性因子的表达;失笑散提取液可保护OGD/R模型BV2细胞,减少细胞凋亡及细胞中炎症因子的表达;失笑散对缺血再灌注损伤的保护作用可能与调控NLRP3介导的炎症信号通路有关。
陈凤收[9]（2020）在《miR-23a-3p和miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及机制的研究》文中研究说明目的:脊髓缺血再灌注损伤（Spinal Cord Ischemia-reperfusion Injury,SCII）与许多疾病相关,如胸腹或胸动脉瘤修复手术、椎管内手术。脊髓缺血再灌注损伤预后不良,目前仍未解决。由于其诱导因素众多,机制尚未明确。蛋白TRIL（TLR4interactor with leucine-rich repeats,TRIL）和CXCL13（C-X-C motif ligand 13,CXCL13）在神经系统疾病发挥重要作用。近年来,mi RNA中miR-23a-3p和miR-186-5p在神经和缺血疾病方面得到关注。七氟烷对脊髓缺血再灌注损伤有保护作用,但是七氟烷是否通过调节miRNAs参与对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。本研究拟探索脊髓缺血再灌注损伤中miR-23a-3p和miR-186-5p对下游蛋白的调控机制。此外进一步探索七氟烷预处理是否通过调节miR-23a-3p和miR-186-5p对脊髓缺血再灌注损伤起到保护作用。研究方法:夹闭主动脉弓14min建立大鼠脊髓缺血再灌注模型。随机分为SCII组（缺血组）和Sham组（假手术组,不夹闭主动脉弓）,通过microarray芯片检测SCII后异常表达的miRNA,并进行分析,通过qRT-PCR评估miR-23a-3p和miR-186-5p的表达水平。大鼠鞘内注射siRNA-TRIL质粒沉默TRIL,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定TLR4、TLR3、NF-κB的表达,通过ELISA法测定IL-1β的表达。对miR-23a-3p和TRIL进行双荧光素酶基因检测两者是否有靶向关系。通过大鼠鞘内注射miR-23a-3p的mimics质粒构建miR-23a-3p过表达脊髓缺血再灌注模型,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定TLR4、TLR3、NF-κB的表达,通过ELISA法测定IL-1β的表达,通过TUNEL法检测凋亡情况,观察miR-23a-3p过表达对前述指标的影响。通路Western blot测定脊髓缺血再灌注损伤CXCL13的表达随时间的变化。并通过免疫双标检测脊髓缺血再灌注损伤后CXCL13的细胞定位。通过大鼠鞘内注射si-CXCL13质粒和si-CXCR5质粒分别沉默CXCL13和CXCR5,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3的表达,通过ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。同时通过生物信息学分析对miR-186-5p靶基因进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路和GO（Gene Ontology）富集分析。通过大鼠鞘内注射mi R-186-5p的mimics质粒和AMO质粒构建干扰miR-186-5p表达的脊髓缺血再灌注模型,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3的表达,通过ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。通过2.4%七氟烷预处理1h后洗脱30分钟进行造模。分别于脊髓缺血再灌注损伤后12h评估大鼠的运动功能,检测mi R-23a-3p和TRIL的表达;脊髓缺血再灌注损伤后24小时评估大鼠的运动功能,检测miR-186-5p和CXCL13的表达。结果:和Sham组相比,SCII组miR-23a-3p和mi R-186-5p表达明显降低,TRIL和CXCL13蛋白表达明显升高。沉默TRIL改善了脊髓缺血再灌注损伤后运动功能,减轻了脊髓缺血再灌注损伤后学脊髓屏障的损伤,改善了血脊髓屏障的损伤,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,降低了下游TLR4、TLR3、NF-κB和IL-1β的蛋白表达。通过双荧光素酶报告基因检测发现miR-23a-1-5p对TRIL存在靶向调控关系。过表达miR-23a-3p改善脊髓缺血再灌注损伤后大鼠下肢运动功能,降低BSCB通透性,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,并且降低TRIL、TLR4、TLR3、NF-κB和IL-1β的蛋白表达。miR-23a-3p对脊髓缺血再灌注损伤的作用可能是由于miR-23a-3p靶向调节TRIL造成的。CXCL13在脊髓缺血再灌注损伤后显着升高,并且表达于神经元和小胶质细胞。CXCR5在脊髓缺血再灌注损伤后也显着升高。沉默CXCL13或者CXCR5改善了脊髓缺血再灌注损伤后运动功能,减轻了血脊髓屏障的损伤,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,降低了下游ERK、p-ERK、caspase-3、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达。同时通过生物信息学分析对miR-186-5p靶基因进行GO富集分析,发现CXCL13富集于miR-186-5p多种生物学功能。过表达miR-186-5p改善脊髓缺血再灌注损伤后大鼠下肢运动功能,降低BSCB通透性,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,并且降低CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达。而抑制miR-186-5p则加重脊髓缺血再灌注损伤。miR-186-5p对脊髓缺血再灌注损伤的影响可能是由于miR-186-5p调节CXCL13造成的。七氟烷预处理能改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤后12h和24h的运动功能。七氟烷预处理能够增加大鼠脊髓缺血再灌注损伤后miR-23a-3p和miR-186-5p,降低TRIL和CXCL13蛋白的表达。miR-23a-3p和其靶基因TRIL,miR-186-5p和其潜在靶基因CXCL13,可能涉及脊髓缺血再灌注损伤的保护机制。结论:1.沉默TRIL抑制TLR4和TLR3,miR-23a-3p靶向结合TRIL,过表达miR-23a-3p调控TRIL进而调控下游通路对脊髓缺血再灌注损伤起到保护作用。2.脊髓缺血再灌注损伤后miR-186-5p表达明显降低。CXCL13和CXCR5蛋白表达升高。脊髓缺血再灌注损伤后CXCL13表达于神经元和小胶质细胞。CXCL13/CXCR5轴通过激活ERK介导的神经炎症和凋亡促进脊髓缺血再灌注损伤。干扰miR-186-5p的表达可能通过调节CXCL13/CXCR5轴介导的凋亡和炎症通路影响脊髓缺血再灌注损伤。3.七氟烷预处理能改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的运动功能。七氟烷预处理提升miR-23a-3p和miR-186-5p表达,抑制TRIL和CXCL13蛋白的表达。
谢坤[10]（2019）在《围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究》文中研究说明研究背景“脑卒中”（cerebral stroke）是一种中枢神经系统急性脑血流循环障碍性疾病,是世界公认的第三大致死性疾病,给患者带来了严重的心理和经济负担,极大地影响患者生活质量。其中缺血性脑血管病占比60%～80%,是脑血管病的主要类型。缺血性脑血管病（ischemic cerebralvascular disease,ICVD）引起的脑损伤包括缺血期原发性损伤和继发脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury,CIRI）。在围手术期间,多种手术创伤可导致CIRI的发生,可能会导致远期学习、记忆及认知功能障碍,如体外循环、术中持续低血压导致脑血流灌注不足,神经外科手术损伤脑血管等多种情况。对于缺血期原发性损伤,临床上可在治疗时间窗内给予溶栓等措施对症处理,及时恢复血液供应,但对于继发的CIRI,目前临床治疗手段和疗效远未达到预期。因此,围术期脑CIRI的发病机制及防治措施的研究成为亟待解决的科学问题。CIRI的病理生理过程是一个复杂的级联反应,涉及多种损伤机制,如氧化应激、炎症损伤、能量代谢障碍、线粒体损伤、神经元自噬效应、细胞内钙超载等,这些损伤机制既可以单独作用,也可交替、循环作用,相互间产生前馈、正反馈和叠加作用,互为因果、共同作用,影响疾病的发生发展和转归。氧化应激、炎性损伤及神经元自噬效应在CIRI发生发展过程中的作用已经成为当前研究的热点。正常机体内存在抑制氧化应激的酶系统,如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶,其中SOD是机体内主要的抗氧化酶、活性氧清除剂。在CIRI发生发展的过程中,大量活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生、释放,造成细胞膜磷脂分子中的不饱和脂肪酸过氧化,产生脂质过氧化物,又经过氧化酶作用后生成大量毒性代谢产物,如丙二醛（Malondialdehyde,MDA）等,MDA可使细胞膜磷脂结构发生变化,细胞膜受损严重,引起神经细胞坏死、凋亡。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）是炎症反应活动中具有关键作用的细胞因子,被认为是全身炎性反应的始动介质,可直接导致血管内皮细胞功能减退、血管通透性增加、循环阻力降低,并诱导IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子及黏附分子的“瀑布样”释放,构成炎性损伤的级联放大效应。转录因子NF-κB是脑缺血再灌注损伤时炎症反应的中心环节,许多研究已证实,NF-κB可通过调节凋亡相关基因的表达实现对细胞凋亡的干预,提高神经细胞的存活率。自噬是机体在缺血和缺氧下产生的压力反应,这个过程是通过囊泡将某些细胞组分转运到到溶酶体得以降解。在真核生物中,自噬不仅与生长发育、代谢和免疫等生理过程有关,还参与脑缺血、心肌缺血和肾缺血等病理过程的发生。近几年来研究表明,脑缺血再灌注过程中自噬被激活,不仅具有神经保护作用,而且参与神经细胞的死亡调节,因此,脑缺血再灌注可以激活自噬。在CIRI引起神经元损伤的不同机制中,不同种类基因蛋白酶的表达对细胞的凋亡或存活的转归有重要的作用:（1）B淋巴细胞瘤（B-cell lymphoma,Bc1）基因家族成员Bcl-2和Bax基因是目前研究比较明确的功能对立的凋亡调控基因;（2）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族是另一大类细胞凋亡调控因子,Caspase-3是Caspase激活级联反应中下行最重要的凋亡执行蛋白酶,激活的Caspase-3通过裂解细胞骨架蛋白、DNA依赖性的蛋白激酶及其他Caspase相关底物蛋白等,改变细胞结构,最终导致细胞凋亡的发生;（3）自噬是细胞凋亡的一种方式,其激活主要与ULK复合物的活性有关,而ULK复合物活性主要由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin,mTOR）调控。（4）C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase,JNK）属于线粒体激活蛋白激酶超级家族。JNK信号通路可以通过细胞因子、生长因子、压力和其他因素被激活,并参与各种生理过程,如细胞增殖和分化、细胞凋亡和应激反应。此外,JNK信号通路与自噬的激活密切相关,在神经退行性疾病、缺血性再灌注损伤中也发挥重要作用。低温治疗目前是重症医学科对急危重症患者经常采取的治疗方式之一,围手术期重症患者也多有采用。在降低身体耗能的同时,通过低温抑制中枢细胞损伤、凋亡,起到脑保护作用,可能与以下机制有关:（1）使神经元Bcl-2表达升高,Bax表达降低,显着减少神经细胞凋亡;（2）抑制炎症因子（细胞色素C、ROS、NO）等对caspase-3的激活,使caspase-3表达下降,起到对脑神经细胞的保护作用;（3）促进P-ERK1/2表达,而对JNK表达仅有较小的上调作用,从而提高缺血再灌注神经元存活率;（4）促进P-Akt表达,抑制细胞凋亡。目前国际上通用的低温划分方式是将轻度低温（33～35℃）、中度低温（28～32℃）合称为亚低温（mild hypothcrmia,MH）。经过多年的动物实验研究和临床应用,亚低温技术已经逐渐成熟,广泛应用于心脏骤停、重度颅脑损伤以及脑卒中的治疗,收到了积极的临床疗效。丁苯酚（3-n-butylphthalide,NBP）又名芹菜甲素,是我国脑血管疾病治疗领域第一个拥有自主知识产权的一类新药。大量的国内外研究表明丁苯酚可以阻断缺血性再灌注损伤的多个环节,具有明确的治疗作用:（1）可改善线粒体中Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性,保护线粒体功能;（2）减少细胞色素C的释放,弱化凋亡蛋白酶的作用;（3）抑制细胞内钙超载;（4）减少兴奋性氨基酸的释放;（5）减轻血脑屏障的破坏程度;（6）改善缺血区微循环和能量代谢;（7）延长溶栓治疗时间窗。鉴于脑缺血再灌注损伤的病理生理机制和治疗研究成果、亚低温治疗的机制和NBP的生物学功能,我们可以合理地推测:相比单独使用MH或NBP治疗,NBP与MH联合使可能具有更强的改善脑缺血再灌注损伤、保护脑组织的效果。右美托咪定（Dexmedetomidine,Dex）作为一种新型具有高度选择性的α2肾上腺素受体激动剂,具有良好的镇静作用,是临床实践中常用于患者的镇静。研究发现,Dex可以通过减少氧化应激和降低炎症介质的释放来减轻大鼠的缺血再灌注损伤。然而,对于术后应用Dex是否对脑缺血再灌注损伤具有保护作用及作用机制尚未明确,本研究另一个重点是Dex后处理通过抑制炎症反应和神经元自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的的保护机制。综上所述,本研究对围术期脑缺血再灌注损伤的保护机制研究主要分为两个部分:（1）通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用MH与NBP联合治疗,检测脑组织中炎性因子的含量,观察神经元形态,检测凋亡相关蛋白的表达,验证NBP与MH联合使用对脑缺血再灌注损伤的保护作用。（2）通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探讨Dex后处理对空间学习和记忆能力、脑梗死区、细胞凋亡的影响,这个过程中海马CA1区域神经元的病理变化,以及可能涉及的JNK信号通路分子机制。第一部分MH和NBP联合作用对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制目的本研究主要通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用MH与NBP联合治疗,通过检测氧化损伤和炎症相关因子的含量以及炎症相关蛋白的表达,研究MH和NBP联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的神经保护作用。方法75只SPF级健康雄性SD大鼠（220-250g）由中国科学院上海实验动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组、模型组、MH组、NBP组和MH+NBP组,每组15只。NBP组和MH+NBP组大鼠术前给予含NBP（80mg/kg）生理盐水灌胃7天（每天一次）,假手术组、模型组和MH组均给予等量生理盐水。药物治疗7天后,采用改良Pulsinelli四血管闭塞法构建大鼠脑缺血再灌注模型。应用0.9%氯化钠溶液（4-5℃）通过20G硅胶管泵入头部进行MH治疗,使海马温度降至（33.0±0.5）℃后,双侧颈总动脉与动脉夹结扎15min,在自然复温前保持低温1h。缺血再灌注8小时后,冰浴收集一部分脑组织,匀浆,取上清液,用MDA检测试剂盒,SOD检测试剂盒,NO检测试剂盒和NOS检测法测定MDA、SOD、NO和NOS含量。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测脑组织中炎性因子IL-6和IL-1β的含量。一部分脑组织浸泡于10%福尔马林溶液中固定,进行石蜡包埋和常规切片。通过Nissl染色,在光学显微镜下观察脑组织神经元细胞的形态。采用免疫印迹测定Bcl-2、caspase-3、p-NF-κB、p-mTOR、mTOR等凋亡相关蛋白的表达量及磷酸化水平。结果1.脑组织中氧化应激因子含量变化采用试剂盒检测相应氧化应激因子,结果表明MH,NBP和MH+NBP治疗均能降低脑缺血再灌注损伤时的氧化应激因子MDA,NO,NOS的含量,增加SOD的含量,而且MH+NBP抑制脑缺血再灌注引起的氧化损伤的作用优于单独的MH和NBP治疗。2.脑组织中炎症因子含量变化ELISA检测结果显示,与模型组相比,MH组,NBP组及MH+NBP组IL-6和IL-1β含量均有不同程度的降低,MH+NBP组IL-6和IL-1β含量明显低于模型组。3.脑组织中神经元细胞结构变化尼氏染色结果显示,MH组和NBP组神经元数量较模型组明显增加,细胞排列规则,部分尼氏体丢失。与模型组比较,MH+NBP组神经元数量明显增加,且MH+NBP组与MH组、NBP组相比,神经元数量有所增加,神经元细胞结构完整,并且富含尼氏体。4.自噬相关信号m-TOR蛋白的活化Western Blot检测结果显示,采用MH和NBP联合治疗后p-mTOR蛋白表达水平显着降低。5.凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的变化Western Blot检测结果显示,采用MH和NBP治疗后较模型组Bcl-2蛋白表达水平增加,Bax蛋白表达显着降低。采用MH和NBP联合治疗后Bcl-2蛋白表达水平进一步增加,Bax蛋白表达降低。6.炎症相关信号NF-κB蛋白的活性Western Blot检测结果显示,与模型组相比,NH和NBP组p-NF-κB蛋白水平显着降低,NH+NBP组进一步降低p-NF-κB蛋白水平。结论1.MH和NBP联合治疗较单独使用MH和NBP治疗能更好地抑制脑缺血再灌注引起的氧化损伤和炎症反应。2.MH和NBP联合治疗可以减少脑缺血再灌注引起的大鼠脑神经细胞损伤,这种保护作用优于MH和NBP单独治疗。3.NH和NBP联合治疗可以通过抑制mTOR和NF-κB蛋白的磷酸化,促进Bcl-2表达和抑制Bax表达,对脑缺血再灌注损伤大鼠起到神经保护作用。第二部分右美托咪定后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制目的本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,探讨Dex后处理对大鼠空间学习和记忆能力、脑梗死区、细胞凋亡的影响,这个过程中海马CA1区域神经元的病理变化,以及JNK信号通路的蛋白表达,为术后减轻脑缺血再灌注损伤的治疗提供理论依据。方法180只雄性健康成年SD大鼠,随机分成6组（每个治疗组30只大鼠）,假手术（Sham）组,缺血再灌注损伤（I/R）组,右美托咪定后处理（Dex）组,JNK抑制剂（SP600125）组,右美托咪定后处理+JNK激动剂（Dex+Anisomycin）组,阳性药物尼莫地平对照（Nim）组。采用缝合闭塞法建立大鼠中脑动脉闭塞（MCAO）模型。脑缺血再灌注24小时后,进行莫里斯水迷宫试验以评价大鼠的空间学习能力和记忆能力。取每组6只大鼠脑组织,切片,利用TTC染色检测缺血脑区面积。取每组6只大鼠脑组织,浸泡于4%多聚甲醛固定,切片,进行TUNEL染色,检测脑组织中凋亡细胞的数量,通过HE染色观察CA1脑区的病理变化。取6组大鼠的血清,利用ELISA试剂盒测定血清中TNF-α,IL-6,IL-1β的含量。取每组6只大鼠脑组织,浸泡于2.5%戊二醛固定,通过透射电镜观察海马CA1区神经元的结构变化。提取每组6只大鼠脑组织的RNA,利用qRT-PCR检测自噬相关基因的表达。提取每组6只大鼠脑组织的总蛋白,利用免疫印迹技术检测自噬相关蛋白及JNK磷酸化水平。结果1.行为学测试利用莫里斯水迷宫测试对大鼠的空间学习和记忆能力进行评价。与Sham组相比,其他组逃逸潜伏期（EL）明显延长,而跨平台时间和停留原始平台时间减少。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组EL明显缩短,而跨平台和平台时间显着增加。与Dex组相比,EL显着延长,而跨平台和平台象限时间在Dex+Anisomycin组中显着缩短。2.脑组织的梗死区域TTC染色测定脑组织梗死面积。在I/R组、Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中观察到不同大小的白色梗死区域。大鼠脑组织的梗死区以梗死区/非梗死区域的百分比表示。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组脑组织的梗死区域显着减少。与Dex组相比,Dex+Anisomycin组的白色梗死区域增加。3.大鼠海马CA1区神经元凋亡TUNEL测定用于检测大鼠大脑海马CA1区神经元凋亡。与Sham组相比,其他组显示阳性凋亡的神经元数量显着增加。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组阳性凋亡的神经元数量有不同程度的明显下降。与Dex组相比,Dex+Anisomycin组神经元凋亡数量明显增加。4.大鼠海马CA1区域神经元的病理变化通过HE染色观察大鼠海马CA1区域神经元的病理变化。与Sham组相比,其他组神经元表现出不同程度的形态异常。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组神经元病理变化程度降低,Dex组、Nim组和SP600125组之间无显着差异,而Dex+Anisomycin组神经元病理变化程度稍重。5.血清中炎症因子的变化ELISA测定大鼠血清中炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达水平。与Sham组相比,其他组中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量显着增加。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量显着下降。与Dex组相比,Nim组与SP600125组的TNF-α、IL-6和IL-1β水平无显着差异,而Dex+Anisomycin组TNF-α、IL-6和IL-1 β的含量增加。6.海马CA1区域的自噬效应通过透射电镜观察海马CA1区域的自噬效应。电子镜下细胞中出现自噬小体或吞噬细胞被认为是自噬的形态特征。与I/R组相比,自噬程度有不同程度地降低,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组水肿和空泡化程度降低。Dex组、Nim组和SP600125组之间没有显着差异,而Dex+Anisomycin组自噬程度稍重。7.大鼠脑组织Beclin-1,Caspase-3,LC3 mRNA和蛋白质的表达通过qRT-PCR检测大鼠脑组织自噬相关mRNA的表达。与Sham组相比,其他组Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达显着增加。与I/R组相比,Sp600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达显着减少。Dex组、Sham组和SP600125组之间无显着差异,而Beclin-1、Caspase-3、LC3的mRNA表达在Dex+Anisomycin组略高。免疫印迹结果显示,与Sham组相比,Beclin-1、Caspase-3和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白质表达在其他组（P<0.05）中明显升高,总体变化趋势变化与qRT-PCR结果一致。8.JNK信号通路活性的检测免疫印迹结果显示,与Sham组相比,其他组p-JNK1的蛋白表达明显上升,JNK1总含量无显着变化。与I/R组相比,Dex组、SP600125组、Dex+Anisomycin组和Nim组中p-JNK1的蛋白质表达显着减少。与Dex组相比,p-JNK1的蛋白质表达在Dex+Anisomycin组中略有上升。结论1.右美托咪定后处理和JNK通路抑制剂治疗可改善大鼠脑缺血性灌注损伤引起的学习和记忆功能障碍,减少脑组织梗死区域面积。2.右美托咪定后处理和JNK通路抑制剂治疗能减轻大鼠脑缺血性灌注损伤引起的海马CA1区域神经元的阳性凋亡和病理变化。3.右美托咪定后处理能够减少大鼠脑缺血性灌注损伤引起的炎症反应和自噬作用,可能与抑制JNK通路活化有关,并影响炎症因子和自噬相关蛋白质的表达。
二、EFFECT OF ELECTROACUPUNCTURE ON SERUM IL-1β AND TNF-α CONTENTS IN CEREBRAL ISCHEMIA-REPERFUSION RATS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EFFECT OF ELECTROACUPUNCTURE ON SERUM IL-1β AND TNF-α CONTENTS IN CEREBRAL ISCHEMIA-REPERFUSION RATS（论文提纲范文）
（1）IL-4诱导小胶质细胞向M2表型极化对缺血性卒中的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 缺血性脑卒中的疾病负担与临床治疗现状 |
| 1.2 缺血性脑卒中的损伤机制 |
| 1.2.1 细胞兴奋毒性 |
| 1.2.2 氧化应激和硝化应激损伤 |
| 1.2.3 炎症反应 |
| 1.2.4 细胞凋亡 |
| 1.2.5 细胞自噬 |
| 1.3 小胶质细胞广泛参与神经系统疾病的发生、发展 |
| 1.3.1 阿尔兹海默病 |
| 1.3.2 帕金森病 |
| 1.3.3 癫痫 |
| 1.3.4 脊髓损伤 |
| 1.4 小胶质细胞在缺血性脑卒中的研究现状 |
| 1.4.1 缺血性卒中时小胶质细胞上表达的受体和通道蛋白 |
| 1.4.2 缺血性卒中后与小胶质细胞相关性神经损伤的酶类 |
| 1.4.3 靶向小胶质细胞的疗法在缺血性卒中治疗中的应用 |
| 1.4.4 小胶质细胞活动的在体实时呈像 |
| 1.5 IL-4/STAT6信号通路对小胶质细胞的作用 |
| 1.5.1 JAK/STAT信号通路 |
| 1.5.2 小胶质细胞中的IL-4/STAT6信号通路介导神经功能恢复 |
| 第2章 脑梗塞可导致小胶质细胞极化表型和炎症因子的改变 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 缺血性脑卒中患者血液中小胶质细胞相关炎症因子变化 |
| 2.3.2 缺血性脑卒中大鼠血液中小胶质细胞相关炎症因子变化 |
| 2.3.3 免疫荧光检测缺血半暗带小胶质细胞极化情况 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 IL-4对急性脑梗塞大鼠的神经保护作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 IL-4对大鼠tMCAO后神经功能缺损的影响 |
| 3.3.2 IL-4对大鼠脑梗死容积的影响 |
| 3.3.3 IL-4对大鼠血液中炎症因子的影响 |
| 3.3.4 IL-4对大鼠缺血半暗带区小胶质细胞极化表型的影响 |
| 3.3.5 IL-4对大鼠缺血半暗带区细胞凋亡的影响 |
| 3.3.6 IL-4对大鼠缺血半暗带区皮层神经元的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 IL-4诱导小胶质细胞向M2表型极化并发挥神经保护作用的机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 IL-4对小胶质细胞炎症因子分泌的影响 |
| 4.3.2 IL-4促进小胶质细胞向M2表型极化的分子通路 |
| 4.3.3 IL-4对小胶质细胞极化表型的影响 |
| 4.3.4 IL-4对小胶质细胞内吞能力的影响 |
| 4.3.5 IL-4处理的小胶质细胞对OGD处理的神经元凋亡的影响 |
| 4.3.6 IL-4处理的小胶质细胞对OGD处理的神经元线粒体膜电位的影响 |
| 4.3.7 IL-4处理的小胶质细胞对OGD处理的神经元调亡蛋白表达的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）The mechanisms through which auricular vagus nerve stimulation protects against cerebral ischemia/reperfusion injury（论文提纲范文）
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Study protocol |
| Modeling cerebral I/R injury |
| VNS |
| Neurological deficit score |
| Hematoxylin and eosin staining |
| Enzyme-linked immunosorbent assay |
| Western blot assay |
| Immunohistochemical staining |
| Statistical analysis |
| Results |
| Ta-VNS decreases pathological changes in the penumbra and motor cortex of cerebral I/R model rats |
| Ta-VNS improves the neurological function of cerebral I/Rmodel rats |
| Ta-VNS affects the levels of Ach,IL-1β,IL-6,and TNF-αin the penumbra and motor cortex of cerebral I/R model rats |
| Ta-VNS affects Cx43 expression and phosphorylation in the ischemic penumbra and motor cortex of cerebral I/R model rats |
| Discussion |
（3）电针预处理调控肠道菌群与Th17/Treg免疫平衡降低大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1. 中医对缺血性中风的认识 |
| 1.1 历史沿革 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 治法方药 |
| 1.3.1 清热解毒法 |
| 1.3.2 通腑化痰法 |
| 1.3.3 化瘀通络法 |
| 1.3.4 补气活血法 |
| 1.3.5 补肾扶正法 |
| 1.4 中医“治未病”思想与缺血性中风 |
| 2. 现代医学对缺血性脑卒中的认识 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 病理生理机制 |
| 2.3 Th17/Treg免疫平衡与缺血性脑卒中 |
| 2.3.1 免疫炎症反应与缺血性脑卒中 |
| 2.3.2 免疫系统的细胞类型 |
| 2.3.3 Th17细胞 |
| 2.3.4 Treg细胞 |
| 2.3.5 Th17/Treg免疫平衡 |
| 2.4 肠道菌群与缺血性脑卒中 |
| 2.4.1 肠道菌群的分类及功能 |
| 2.4.2 肠道菌群与缺血性脑卒中 |
| 3. 电针预处理与缺血性脑卒中 |
| 3.1 针灸与缺血性脑卒中 |
| 3.2 预处理与缺血性脑卒中 |
| 3.3 电针预处理与脑缺血耐受 |
| 3.4 电针预处理的脑保护机制 |
| 3.4.1 调节内源性大麻素系统 |
| 3.4.2 调节自噬 |
| 3.4.3 保护血脑屏障 |
| 3.4.4 抑制氧化应激 |
| 3.4.5 抑制内质网应激 |
| 3.4.6 抑制兴奋毒性 |
| 3.4.7 抑制炎症反应 |
| 3.4.8 抑制细胞凋亡 |
| 3.5 针灸通过调控“肠道菌群-免疫反应”治疗IS的可行性 |
| 4. 脑-肠轴与IS发病的中医探讨 |
| 实验部分 |
| 实验一 电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群结构的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂配置方法 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 动物模型的制备与评价 |
| 2.2.1 大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型制备 |
| 2.2.2 纳入标准 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 电针预处理方案 |
| 2.5 指标检测及方法 |
| 2.5.1 mNSS评估神经功能缺损程度 |
| 2.5.2 大鼠再灌注各时间点存活率 |
| 2.5.3 大鼠前肢抓握力量测试 |
| 2.5.4 TTC染色测定脑梗死体积 |
| 2.5.5 HE染色观察缺血侧皮层及结肠组织病理损伤程度 |
| 2.5.6 大鼠盲肠内容物16S rDNA V3-V4区测序 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 激光多普勒血流监测仪监测MCAO/R大鼠缺血侧皮层的脑血流变化 |
| 3.2 各组大鼠再灌注各时间点改良神经功能缺损评分 |
| 3.3 各组大鼠再灌注各时间点前肢抓握力量 |
| 3.4 各组大鼠再灌注各时间点存活率 |
| 3.5 各组大鼠脑梗死体积 |
| 3.6 各组大鼠缺血侧皮层及结肠组织病理损伤形态 |
| 3.7 各组大鼠盲肠内容物测序数据结果 |
| 3.7.1 序列长度分布 |
| 3.7.2 物种分类学注释 |
| 3.7.3 分类单元数统计 |
| 3.7.4 物种组成分析 |
| 3.7.5 肠道菌群与mNSS评分相关性分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 脑缺血再灌注损伤动物模型的制备 |
| 4.2 电针预处理方案的选择 |
| 4.3 电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠行为学的影响 |
| 4.4 电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠脑和结肠组织病理形态的影响 |
| 4.5 电针预处理对脑缺血/再灌注大鼠肠道菌群结构的影响 |
| 实验二 电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠Th17/Treg免疫平衡的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂配置方法 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 动物模型的制备与评价 |
| 2.2.1 大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型制备 |
| 2.2.2 纳入标准 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 电针预处理方案 |
| 2.5 指标检测及方法 |
| 2.5.1 免疫组化观察缺血侧皮层、结肠组织IL-17A、IL-10的表达 |
| 2.5.2 Western blotting检测脑和结肠组织中IL-17A、IL-10蛋白的表达 |
| 2.5.3 Western blotting检测脑、脾及胸腺组织RORγt、Foxp3蛋白的表达 |
| 2.5.4 Elisa测定大鼠血清IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1的含量 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 免疫组化检测各组大鼠缺血侧皮层、结肠组织IL-17A、IL-10蛋白表达 |
| 3.2 各组大鼠脑和结肠组织中IL-17A、IL-10蛋白表达 |
| 3.3 各组大鼠脑、脾及胸腺组织RORγt、Foxp3蛋白表达 |
| 3.4 各组大鼠血清IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1的含量 |
| 3.5 RORγt、Foxp3蛋白与mNSS评分相关性分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 电针预处理对MCAO/R大鼠脑和结肠组织IL-17A、IL-10蛋白表达的影响 |
| 4.2 电针预处理对MCAO/R大鼠脑、脾、胸腺组织中RORγt、Foxp蛋白表达的影响 |
| 4.3 电针预处理对MCAO/R大鼠血清IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1含量的影响 |
| 实验三 电针预处理通过肠道菌群诱导脑缺血耐受的免疫机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂配置方法 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 动物模型的制备与评价 |
| 2.2.1 大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型制备 |
| 2.2.2 纳入标准 |
| 2.3 干预方法 |
| 2.4 菌群剔除 |
| 2.5 粪便微生物移植 |
| 2.6 指标检测及方法 |
| 2.6.1 mNSS评估大鼠神经功能缺损程度 |
| 2.6.2 大鼠前肢抓握力量测试 |
| 2.6.3 HE染色观察缺血侧皮层及结肠组织病理损伤程度 |
| 2.6.4 免疫组化观察缺血侧皮层IL-17A、IL-10的表达 |
| 2.6.5 Elisa测定大鼠血清IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1的含量 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 各组大鼠再灌注各时间点改良神经功能缺损评分 |
| 3.2 各组大鼠再灌注各时间点前肢抓握力量 |
| 3.3 免疫组化观察缺血侧皮层IL-17A、IL-10的表达 |
| 3.4 各组大鼠血清IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1的含量 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 菌群移植技术 |
| 4.2 菌群剔除与菌群移植对MCAO/R大鼠行为学的影响 |
| 4.3 菌群剔除与菌群移植对MCAO/R大鼠脑和结肠组织病理形态的影响 |
| 4.4 菌群剔除与菌群移植对MCAO/R大鼠脑组织IL-17A、IL-10蛋白表达的影响 |
| 4.5 菌群剔除与菌群移植对MCAO/R大鼠血清IL-17A、IL-23、IL-10、TGF-β1含量的影响 |
| 本研究的不足与展望 |
| 结论 |
| 创新点说明 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间所发表的论文 |
| 个人简历 |
（4）电针调控ABIN1表达对局灶脑缺血/再灌注大鼠神经炎性损伤的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ABIN1 在局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质的表达及影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ABIN1 在电针抗局灶脑缺血/再灌注后神经炎症中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 ABIN1 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文目录 |
（5）基于TLR4/NF-κB通路探究鬼箭羽醇提物对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 主要研究内容 |
| 第一节 EEEA对 CIRI大鼠行为学及病理组织学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第二节 EEEA 对 CIRI 大鼠血清中炎症因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第三节 EEEA 对 CIRI 大鼠 TLR4、NF-κBp65 蛋白和 mRNA 的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 实验方法学分析 |
| 1.1 阳性药物的选择 |
| 1.2 取材时间点的选择 |
| 2 EEEA抗 CIRI有效性讨论分析 |
| 2.1 EEEA对 CIRI大鼠神经功能的影响 |
| 2.2 EEEA对 CIRI大鼠脑梗死体积的影响 |
| 2.3 EEEA 对 CIRI 模型大鼠缺血侧皮质区病理形态变化的影响 |
| 3 EEEA抗 CIRI的作用机制讨论分析 |
| 3.1 EEEA对 CIRI大鼠炎症因子的影响 |
| 3.2 EEEA对 CIRI大鼠TLR4、NF-κBp65 蛋白和mRNA的影响 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 脑缺血再灌注损伤的炎症机制与治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果、参加学术会议及获奖 |
| 致谢 |
（7）miR-211-5p通过下调COX2的表达改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 miR-211-5p对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑损伤的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 miR-211-5p对氧糖剥夺处理致PC12细胞损伤的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 神经胶质细胞在缺血性脑卒中发生发展进程的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（8）失笑散调控NLRP3炎性小体保护脑缺血再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 缺血性脑卒中的研究进展 |
| 1.1 小胶质细胞与缺血性脑卒中 |
| 1.2 NLRP3炎性小体的研究概况 |
| 1.3 NLRP3炎性小体与脑缺血再灌注损伤 |
| 2 中药治疗缺血性脑卒中的研究进展 |
| 2.1 中医对缺血性脑卒中的认识 |
| 2.2 中药治疗缺血性脑卒中的研究进展 |
| 2.2.1 单味中药及提取物 |
| 2.2.1.1 川芎嗪 |
| 2.2.2.2 人参皂苷 |
| 2.2.2.3 黄芩苷 |
| 2.2.2.4 姜黄素 |
| 2.2.2.5 丹酚酸 |
| 2.2.2.6 葛根素 |
| 2.2.2 中药复方 |
| 2.2.2.1 桃红四物汤 |
| 2.2.2.2 黄连解毒汤 |
| 2.2.2.3 瓜蒌桂枝汤 |
| 2.2.2.4 补阳还五汤 |
| 2.2.2.5 小续命汤 |
| 2.2.3 中药注射液 |
| 2.2.3.1 清开灵注射液 |
| 2.2.3.2 丹红注射液 |
| 2.2.3.3 脑醒静注射液 |
| 2.2.4 其他治疗方式 |
| 3 失笑散的认识与研究 |
| 3.1 中医认识 |
| 3.2 现代药理学研究 |
| 第二部分 体内实验研究 |
| 1 失笑散对缺血再灌注损伤大鼠的保护作用研究 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器与设备 |
| 1.3 药物及试剂 |
| 1.3.1 失笑散水煎液的制备 |
| 1.4 动物分组及干预方法 |
| 1.4.1 大鼠MCAO模型构建 |
| 1.4.2 大鼠神经功能测定 |
| 1.4.3 TTC染色法测定大鼠脑梗死面积 |
| 1.4.4 实时定量PCR法(qPCR)检测大鼠缺血脑皮质中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA的表达 |
| 1.4.5 酶联免疫法(ELISA)检测大鼠缺血脑皮质中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的表达 |
| 1.4.6 酶联免疫法检测大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的表达 |
| 2 数据的统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 失笑散对MCAO大鼠神经功能的影响 |
| 3.2 失笑散对MCAO大鼠脑梗死面积的影响 |
| 3.3 RT-PCR检测大鼠缺血脑组织中炎症因子NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA的表达 |
| 3.4 失笑散对大鼠缺血脑皮质中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α表达的影响 |
| 3.5 失笑散对MCAO大鼠血清中炎症因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 体外实验研究 |
| 1 失笑散提取液对OGD/R模型BV2细胞的保护作用研究 |
| 1.1 实验仪器与设备 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.2.1 失笑散提取液的制备 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 CCK-8法检测失笑散提取液对BV2细胞活力的影响 |
| 1.5 OGD/R模型的建立及实验方法 |
| 1.5.1 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 1.5.2 ELISA法检测BV2细胞上清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的表达 |
| 1.5.3 RT-PCR法检测BV2细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的表达 |
| 2 数据的统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 失笑散提取液对BV2细胞活力的影响 |
| 3.2 失笑散提取液对BV2细胞凋亡的影响 |
| 3.3 实时定量PCR检测BV2细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的表达 |
| 3.4 ELISA法检测BV2细胞上清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的表达 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）miR-23a-3p和miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :大鼠脊髓缺血再灌注损伤后miRNA-23a-3p和 miR-186-5p表达的变化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.2.3 动物手术模型建立 |
| 2.2.4 行为学检测 |
| 2.2.5 取材 |
| 2.2.6 HE染色观察脊髓组织病理情况 |
| 2.2.7 TUNEL反应检测凋亡 |
| 2.2.8 伊文思蓝(EB)测定血-脊髓屏障(BSCB)通透性 |
| 2.2.9 miRNA表达谱分析 |
| 2.2.10 芯片结果验证及探索miRNA-23a-3p和 miR-186-5p表达随时间的变化 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 miRNA表达谱改变 |
| 3.1.1 鼠脊髓缺血再灌注损伤后的下肢功能评分影响 |
| 3.1.2 脊髓缺血再灌注损伤BSCB通透性影响 |
| 3.1.3 脊髓缺血再灌注损伤后HE染色情况 |
| 3.1.4 脊髓缺血再灌注损伤后凋亡情况 |
| 3.1.5 miRNA表达谱改变 |
| 3.2 qRT-PCR验证对照组和脊髓缺血再灌注组miRNA含量并探索其表达随时间变化 |
| 3.2.1 qReal-time PCR检测miRNA-23a-3p表达随时间的变化 |
| 3.2.2 qReal-time PCR检测miR-186-5p表达随时间的变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :miR-23a-3p通过调节TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响和机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和方法 |
| 2.2.1 检测沉默TRIL效果 |
| 2.2.2 验证抑制TRIL对脊髓缺血再灌注的影响 |
| 2.2.3 双荧光素酶报告基因测定miR-23a-3p和 TRIL的结合 |
| 2.2.4 检测过表达miR-23a-3p效果 |
| 2.2.5 干预miR-23a-3p对缺血再灌注损伤后TRIL的蛋白表达影响 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响 |
| 3.1.1 检测沉默TRIL效果 |
| 3.1.2 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的下肢运动功能的影响 |
| 3.1.3 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后BSCB的影响 |
| 3.1.4 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后组织学改变的影响 |
| 3.1.5 沉默TRIL对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后TLR4、TLR3、NFκB、IL-1β表达的影响 |
| 3.2 miR-23a-3p和 TRIL的双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.3 过表达miR-23a-3p对缺血再灌注损伤后脊髓功能的影响 |
| 3.3.1 验证过表达miR-23a-3p效果 |
| 3.3.2 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的下肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的BSCB影响 |
| 3.3.4 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的凋亡的影响 |
| 3.3.5 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的组织学影响 |
| 3.3.6 miR-23a-3p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后TLR4、TLR3、NFκB、IL-1β表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :miR-186-5p通过调节CXCL13 对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响和机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和方法 |
| 2.2.1 检测沉默CXCL13和CXCR5 效果 |
| 2.2.2 验证抑制CXCL13/CXCR5 信号通路对脊髓缺血再灌注的影响 |
| 2.2.3 miR-186-5p的靶基因预测及生物信息学分析 |
| 2.2.4 检测干扰miR-186-5p的结果 |
| 2.2.5 干预miR-186-5p对缺血再灌注损伤后CXCL13/CXCR5 信号通路影像 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 沉默CXCL13/CXCR5 信号通路对脊髓缺血再灌注的影响 |
| 3.1.1 检测沉默CXCL13 和沉默CXCR5 效果 |
| 3.1.2 CXCL13表达随时间的变化及分布 |
| 3.1.3 沉默CXCL13对脊髓缺血再灌注后运动功能的影响 |
| 3.1.4 沉默CXCL13 对脊髓缺血再灌注后BSCB的影响 |
| 3.1.5 沉默CXCL13对脊髓缺血再灌注后前角运动神经元数量和形态的影响 |
| 3.1.6 沉默CXCL13 对脊髓缺血再灌注后CXCL13,CXCR5,ERK,p-ERK和 caspase-3的影响 |
| 3.1.7 沉默CXCL13 对脊髓缺血再灌注后IL-1β、IL-6、TNF-α |
| 3.1.8 沉默CXCR5对脊髓缺血再灌注后运动功能的影响 |
| 3.1.9 沉默CXCR5 对脊髓缺血再灌注后BSCB的影响 |
| 3.1.10 沉默CXCR5对脊髓缺血再灌注后神经元数量和形态的影响 |
| 3.1.11 沉默CXCR5 对脊髓缺血再灌注后CXCL13,CXCR5,ERK,p-ERK和 caspase-3的影响 |
| 3.1.12 沉默CXCR5 对脊髓缺血再灌注后IL-1β、IL-6、TNF-α |
| 3.2 miR-186-5p的靶基因预测及生物信息学分析 |
| 3.2.1 miR-186-5p的靶基因预测 |
| 3.2.2 miR-186-5p的靶基因的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO(Gene ontology)分析 |
| 3.3 干预miR-186-5p对缺血再灌注损伤后CXCL13/CXCR5 信号通路影像 |
| 3.3.1 检测干扰miR-186-5p表达效果 |
| 3.3.2 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的下肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的BSCB影响 |
| 3.3.4 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的组织学影响 |
| 3.3.5 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注后CXCL13,CXCR5,ERK,p-ERK和 caspase-3的影响 |
| 3.3.6 miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注后IL-1β、IL-6、TNF-α |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 :七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注损伤后miR-23a-3p/TRIL轴和miR-186-5p/CXCL13轴影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和方法 |
| 2.2.1 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-23a-3p和 TRIL表达的影响 |
| 2.2.2 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-186-5p和 CXCL13 表达的影响 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-23a-3p和 TRIL表达的影响 |
| 3.1.1 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注损伤12h运动功能的影响 |
| 3.1.2 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-23a-3p和 TRIL表达的影响 |
| 3.2 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-186-5p和 CXCL13 表达的影响 |
| 3.2.1 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注损伤24h运动功能的影响 |
| 3.2.2 七氟烷预处理对脊髓缺血再灌注后miR-186a-5p和 CXCL13 表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 MH和NBP联合作用对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：脑缺血再灌注损伤 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
四、EFFECT OF ELECTROACUPUNCTURE ON SERUM IL-1β AND TNF-α CONTENTS IN CEREBRAL ISCHEMIA-REPERFUSION RATS（论文参考文献）
- [1]IL-4诱导小胶质细胞向M2表型极化对缺血性卒中的影响及其机制研究[D]. 侯坤. 吉林大学, 2021(01)
- [2]The mechanisms through which auricular vagus nerve stimulation protects against cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Jing-Jun Zhao,Zheng-Hui Wang,Ying-Jie Zhang,Wen-Jing Wang,Ai-Fang Cheng,Pei-Jing Rong,Chun-Lei Shan. Neural Regeneration Research, 2022(03)
- [3]电针预处理调控肠道菌群与Th17/Treg免疫平衡降低大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制研究[D]. 张继瑶. 黑龙江中医药大学, 2021(01)
- [4]电针调控ABIN1表达对局灶脑缺血/再灌注大鼠神经炎性损伤的影响及机制研究[D]. 周雪灵. 重庆医科大学, 2021(01)
- [5]基于TLR4/NF-κB通路探究鬼箭羽醇提物对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响与机制[D]. 李相国. 湖北民族大学, 2021(12)
- [6]Mechanism underlying treatment of ischemic stroke using acupuncture:transmission and regulation[J]. Bing-Qian Cao,Feng Tan,Jie Zhan,Peng-Hui Lai. Neural Regeneration Research, 2021(05)
- [7]miR-211-5p通过下调COX2的表达改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤[D]. 彭哲. 重庆医科大学, 2020(12)
- [8]失笑散调控NLRP3炎性小体保护脑缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 李帆. 南京中医药大学, 2020(08)
- [9]miR-23a-3p和miR-186-5p对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的影响及机制的研究[D]. 陈凤收. 中国医科大学, 2020(01)
- [10]围手术期大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的研究[D]. 谢坤. 山东大学, 2019(02)