血管内皮损伤与动脉粥样硬化的关系

一、血管内皮损伤与动脉粥样硬化关系探讨（论文文献综述）

林泉^[1]（2021）在《西洋参丹参配伍调控PI3K/Akt/NF-κB通路稳定动脉粥样硬化易损斑块的作用机制研究》文中研究说明动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病的重要病理学基础,易损斑块破裂和继发性血栓形成是急性心血管事件发生的主要原因。易损斑块具有泡沫细胞聚集、脂质核心增大和纤维帽变薄等特点,这些特征与炎症反应、氧化应激和内皮损伤密切相关。近年来大量研究表明,PI3K/Akt/NF-κB信号通路与AS病理生理过程密切相关,参与炎症反应、氧化应激和内皮功能的调节,调控PI3K/Akt/NF-κB通路有望成为稳定AS易损斑块的新策略。益气活血养阴法是防治动脉粥样硬化性心血管病的基本治则之一,既往研究发现益气活血养阴方药可通过抑制血管炎症反应、氧化应激和保护内皮功能而发挥抗AS的作用;西洋参丹参配伍是常用的益气活血养阴药对,其能否抑制动脉粥样硬化病变进展、稳定AS易损斑块,还有待进一步深入研究。本课题通过开展系统评价、网络药理学、体内实验和体外实验研究探索西洋参丹参配伍对AS易损斑块的干预效应,探讨干预效应和PI3K/Akt/NF-κB通路之间的关系,旨在从循证医学、生物网络、物质基础、整体动物和细胞分子水平阐明西洋参丹参配伍稳定AS易损斑块的效应特点与作用机制。本课题研究分为两部分文献综述和实验研究。1文献综述:综述一西洋参丹参治疗动脉粥样硬化研究进展综述二PI3K/Akt/NF-κB信号通路在动脉粥样硬化中的研究进展2实验研究:包括以下五部分。研究一益气活血养阴方药治疗冠心病心绞痛的系统评价研究目的:应用meta分析方法,探讨益气活血养阴方药治疗冠心病心绞痛的疗效和安全性。方法:计算机检索 PubMed、EMbase、The Cochrane Library、CNKI、SinoMed、VIP和WanFang Data数据库,纳入益气活血养阴方药联合常规西药治疗冠心病心绞痛的相关RCT,检索时限为2010年1月1日至2021年1月31日,采用RevMan5.3软件进行Meta分析。结果:最终纳入15个Jadad评分≥4分的RCT,共1388例冠心病心绞痛患者。Meta分析结果显示,联合用药组的心绞痛疗效[RR=1.22,95%CI（1.15,1.29）,P<0.00001]、中医证候疗效[RR=1.16,95%C（1.08,1.25）,P=0.0001]、心电图疗效[RR=1.27,95%CI（1.16,1.39）,P<0.00001]、HDL-C[MD=0.52,95%CI（0.26,0.78）,P<0.0001]显着高于单纯常规西药治疗组,hs-CRP[SMD=-1.57,95%CI（-1.99,-1.14）,P<0.00001]、TC[MD=-1.05,95%CI（-1.57,-0.52）,P<0.0001]、TG[MD=-0.44,95%CI（-0.59,-0.29）,P<0.00001]、LDL-C[MD=-0.54,95%CI（-0.83,-0.24）,P=0.0004]、血浆粘度[MD=-0.38,95%CI（-0.57,-0.20）,P<0.0001]和纤维蛋白原含量[MD=-0.66,95%CI（-0.97,-0.36）,P<0.0001]显着低于单纯常规西药治疗组;在安全性方面,两组的不良反应发生率[RR=1.57,95%CI（0.63,3.91）,P=0.33]无统计学差异。结论:当前证据显示,与单纯常规西药治疗相比,益气活血养阴方药联合常规西药治疗能有效降低心绞痛患者的炎症、血脂和血液流变学指标水平,减轻心肌缺血,缓解临床症状,且具有较好的安全性。研究二基于网络药理学探讨西洋参丹参配伍治疗冠心病的作用机制目的:通过网络药理学方法,分析西洋参丹参配伍治疗冠心病的药理机制。方法:通过TCMSP数据库检索西洋参、丹参的活性成分及其靶点,并在Uniport数据库标准化靶点信息;通过Gencards、OMIM、TTD、DRUGBANK数据库获取冠心病相关靶点基因,使用R语言筛选药物和疾病交集靶点;通过String平台进行蛋白质相互作用分析,筛选关键靶点基因;采用DAVID数据库对交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析。结果:西洋参丹参配伍治疗冠心病的关键靶点为STAT3、AKT1、TP53、TNF、MAPK1等,生物学通路主要作用于HIF-1信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路等。结论:本研究初步揭示了西洋参丹参配伍多成分、多靶点、多通路治疗冠心病的作用机制,为进一步开展基础和临床研究提供理论支持和研究方向。研究三西洋参丹参药物有效部位的制备及高效液相色谱法成分含量测定目的:在前期研究基础上制备西洋参丹参有效部位,并采用HPLC法测定有效部位中关键成分的含量。方法:本部分研究采用加热回流法提取、减压浓缩、大孔树脂层析分离纯化和真空干燥冷冻法制备西洋参皂苷、丹参酮和丹参酚酸三个有效部位,通过HPLC法测定各有效部位中主要成分含量。结果:西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量分别为0.13%、0.98%、2.4%,共计为3.51%;丹参中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA含量分别为0.05%、0.11%、0.14%,共计0.30%,丹参中丹酚酸B含量为3.08%,均符合国家药典标准。西洋参皂苷有效部位中主要成分人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量分别为1.24%、12.82%、42.49%,共计56.55%;丹参酮有效部位中主要成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量分别为14.51%、4.72%、17.5%,共计36.73%;丹参酚酸有效部位中主要成分丹酚酸B含量为40.67%。结论:本研究按生药量1:3比例将西洋参、丹参分别进行提取纯化,得到西洋参皂苷、丹参酮和丹参酚酸三个有效部位,进而将西洋参、丹参有效部位混合均匀,制成益气活血养阴配伍有效部位,用于动脉粥样硬化药理实验研究。研究四西洋参丹参配伍干预ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块的作用机制研究目的:观察西洋参丹参配伍对ApoE-/-小鼠 AS易损斑块的影响,从炎症反应、内皮损伤和氧化应激角度探讨其作用机制。方法:90只ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养,造模12周后,随机分为模型组、辛伐他汀组（3.03mg/kg/d）、西洋参丹参有效部位低剂量组（以生药量计,西洋参0.75g/kg/d+丹参2.25g/kg/d）、西洋参丹参有效部位中剂量组（以生药量计,西洋参1.5g/kg/d+丹参4.5g/kg/d）、西洋参丹参有效部位高剂量组（以生药量计,西洋参3g/kg/d+丹参9g/kg/d）和西洋参丹参水煎剂组（以生药量计,西洋参1.5g/kg/d+丹参4.5g/kg/d）,15只C57BL/6J小鼠作为正常对照组;给予相应药物灌胃8周;采用主动脉油红O大体染色、主动脉根部H&E染色评估AS病变程度及斑块稳定性;采用全自动生化分析仪检测血脂指标水平;采用酶联免疫吸附法检测血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1和ET-1等指标水平;采用生化法检测血清MDA、SOD和NO等指标水平;采用蛋白质免疫印迹法检测MMP-9、p-PI3K、p-Akt和p-NF-κB蛋白表达水平。结果:①病理指标:主动脉油红O大体染色显示,模型组小鼠主动脉内膜可见脂质沉积,粥样斑块形成,较正常组明显红染,辛伐他汀组、西洋参丹参有效部位中剂量、高剂量和水煎剂组较模型组红染区域稀疏,脂质沉积明显减少,斑块面积与主动脉内膜面积比值显着降低（P<0.05）;主动脉H&E染色显示,模型组可见斑块突出管腔,管腔变窄,斑块表面纤维帽较薄且不均匀,斑块内可见脂质核心面积增大,大量的泡沫细胞聚集。各药物干预组较模型组斑块狭窄减轻,泡沫细胞数量降低,脂质核心面积减少。②血脂指标:与模型组相比,辛伐他汀和西洋参丹参高剂量组显着降低TG、TC水平（P<0.05）,西洋参丹参中剂量组显着升高HDL-C水平（P<0.05）。③炎症因子指标:与模型组比较,各药物干预组IL-1β、TNF-α水平均显着降低（P<0.05）,西洋参丹参中、高剂量组ICAM-1水平显着降低（P<0.05）。④内皮损伤指标:与模型组比较,辛伐他汀、西洋参丹参中、高剂量和水煎剂组NO含量均显着升高（P<0.05）,辛伐他汀、西洋参丹参中、高剂量和水煎剂组ET-1含量均显着降低（P<0.05）。⑤氧化应激指标:与模型组比较,各药物干预组SOD含量显着升高（P<0.05）,MDA含量显着降低（P<0.05）。⑥MMP-9:与模型组比较,各药物干预组MMP-9蛋白表达量均显着降低（P<0.05）;西洋参丹参有效部位中剂量组和水煎组相比,MMP-9表达无统计学差异（P>0.05）。⑦通路相关指标:与模型组比较,辛伐他汀组、西洋参丹参低、高剂量组p-PI3K蛋白表达量显着降低（P<0.05）;各药物干预组p-Akt蛋白表达量显着降低（P<0.05）;辛伐他汀、西洋参丹参中剂量、高剂量和水煎剂组p-NF-κB蛋白表达量显着降低（P<0.05）;西洋参丹参有效部位中剂量组和水煎组相比,p-PI3K、p-Akt和p-NF-κB表达均无统计学差异（P>0.05）。结论:西洋参丹参配伍能够通过抑制炎症反应、改善氧化应激、减轻内皮损伤和降低主动脉MMP-9蛋白表达,减少脂质沉积和斑块面积,抑制斑块进展,稳定动脉粥样硬化易损斑块,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活有关。研究五西洋参丹参配伍干预ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤的作用机制研究目的:观察西洋参丹参配伍对内皮细胞损伤的影响,探讨其作用机制。方法:根据实验三获得有效部位中人参皂苷Rb1和丹酚酸B的配比,称量相应质量的单体,混合均匀,作为干预药物。建立ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型,分为正常对照组、模型组（ox-LDL 75μg/mL）、西洋参丹参低剂量组（ox-LDL 75μg/mL+中药单体5μg/mL）、西洋参丹参高剂量组（ox-LDL75μg/mL+中药单体25μg/mL）、西洋参丹参高剂量组+740YP组（ox-LDL 75μg/mL+中药单体25μg/mL+740YP25μg/mL）,给予相应药物干预24h;采用CTG检测细胞活性;采用ELISA法检测ICAM-1和MMP-9含量;采用生化法检测MDA和SOD水平;采用蛋白质免疫印迹法检测p-PI3K、p-Akt和p-NF-κB蛋白表达水平。结果:①CTG指标:与模型组相比,西洋参丹参低、高剂量组细胞活性明显增加（P<0.05）;740YP组与高剂量组相比,细胞活性明显减低（P<0.05）。②炎症因子指标:与模型组相比,西洋参丹参低、高剂量组ICAM-1、MMP-9明显降低（P<0.05）;740YP组与高剂量组相比,ICAM-1、MMP-9明显升高（P<0.05）。③氧化应激指标:与模型组相比,西洋参丹参高剂量组SOD明显增加,MDA明显降低（P<0.05）;740YP组与高剂量组相比,SOD明显减低,MDA明显升高（P<0.05）。④通路相关指标:与模型组相比,西洋参丹参低、高剂量组p-PI3K、p-Akt和p-NF-κB明显降低（P<0.05）;740YP组与高剂量组相比,p-PI3K、p-Akt和p-NF-κB明显升高（P<0.05）。结论:西洋参丹参配伍能够通过抑制PI3K/Akt/NF-κB通路提高细胞活性、改善氧化应激和抑制炎症反应,减轻内皮细胞损伤,保护内皮细胞。

周芳^[2]（2021）在《基于差异表达的LncRNA TUG1研究小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的作用机制》文中研究指明目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CHD）是由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。一项由国家心血管病中心组织编撰体现我国心血管疾病流行与防治的报告—《中国心血管病报告2018》中分析指出:目前我国约有3亿口人被确诊罹患心血管疾病,其中冠状动脉粥样硬化性心脏病患者人数超过1100万,位列心血管疾病第二,并且死亡率在心血管疾病中位列第一,这给社会和家庭带来了很大的负担。因此,安全有效的防治工作对降低冠心病的病亡率具有重要意义。血管内皮细胞功能障碍在冠心病的发生、发展过程中具有举足轻重的作用,其贯穿冠状动脉粥样硬化的始动、发展及临床事件整个过程。中医作为中华民族的瑰宝,历经时间的沉淀和反复验证,在保护血管内皮、改善血管内皮功能方面治疗冠心病具有独特优势。近年来,随着高通量基因测序技术、基因转录组学的不断革新进步,非编码RNA（noncoding RNA,nc RNA）在各种疑难疾病中揭开神秘面纱,有关其在心血管疾病中研究不在少数,这为心血管疾病的防治提供重要思路,也为疾病的基因治疗夯实基础。牛磺酸上调基因1（Taurine up-regulated1,TUG1）首先是在体外培养的新生小鼠视网膜细胞中被发现,后来被证实在损伤血管内皮细胞中高表达,可以通过介导血管内皮细胞的损伤参与心血管疾病的发病。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK）信号通路的激活在内皮细胞损伤中发挥重要作用,可以通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录,调控活性物质的表达,参与血管内皮细胞氧化应激损伤、凋亡等过程。基于差异表达的LncRNA TUG1与p38MAPK信号通路在冠心病血管内皮损伤中的重要作用,本研究将以保护血管内皮细胞作为切入点深入探讨小陷胸加味汤治疗冠心病作用机制,旨在为小陷胸加味汤的临床应用提供科学依据。方法:1.通过理论研究探索冠心病中医病名、病因病机、中医治疗的历史渊源及进展,揭示小陷胸汤治疗冠心病（痰热互结证）的中医辨证思路。基于中医药改善血管内皮功能治疗冠心病的独特优势,从基因层面及分子生物学层面挖掘小陷胸汤治疗冠心病（痰热互结证）可能潜在的作用机制,为下一步我们临床应用小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）研究夯实理论基础。2.小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的临床观察及血管内皮功能的影响。选取56例冠心病（痰热互结证）患者,随机分为小陷胸加味汤组和对照组,小陷胸加味汤组在对照组西医常规治疗基础上予以小陷胸加味汤,疗程均为30天,分别观察（1）临床指标:中医临床症状,心绞痛发作次数、持续时间及发作程度;（2）实验室指标:心电图检查记录心绞痛发作时S-T段及T波的变化;血管内皮相关指标一氧化氮（NO）和内皮素（ET）分泌水平;（3）药物不良反应评价指标:血常规、尿常规、肝肾功能等。3.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1与血管内皮损伤相关性研究。随机选取15例冠心病（痰热互结证）患者,另设健康对照组15例。所有入选对象取血6ml,Real-Time PCR法检测外周血单个核细胞中LncRNA TUG1,免疫学方法测定循环内皮细胞计数,硝酸还原酶法测定一氧化氮分泌水平,放射免疫法测定内皮素分泌水平。采用Pearson相关分析,分别将LncRNA TUG1与循环内皮细胞计数、一氧化氮、内皮素做相关分析。4.基于中药血清药理学研究及时效关系研究,探索小陷胸汤加味汤调控差异表达的LncRNA TUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。选用SPF级SD大鼠经灌胃给药制备小陷胸加味汤含药血清及空白对照血清;TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）制备内皮损伤模型,MTT法筛选最佳含药血清浓度及作用时间。实验分为模型组、空白血清组、小陷胸加味汤含药血清组,分别应用运用培养基、空白组血清及最佳小陷胸加味汤含药血清进行干预。采用RT-PCR法检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导的损伤HUVEC中LncRNA TUG1的表达;Western Blot检测TNF-α诱导的损伤HUVEC中p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38的表达水平。采用Pearson相关分析来分析差异表达的LncRNA TUG1与内皮细胞p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38之间的相关性。结果:1.小陷胸汤源于《伤寒论》,后世医家在遵循原文的基础上不断扩义,明确提出在审明痰热互结病机的条件下,小陷胸汤能从多靶标、多途径、多层次改善血管内皮治疗冠心病。2.小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的临床疗效及对血管内皮功能的影响。小陷胸加味汤组能明显改善心绞痛症状和中医证候,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）,总有效率分别为92.86%和96.43%,心电图疗效总有效率为92.86%,优于对照组（P>0.05）。治疗后,两组NO分泌水平上调（P<0.05）,ET分泌水平降低（P<0.05）。两组治疗前后血常规、尿常规、肝肾功能等均无临床意义,小陷胸加味汤组出现1例胃痛（3.57%）,2例腹胀（7.14%）。对照组出现2例头昏、头痛（7.14%）,2例腹胀（7.14%）。3.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1与血管内皮损伤相关性研究。冠心病（痰热互结证）患者外周血中LncRNA TUG1相对表达量增加;血管内皮损伤相关指标循环内皮细胞、ET的分泌水平、NO的分泌水平与健康对照组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）,分别为循环内皮细胞计数增加,ET分泌增加,NO分泌降低。Pearson相关分析显示:冠心病（痰热互结证）患者外周血中LncRNA TUG1与循环内皮细胞计数呈显着正相关（r=0.56,P=0.03）,与NO的分泌（r=-0.58,P=0.02）呈显着负相关,同时与ET的分泌水平呈显着正相关（r=0.62,P=0.01）。4.小陷胸加味汤调控差异表达的lnc RNA TUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。时效关系研究发现小陷胸加味汤含药血清以一定的时间-剂量依赖方式改善TNF-α诱导损伤HUVEC细胞的增值能力。最终选用20%小陷胸加味汤含药血清干预TNF-α诱导损伤HUVEC细胞24小时。Real-Time PCR结果显示,LncRNA TUG1的相对表达水平在模型组的平均值为1.00,在空白血清组中的平均值为0.98,在20%小陷胸加味汤含药血清组中的平均值为0.96,小陷胸加味汤含药血清组与模型组、空白血清组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western Blot结果显示,20%小陷胸加味汤含药血清组中p38、P-p38蛋白表达量明显下调,与模型组、空白血清组比较差异均具有显着统计学意义（P<0.05）。Pearson相关分析显示LncRNA TUG1的相对表达量与p38、P-p38蛋白的表达呈显着正相关,分别为（r=0.997,P=0.048）,（r=0.990,P=0.017）。结论:1.小陷胸加味汤联合西医常规治疗能有效改善冠心病（痰热互结证）临床症状和血管内皮功能。2.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1表达具有差异性,差异表达的LncRNA TUG1与血管内皮损伤存在一定相关性。3.小陷胸加味汤含药血清能够通过调控差异表达的LncRNA TUG1进而减少p38MAPK信号通路相关蛋白的表达,减轻内皮细胞损伤。4.在审明病机的前提下,小陷胸加味汤可以从基因层面、分子生物学层面改善血管内皮功能治疗冠心病（痰热互结证）。

陈芳芳^[3]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。

曾洁^[4]（2021）在《茶黄素减轻高脂诱导血管内皮损伤及动脉粥样硬化发展的作用及机制研究》文中研究指明红茶作为全球最流行的饮料之一,研究发现,其具有多种对人体有益的健康功效,包括抗氧化作用、抗炎作用、减肥降脂作用等。心血管病（CVD）是严重威胁居民生命健康的慢性非传染性疾病,目前,我国CVD患病人数约有2.9亿人,由其造成的死亡人数占疾病致死总人数之首,其发生发展与膳食因素密切相关。红茶饮用与CVD的关系广受关注,但截止目前,针对红茶摄入与CVD发病率之间的流行病学研究结论并不一致;红茶是否具有心血管保护作用尚不明确,且内在的分子机制仍不清楚。动脉粥样硬化（AS）是CVD的关键共同病理起因,而血管内皮细胞损伤又是AS的早期关键环节。因此,保护血管内皮细胞免受损伤,是预防AS和CVD的重要策略。本课题通过体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,以高浓度胆固醇诱导细胞损伤,并以高脂膳食诱发ApoE-/-小鼠体内AS的发生发展,构建体内外实验模型;观察和评价红茶中主要生物活性成分——茶黄素（TF）,对内皮细胞损伤的保护作用,以及对体内AS发生发展的抑制作用;同时深入探讨相关作用机制,旨在揭示红茶潜在的心血管保护效应及其分子机理。主要研究结果如下:（1）实验一。在0～100μmol/L浓度范围内,茶黄素对HUVECs无明显毒性作用。以10μmol/L的胆固醇刺激HUVECs 24 h,成功构建体外细胞损伤模型。与模型组相比,茶黄素预处理组（5、10μmol/L）的细胞活力和NO的分泌量显着升高（P<0.05）,而细胞凋亡率和LDH释放量显着降低（P<0.05）。此外,胞内ROS和MDA含量均显着降低（P<0.05）。以上结果说明,一定剂量的茶黄素预处理可有效减轻高浓度胆固醇诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤。（2）实验二。以高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠12周,成功构建AS体内模型。与高脂组相比,茶黄素低高剂量组（5、10 mg/kg·d）小鼠的体重有所降低,但不存在显着性差异（P>0.05）。茶黄素低高剂量组小鼠血清中TC、LDL-C水平显着降低（P<0.05）,同时,茶黄素高剂量组（10 mg/kg·d）小鼠血清中TG水平显着降低,而HDL-C水平显着增加（P<0.05）。对小鼠主动脉进行病理切片观察表明,与高脂组相比,茶黄素低高剂量组小鼠的主动脉壁内膜明显较薄,泡沫细胞的集聚和脂质沉积得以改善,斑块面积显着减少（P<0.05）,胶原形成。同时,主动脉内ROS和MDA含量显着降低（P<0.05）。此外,茶黄素低高剂量组小鼠主动脉组织内MMP-2/9的m RNA水平显着降低（P<0.05）,茶黄素低剂量组小鼠主动脉内MMP-2的蛋白质表达水平以及茶黄素高剂量组小鼠主动脉内MMP-2/9的蛋白质表达水平显着降低（P<0.05）。以上结果说明,一定剂量的茶黄素膳食干预能有效减轻高脂膳食引起的ApoE-/-小鼠体内AS的病理进展。（3）实验三。茶黄素处理可在不同程度上提高细胞和小鼠主动脉内SOD、CAT和GSH-Px的活力。Western blot检测结果显示,茶黄素可有效上调Nrf2和HO-1蛋白质的表达,激活Nrf2/HO-1信号通路。此外,加入Nrf2抑制剂ML385,可明显降低茶黄素预处理组（10μmol/L）的细胞活力以及Nrf2、HO-1蛋白质的表达水平,并增加细胞凋亡率。以上结果说明,茶黄素能激活Nrf2/HO-1通路来发挥对血管内皮损伤的保护作用。综上所述,茶黄素可有效减轻高脂诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤,并能明显减轻高脂膳食引起的体内AS的病理进展,其作用机制可能是通过激活Nrf2/HO-1通路实现的。

何信用^[5]（2021）在《二陈汤合桃红四物汤调控p53/SLC7A11介导的氧化损伤及铁死亡抗AS的机制研究》文中认为目的:1.借助网络药理学方法预测二陈汤合桃红四物汤防治动脉粥样硬化的潜在分子机制。2.通过观察二陈汤合桃红四物汤对p53/SLC7A11介导Apo E基因敲除小鼠主动脉和ox-LDL诱导的细胞氧化应激性损伤及铁死亡的干预作用,从体内外两个层面来探讨二陈汤合桃红四物汤抗动脉粥样硬化的作用机制,为中医药的防治提供新的实验依据。材料与方法:本研究分为两个部分:1.二陈汤合桃红四物汤防治AS潜在分子机制的网络数据分析;2.体内外实验探究二陈汤合桃红四物汤对氧化损伤及铁死亡的干预作用。1.二陈汤合桃红四物汤防治AS潜在分子机制的网络数据分析。通过TCMSP数据库筛选二陈汤合桃红四物汤的成分及靶点,TTD、Dis Ge NET、Drugbank数据库筛选动脉粥样硬化的靶点,将二者所得的靶点通过Uniprot进行靶点基因标准化后利用VENNY进行映射,其结果结合文献资料中所收集到的关于AS及中药组方的靶点,通过STRING数据库进行PPI网络的分析,并以“tsv”格式保存,同时利用DAVID数据库进行GO功能以及KEGG信号通路分析,并通过Cytoscape软件及Omic Share云平台进行数据可视化处理。2.分别从体内外实验探究二陈汤合桃红四物汤对氧化损伤及铁死亡的干预作用。2.1体内实验10只C57BL/6J野生小鼠作为正常组给予普通饲料饲养,50只C57BL/6J背景Apo E-/-小鼠给予给予高脂饲料饲养复制动脉粥样硬化模型,适应性饲养后,均分为模型组,中药低、中、高剂量组以及辛伐他汀组。其中正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃,中药低、中、高3组给予生药量分别为0.72g/m L,1.44g/m L,2.89g/m L浓度不同中药煎剂早晚日2次灌胃,辛伐他汀组给予辛伐他汀片水溶剂0.26mg/m L每晚1次进行灌胃。给药4周后,于末次给药2h后进行血液及主动脉样本的采集。采用HE染色观察小鼠主动脉组织病理形态学变化;采用比色法观察小鼠血清SOD、MDA、GSH氧化及抗氧化指标水平;采用免疫组化法检测主动脉COX2、FTH1蛋白表达情况;采用Western blot及q RT-PCR技术检测主动脉组织氧化应激及铁死亡相关蛋白及基因的表达情况。2.2体外实验首先20只SPF级SD大鼠均分为2组,一组给予生药量为2.0g/m L的二陈汤合桃红四物汤中药煎剂,每日两次,每次2m L,另一组给予等量生理盐水灌胃。连续灌胃1周后,于末次给药2h后进行腹主动脉血液采集,分离上清液,其中给予中药煎剂灌胃组的血清是含药血清,给予生理盐水灌胃组的血清对照血清,提取后备用。将购买的EA.hy926细胞株于10%胎牛血清的DMEN高糖培养基中培养,待传代一定程度后将细胞分成3组,3组细胞均用DMEM高糖培养基培养,其中对照组培养基中含有10%对照血清,ox-LDL组在培养基中加入10%对照血清及50mg/L的ox-LDL,含药血清组,是将ox-LDL组中10%对照血清替换为10%含药血清,3组进行培养12h,之后进行下一步的指标检测。采用原位探针的方法检测各组细胞内ROS水平;采用比色法观察各组细胞SOD、MDA、GSH水平变化;采用Western blot及q RT-PCR技术检测各组细胞发生氧化损伤及铁死亡相关蛋白及基因的表达情况。结果:1.二陈汤合桃红四物汤防治AS潜在分子机制的网络数据分析1.1 TCMSP数据库共得到二陈汤合桃红四物汤成分208个,主要有谷甾醇、槲皮素、黄芩素、β-胡萝卜素、β谷甾醇等,319个靶点主要有TNF、NOS3、SOD1等;TTD、Dis Ge NET、Drugbank数据库共得到AS相关的175个潜在靶点,包括SLC7A11、PTGS2等。映射靶蛋白为54个,结合文献资料共获得60个相关蛋白。1.2 GO生物功能结果共获得262条BP,包括氧化还原法、氧化应激反应等;28条CC,涉及细胞器膜、质膜、线粒体等;42条MF,包括谷胱甘肽合成、过氧化物酶活性等。KEGG结果经筛选后共获得53条信号通路,主要包括谷胱甘肽代谢、NF-ΚB信号通路。2.体内外实验结果2.1体内实验:2.1.1 HE染色结果显示显示,与正常组比较,模型组主动脉管腔变窄,有较大斑块形成,且其内部可见大量炎性及泡沫细胞,经过药物干预后,各治疗组皆有改善,其中以中药中、高剂量组及辛伐他汀组改善较为显着,炎性及泡沫细胞明显减少,斑块组织缩小,内膜相对完整且光滑。2.1.2血清SOD、MDA、GSH结果显示,与正常组比较,模型组小鼠血清SOD、GSH水平明显降低（P<0.01）,而血清MDA水平显着提高（P<0.01）;相比于模型组,各治疗组血清SOD及GSH水平提高（P<0.01或P<0.05）,血清MDA水平有所下降（P<0.01或P<0.05）,其中以中药中、高剂量组及辛伐他汀组较为显着（P<0.01）。2.1.3免疫组化检测主动脉COX2及FTH1蛋白表达情况显示,相较于正常组,模型组COX2表达明显增多,FTH1表达反而显着减少;相比于模型组,各治疗组COX2有不同程度的减少,FTH1的表达结果相反。其中以中药中、高剂量组及辛伐他汀组表达差异较为显着。2.1.4 Western blot检测主动脉相关蛋白结果显示,相较于正常组,模型组小鼠主动脉COX2、NOX1、p53蛋白水平显着提高（P<0.01）,GPX4、FTH1、SLC7A11蛋白水平结果相反（P<0.01）;相比于模型组,经药物干预后,各治疗组小鼠主动脉COX2、NOX1、p53蛋白表达水平有不同程度的下降（P<0.01或P<0.05）,而GPX4、FTH1、SLC7A11蛋白水平结果与之相反（P<0.01或P<0.05）,且FTH1蛋白在辛伐他汀组的表达差异并无统计学意义。2.1.5 q RT-PCR检测主动脉相关基因结果显示,相较于正常组,模型组小鼠主动脉PTGS2m RNA、p53 m RNA、NOX1 m RNA水平显着上调（P<0.01）,GPX4 m RNA、FTH1 m RNA、SLC7A11 m RNA水平显着下调（P<0.01）;相较于模型组,经药物干预后,各治疗组小鼠主动脉PTGS2 m RNA、p53 m RNA、NOX1 m RNA水平有不同程度的下降（P<0.01或P<0.05）,GPX4 m RNA、FTH1 m RNA、SLC7A11 m RNA变化成相反趋势（P<0.01或P<0.05）。2.2体外实验:2.2.1各组细胞内ROS表达于荧光显微镜观察显示,相较于对照组,ox-LDL组的荧光亮度提升且数量增多;相较于ox-LDL组,含药血清组的细胞荧光数量减少且亮度减弱。2.2.2比色法观察细胞总SOD、MDA、GSH水平变化结果显示,相较于对照组,ox-LDL组细胞SOD及GSH水平显着降低（P<0.01）,而MDA表达水平显着提高（P<0.01）;相较于ox-LDL组,含药血清组SOD及GSH水平显着提高（P<0.01）,MDA表达相反（P<0.01）。2.2.3 Western blot检测细胞相关蛋白结果显示,相较于对照组,ox-LDL组细胞COX2、NOX1、p53蛋白结果显着上调（P<0.01）,FTH1、GPX4、SLC7A11蛋白表达结果相反（P<0.01）;相比于ox-LDL组,含药血清组细胞COX2、NOX1、p53蛋白水平显着下降（P<0.01）,FTH1、GPX4、SLC7A11蛋白表达水平上升（P<0.01）。2.2.4 q RT-PCR检测细胞相关基因结果显示,相较于对照组,ox-LDL组细胞PTGS2 m RNA、NOX1 m RNA、p53 m RNA水平显着上升（P<0.01）,FTH1 m RNA、GPX4 m RNA、SLC7A11 m RNA水平显着下降（P<0.01）;相较于ox-LDL组,含药血清组细胞GPX4m RNA、FTH1 m RNA、SLC7A11 m RNA表达明显上调（P<0.01）,PTGS2 m RNA、NOX1m RNA、p53 m RNA表达结果相反（P<0.01）。结论:1.二陈汤合桃红四物汤是多成分、多靶点通过多种生物学过程及信号通路共同发挥防治动脉粥样硬化的作用,其机制可能与氧化应激、糖脂代谢、炎症反应等病理过程密切相关。2.基于“痰瘀论治”理论指导下的二陈汤合桃红四物汤抗动脉粥样硬化的机制可能是通过调控p53/SLC7A11介导的氧化损伤及铁死亡有关。3.体内外实验均表明p53/SLC7A11信号通路能够促进血管内皮细胞氧化损伤及铁死亡的病理过程,而二陈汤合桃红四物能够干预该信号通路。

孟庆海^[6]（2021）在《泽泻醇B乙酸酯通过调节肠道菌群和肠道雌激素受体抗绝经后动脉粥样硬化的机制研究》文中认为目的:探究绝经后女性雌激素受体下调、肠道菌群变化及绝经后血管损伤之间的相关性,探究泽泻醇B乙酸酯能否通过调节肠道菌群和肠道雌激素受体抗绝经后动脉粥样硬化并探索其可能机制。方法:第一章:收集接受主动脉置换术的绝经前（<45岁）和绝经后（>55岁）女性主动脉血管及绝经前（<45岁）正常女性和绝经后（>55岁）冠心病女性患者粪便。16SrRNA基因高通量测序分析女性粪便中的肠道菌群,HE染色观察女性主动脉血管的病理变化,透射电镜观察女性血管中的超微结构变化,免疫组化染色检测女性血管中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ERα、ERβ、GPER、SRC、PI3K 和 p-AKT 的表达。分析绝经前后女性主动脉炎症、雌激素受体表达及肠道菌群组成的相关性。第二章:使用LDLR-/-小鼠合并高脂饮食复制动脉粥样硬化模型,对动脉粥样硬化模型小鼠进行双侧卵巢切除复制绝经后动脉粥样硬化模型（模型组）,同时设置C57BL/6正常饮食和高脂饮食组以及LDLR-/-小鼠正常饮食组。对绝经后动脉粥样硬化模型小鼠分别进行AB23A治疗实验、粪菌移植实验及AB23A与抗生素联合应用实验。实验周期结束后,使用生化试剂盒检测小鼠血清中TC、TG、LDL-c及HDL-c 水平以评价血脂,ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平以评价血清炎症,油红O染色检测小鼠主动脉及主动脉根部切片中阳性面积以评价动脉粥样硬化损伤,Masson染色检测小鼠主动脉根部切片中胶原以评价纤维帽面积,免疫组织化学染色检测小鼠主动脉根部切片及结肠中NLRP3和IL-1β的表达水平以评价组织炎症,HE染色检测小鼠结肠组织形态以评价组织病理损伤,免疫组织荧光染色检测小鼠结肠中Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达水平以评价紧密连接的状态,蛋白印迹法检测小鼠结肠组织中NLRP3、IL-1β、Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表达水平以进一步确认结肠中炎症和紧密连接状态。16SrRNA基因高通量测序分析小鼠粪便中肠道菌群。分析AB23A模型小鼠治疗实验中小鼠动脉粥样硬化相关症状、肠道菌群及紧密连接之间相关性。第三章:对绝经后动脉粥样硬化模型小鼠进行AB23A治疗实验。实验周期结束后,使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中雌激素水平,免疫组织化学染色检测小鼠结肠中ERα、ERβ、GPER和SRC的表达水平,免疫组织荧光染色检测小鼠结肠中PI3K和p-AKT的表达水平,蛋白印迹法检测小鼠结肠组织中ERα、ERβ、GPER、SRC、PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达水平。应用胆固醇负荷的Caco-2细胞复制肠道上皮细胞损伤模型,使用AB23A并联合ERα抑制剂MPP、ERβ抑制剂PHTPP、GPER抑制剂G-15、PI3K抑制剂LY294002或AKT抑制剂10-DEBC抑制相应蛋白,或联合ERα siRNA、ERβ siRNA、GPER siRNA或SRC siRNA沉默相应基因的表达,作用于Caco-2细胞,并建立不同的对照和分组。MTT法检测细胞活性,油红O染色评价细胞脂质堆积,免疫荧光法检测细胞中 SRC、ERα、ERβ、GPER、PI3K、p-AKT、Claudin-1、Occludin 及 ZO-1 单独或共同表达的情况,蛋白印迹法检测细胞中SRC、ERα、ERβ、GPER、NLRP3、IL-1β、PI3K、p-AKT、Claudin-1、Occludin、ZO-1的蛋白表达情况,免疫共沉淀法检测细胞中GPER与SRC的相互作用。结果:第一章:与绝经前女性相比,绝经后女性血管内皮层和平滑肌均呈现更严重的损伤及 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表达的升高,而 ERα、ERβ、GPER、SRC、PI3K 和 AKT的表达均显着降低。与正常绝经期女性相比,绝经后冠心病女性粪便中肠道菌群的物种丰度和物种多样性显着降低;特定水平的物种相对丰度变化显着,如门水平上,Firmicutes、Tenericutes及Fusobacteria等细菌门的相对水平在绝经后女性的粪便中显着降低,而Verrucomicrobia及Bacteroidetes等细菌门的相对水平显着升高,属水平上,Clostridium 及Faecalibacterium等细菌属的相对水平显着降低,而 Shigella、Lactobacillus及Bacteroides等细菌属的相对水平显着升高。相关性分析显示绝经前后女性主动脉炎症、雌激素受体表达及肠道菌群组成之间具有显着的相关性。第二章:与动脉粥样硬化小鼠相比,绝经后动脉粥样硬化小鼠血脂、血清炎症水平和动脉粥样硬化损伤进一步增加,并导致结肠炎症、紧密连接损伤和病理性变化的加剧,AB23A的治疗显着降低模型小鼠血脂、血清炎症水平和动脉粥样硬化损伤,并显着减轻结肠炎症、紧密连接损伤和病理性变化;与动脉粥样硬化小鼠相比,绝经后动脉粥样硬化小鼠的肠道菌群的丰度和多样性显着降低,且特定物种水平上相对丰度发生显着改变,AB23A的治疗显着增加模型小鼠肠道菌群的丰度和多样性,并逆转模型小鼠特定物种水平上相对丰度的变化,如AB23A的治疗显着增加模型小鼠粪便内降低的Firmicutes细菌门的相对水平,显着降低模型小鼠粪便内升高的Verrucomicrobia细菌门的相对水平,在属水平上,AB23A的治疗显着降低模型小鼠的粪便中Bacteroides和Akkermansia等细菌属的相对水平;相关性分析显示小鼠的动脉粥样硬化相关症状、肠道菌群组成及紧密连接之间呈现显着相关性。粪菌移植导致模型小鼠肠道菌群丰度、多样性和特定物种水平上相对丰度向供体小鼠靠近;接受模型组小鼠粪便的受体小鼠的肠道菌群丰度和多样性显着低于接受AB23A治疗组粪便的受体小鼠,具有同样变化的还包括特定物种水平上的相对丰度;改变模型小鼠肠道菌群结构足以引起血脂、血清炎症和动脉粥样硬化症状以及结肠炎症、紧密连接损伤和病理性变化显着改变,与接受模型组小鼠粪便的受体小鼠相比,接受AB23A治疗组粪便的受体小鼠的血脂、血清炎症和动脉粥样硬化损伤显着降低,结肠炎症、紧密连接损伤和病理性变化显着减轻。抗生素显着抑制各组小鼠肠道菌群的丰度和多样性;给予抗生素的模型组小鼠中,总胆固醇水平、血清炎症和动脉粥样硬化症状显着降低,结肠炎症、紧密连接损伤和病理性变化显着减轻;AB23A对给予抗生素的模型组小鼠的治疗仍促进了肠道菌群的丰度和多样性;抗生素的应用,增强了 AB23A对模型小鼠血脂、血清炎症和动脉粥样硬化损伤的降低作用及对结肠炎症、紧密连接损伤和病理性变化的减轻作用。第三章:双侧卵巢的切除,导致高脂饮食LDLR-/-小鼠雌激素受体、雌激素水平及SRC表达的显着降低,同时显着降低的还有PI3K/AKT信号,AB23A未影响模型小鼠雌激素水平,但显着上调肠道中雌激素受体和SRC的表达,并上调PI3K/AKT信号。胆固醇的负荷导致Caco-2细胞中胆固醇堆积、炎症增加和紧密连接损伤;AB23A减轻胆固醇作用的Caco-2细胞中胆固醇堆积、炎症和紧密连接损伤,上调SRC的表达并增强PI3K/AKT信号。使用ERα或ERβ的抑制剂或ERα或ERβ的基因被沉默时,未影响AB23A对胆固醇作用的Caco-2细胞胆固醇堆积和炎症的抑制以及紧密连接的保护作用,也未影响AB23A对GPER和SRC的上调作用,同样未影响AB23A对PI3K/AKT信号的激活;使用GPER抑制剂或GPER siRNA时,AB23A对胆固醇作用的Caco-2细胞胆固醇堆积和炎症的抑制以及紧密连接的保护作用被取消,同时被取消的还包括AB23A对SRC的上调作用和对PI3K/AKT信号的激活。SRC的基因被沉默时,AB23A对胆固醇作用的Caco-2细胞胆固醇堆积和炎症的抑制以及紧密连接的保护作用被取消,AB23A对PI3K/AKT信号的激活作用同样被取消,但未影响AB23A对胆固醇作用的Caco-2细胞雌激素受体表达的上调作用。PI3K/AKT信号被阻断时,AB23A对胆固醇作用的Caco-2细胞胆固醇堆积和炎症的抑制以及紧密连接的保护作用被取消;但是PI3K/AKT信号的抑制未影响AB23A对雌激素受体和SRC的上调作用。结论:1.绝经后女性血管炎症和损伤的增加与雌激素受体信号降低及肠道菌群的紊乱具有显着的相关性。2.AB23A可通过调节肠道菌群减轻绝经后LDLR-/-小鼠肠道炎症并保护肠屏障,进而降低绝经后小鼠的血脂、血清炎症及血管炎症,抑制绝经后小鼠动脉粥样硬化的发生发展。3.AB23A通过激活结肠上皮细胞GPER上调SRC表达并激活下游的PI3K/AKT信号进而抑制结肠上皮细胞炎症和紧密连接损伤是其抑制绝经后小鼠动脉粥样硬化发生发展的机制之一。

沈宇平^[7]（2021）在《基于肠道菌群相关宿主代谢产物探讨电针防治动脉粥样硬化作用的实验研究》文中研究说明目的:基于“痰瘀毒”致动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）理论,复制动脉粥样硬化家兔模型,通过观察家兔一般情况、血脂水平和血液黏稠度、颈总动脉组织结构、肠道菌群结构特征、宿主血浆差异代谢物及肠道菌群与宿主代谢物的相关性,研究电针防治干预对AS相关宿主代谢物及代谢通路的影响,探讨电针防治干预抗AS的可能途径。材料与方法:1.造模与干预:24只新西兰大耳兔,经适应性喂养1周后,根据完全随机数字表法分为3组,即空白对照组,造模组和电针防治组。其中空白对照组6只,造模组12只,电针防治组6只。AS兔模型复制采用高脂饲养+颈总动脉球囊损伤术的方法（造模评价在预实验完成）。造模成功后,将造模组再随机平均分为两组,即模型对照组和电针对照组,每组6只,分别标记。空白对照组（A）在实验全程中喂以标准兔饲料,不施加干预因素,仅绑缚,全程限制运动;模型对照组（B）和电针对照组（C）造模完成后继续高脂饲料喂养。B组不施加任何干预,仅绑缚,全程限制运动;C组予电针干预“内关”、“关元”、“足三里”穴,每日一次,每次20 min,6日为一疗程,各疗程间休息1日,共4个疗程,全程限制运动;电针防治组（D）在造模前使用电针干预内关、关元、足三里穴,每日一次,每次20 min,6日为一疗程,各疗程间休息一日,共3个疗程,造模后继续电针干预内关、关元、足三里穴,每日一次,每次20 min,6日为一疗程,各疗程间休息1日,共4个疗程,全程限制运动。2.指标检测:造模前根据已有量表评估家兔一般健康状况。造模与干预结束后,再次评估一般健康状况,使用Elisa试剂盒检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量;使用全自动血液流变仪检测全血黏度（高切、中切、低切）和毛细管血浆黏度指标;使用油红O染色法,肉眼观察血管内壁上的脂质斑块沉积情况;使用HE染色法,显微镜观察主动脉血管内皮损伤情况;使用16S rRNA高通量基因测序技术,观察肠道菌群相对丰度与多样性的变化;采用高效液相色谱串联质谱法检测血浆中的小分子代谢物,观察宿主代谢物的变化情况。3.联合分析:整合微生物组学与非靶代谢组学的数据进行关联分析,进一步研究电针防治干预调节肠道菌群相关宿主代谢物实现抗AS的作用,并探索其可能的途径。结果:论文一:家兔一般情况比较结果显示,造模及干预前,各组一般情况评分无统计学差异（P>0.05）;经各组相应造模及干预后,评分以B组最高,与B组比较,C、D与A评分低,差异有统计学意义（P<0.05）。血清血脂检测结果显示,与A组比较,B组经造模后血清TG、TC、LDL-C含量显着升高（P<0.01）,HDL-C含量显着降低（P<0.01）。与B组比较,C组和D组的血清TG、TC、LDL-C含量均显着降低（P<0.05或P<0.01）,HDL-C含量均显着升高（P<0.01）;但两组之间存在组间差异,以D组血清TG（P<0.01）、TC（P<0.05）、LDL-C（P<0.05）含量较C组更低。血液流变学检测结果显示,与A组比较,B组经造模后全血黏度（低切、中切、高切）、血浆黏度均显着升高（P<0.01）。与B组比较,C组与D组的全血黏度（低切、中切、高切）、血浆黏度均显着降低（P<0.01）;A组、C组、D组无统计学上的组间差异（P>0.05）。论文二:经过油红O染色后,A组的颈总动脉组织呈乳白色,其内侧面,整体内皮光滑,内皮上基本没有沉积的脂质;B组的颈总动脉内皮粗糙,凹凸不平,在内皮表面有大量橙红色的脂质附着;C组经过电针干预后,其颈总动脉内皮虽仍然较为粗糙,凹凸不平,内皮表面有橙红色的脂质附着,但脂质肉眼可见数量较B明显减少;D组在电针防治干预下,其颈总动脉内皮可见局部较为光滑,虽局部尚存在少量橙红色的脂质附着,但较B组明显减少,且优于C组。显微镜下颈总动脉HE染色切片结果显示,A组的颈总动脉组织的血管壁结构清晰,内膜完整,血管平滑肌细胞排列整齐;B组的颈总动脉组织处于早期动脉粥样硬化的脂纹期,其内膜受损,内膜下有大量泡沫细胞堆积,平滑肌层有一小脂质池形成,破坏内膜层、及血管壁结构;C组经电针干预后,其颈总动脉内膜下仍有少量泡沫细胞堆积,较B组已出现泡沫细胞明显减少的变化;D组在电针防治干预下,其颈总动脉内膜下仅见极少量泡沫细胞,其改善情况相对C组更优。论文三:16S rRNA高通量基因测序结果显示,与A组比较,B组Chaol指数与Shannon指数均呈显着下降（P<0.01）;与B组比较,在电针干预下C和D组Chaol指数呈明显升高（P<0.05）、Shannon指数呈显着升高（P<0.01）。就科水平而言,微生物群落的相对丰度存在组间差异;进一步在属水平进行的NMDS分析结果显示,相比B组,C组与D组中的各样本与A组在空间关系上更为接近。就属水平而言,相对丰度差异排名前20的菌属中,共有6种菌属表现出显着的组间差异。与A组比较,B组的Coprococcus（粪球菌属）、Turicibacter（苏黎世杆菌属）、Dorea（多尔氏菌属）、Roseburia（罗斯氏菌属）、Bifidobacterium（双歧杆菌属）均降低（P<0.05）,而 Phascolarctobacterium（考拉杆菌属）升高（P<0.05）;与B组比较,C组的粪球菌属、苏黎世杆菌属、罗斯氏菌属、双歧杆菌属升高（P<0.05）,而考拉杆菌属降低（P<0.05）;D组的粪球菌属、苏黎世杆菌属、多尔氏菌属、罗斯氏菌属、双歧杆菌属皆升高（P<0.05）,而考拉杆菌属降低（P<0.05）。肠道菌群因AS造模与电针干预的影响,可能涉及12个二级代谢功能的变化,包括外源性化学物质生物降解与代谢、核酸代谢、萜类和聚酮类化合物的代谢、其它氨基酸代谢、辅酶和维生素代谢、脂代谢、聚糖生物合成代谢、酶家族、酶代谢、糖代谢、氨基酸代谢以及其它次生代谢物的生物合成等。论文四:三维PCA分析结果显示,血浆代谢物存在组间差异。A组和B组的分离程度最为明显,而C组、D组与A组之间的三维空间距离更为接近。经过Agilent Mass Profiler Professional 12.6软件鉴定代谢物,共发现221种血浆差异代谢物变化存在统计学意义。其中与A组比较,B组血浆代谢物共有152种上调,69种下调;与B组比较,C组血浆代谢物共有86种上调,135种下调;而D组血浆代谢物共有112种上调,109种下调。与B组比较,C组或D组共有164种血浆差异代谢物与A组的变化趋势相同,其中C组129种,D组107种。初步对比NCBI、KEGG、HMBD、METLIN数据库,发现上述164种差异代谢物中至少有89种与AS的发生发展存在着可能的相关性。同时,宿主体内 Toluene degradation、Cholesterol metabolism、2-Oxocarboxylic acid metabolism、Aminobenzoate degradation、Arachidonic acid metabolism、Tryptophan metabolism、Bile secretion、Primary bile acid biosynthesis、Secondary bile acid biosynthesis、Metabolic pathways、Microbial metabolism in diverse environments、Biosynthesis of secondary metabolites、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、Pentose and glucuronate interconversions等代谢通路均出现变化,对比发现这些代谢通路均与AS发生发展有关。论文五:组学关联分析发现,肠道菌群的变化与宿主代谢物的变化有关。粪球菌属与5（6）-EpETrE-EA、Luteolin 7,3’-dimethyl ether 5-glucoside、Gabacaline、2-glyceryl-PGF2α、phorbol 12-tiglate 13-decanoate、lys lys Trp 成负相关（P<0.05）;与 LysoPE（0:0/16:0）、Xeniasterol-b、antiogenin、Arg Ile Pro、4-Methyl-3-oxoadipate-enol-lactone、capillarin成正相关（P<0.05）。Turicibacer属与PG（O-16:0/20:2（11Z,14Z））、Orthothymotinic Acid、Diisobutyl phthalate、13（S）-HODE、Ifosfamide mustard、Ornaline、5-Chloro-1-piperidin-4-yl-1,3-dihydrobenzimidazol-2-one;R29676、L-Djenkolic acid、2-（Fluoromethoxy）-1,1,3,3,3-pentafluoro-1-propene（Compound A）呈负相关（P<0.05）;与m-Trifluoromethylhippuric acid、6-Hydroxykynurenic acid、Chenodeoxycholic acid glycine conjugate、（-）-Salvisyriacolide、PS（O-18:0/22:4（7Z,10Z,13Z,16Z））、k-Strophanthin-beta、PS（O-18:0/20:3（8Z,11Z,14Z））、Rifacycin W、26:5（11Z,14Z,17Z,20Z,23Z）、2-（Fluoromethoxy）-1,1,3,3,3-pentafluoro-1-propene（Compound A）呈正相关（P<0.05）。罗斯氏菌属与 4-Sulfobenzyl alcohol、11（R）-HETE、Indoxylsulfuric acid、9,10-Epoxy-18-hydroxystearate、N-Hydroxy-L-phenylalanine、12-hydroxy-5,8,10-heptadecatrienoic acid 呈负相关（P<0.05）;与 Kentsin、Risperidone、His Asn Cys、3a,7b,12a-Trihydroxyoxocholanyl-Glycine、3-oxoglycyrrhetinic acid、Stigmaellin A、p-Hydrotiaprofenic acid、Gln Thr lle、（4S,5S）-4,5-Dihydroxy-2,6-dioxohexanoate、Patulin、Pantothenic Acid、2,4-Dinitrophenol、PI（19:1（9Z）/18:2（9Z,12Z））、Ursodeoxycholic acid 3-sulfate、26-hydroxycholesterol 3-sulfate、18-acetoxy-25-hydroxyvitamin D3、Norselic acid E、Hydrocortisone cypionate 呈正相关（P<0.05）。双歧杆菌属与 p-Cresol glucuronide、Tolrestat、PE（20:2（11Z,14Z）/0:0）、N-[（3a,5b,7b）-7-hydroxy-24-oxo-3-（sulfoxy）cholan-24-y]-Glycine、Miraxanthin-Ⅱ、Proscillaridin A、N-depyridomethyl-lndinavir 呈负相关（P<0.05）;与 PS（20:2（11Z,14Z）/0:0）呈正相关（P<0.05）。多 尔 氏 菌 属 与 OA-6129E、N-[（3a,5b,7b）-7-hydroxy-24-oxo-3-（sulfoxy）cholan-24-y]-Glycine、3-（3-Indolyl）-2-oxopropanoic acid呈 负 相 关（P<0.05）;与 Enalkiren、MEDICA 16、Formoterol、5,4’-Dihydroxy-7’-methoxy-8-methylflavan、Trinexapac-ethyl、3,5-Dinitroguaiacol 呈正相关（P<0.05）。电针治疗干预与电针防治干预对肠道菌群、宿主代谢的影响存在相同点与差异点。共同点:电针治疗干预和电针防治干预均可上调对AS病变的发生发展有保护作用的肠道菌群相对丰度,包括粪球菌属、Turicibacer属、罗斯氏菌属、双歧杆菌属;下调对AS病变有促进的肠道菌群相对丰度,包括Phascolarctobacterum属。继而通过肠道菌群影响宿主代谢物,上调对AS有抑制作用的代谢物,同时下调对AS有促进作用的代谢物:通过Turicibacer属上调与AS相关的宿主差异代谢物PG（O-16:0/20:2（11Z,14Z））、Chenodeoxycholic acid glycine conjugate、PS（O-18:0/22:4（7Z,10Z,13Z,16Z））、PS（O-18:0/20:3（8Z,11Z,14Z））,并下调与 AS 相关的宿主差异代谢物 Ifosfamide mustard、Ornaline、L-Djenkolic acid;通过双歧杆菌属下调与AS相关的宿主差异代谢物p-Cresol glucuronide、Tolrestat、Proscillaridin A 及 Miraxanthin-Ⅱ;通过考拉杆菌属下调与 AS相关的宿主差异代谢物 PA（P-16:0/15:1（9Z））和 3S-hydroxydodecanoic acid。差异点:电针治疗干预可能通过肠道菌群下调部分对AS有促进作用的宿主代谢物,上调对AS有治疗作用的宿主代谢物。通过粪球菌属下调5（6）-EpETrE-EA、Gabacaline、2-glyceryl-PGF2α、phorbol 12-tiglate 13-decanoate;通过罗斯氏菌属下调 11（R）-HETE、Indoxylsulfuric acid、N-Hydroxy-L-phenylalanine、12-hydroxy-5,8,10-heptadecatrienoic acid、2,4-Dinitrophenol。通过罗斯氏菌属上调LysoPE（0:0/16:0）、Xeniasterol-b、antiogenin及 4-Methyl-3-oxoadipate-enol-lactone。电针防治干预能够通过Coprococcus属下调phorbol 12-tiglate 13-decanoate,通过Rosebuira 属下调 4-Sulfobenzyl alcohol、11（R）-HETE、Indoxylsulfuric acid、9,10-Epoxy-18-hydroxy stearate、N-Hydroxy-L-phenylalanine、12-hydroxy-5,8,10-heptadecatrienoic acid;通过 Coprococcus 属上调 Luteolin 7,3’-dimethyl ether 5-glucoside、lys lys Trp、LysoPE（0:0/16:0）、Xeniasterol-b、antiogenin 及4-Methyl-3-oxoadipate-enol-lactone;通过罗斯氏菌属上调 Pantothenic Acid、PI（19:1（9Z）/18:2（9Z,12Z））、Ursodeoxycholic acid 3-sulfate、26-hydroxycholesterol 3-sulfate、18-acetoxy-25-hydroxyvitamin D3、Norselic acid E、Hydrocortisone cypionate;通过多尔氏菌属上调 Enalkiren、MEDICA 16、Formoterol。结论:1.电针防治结合干预能够有效改善动脉粥样硬化动物的血脂、血流动力学异常。2.电针防治结合干预能够有效抑制动脉内膜损伤、泡沫细胞及粥样斑块形成。3.电针防治结合干预能够改变动脉粥样硬化动物的肠道菌群结构（多样性及特异菌属相对丰度）。4.电针防治结合干预能够影响动脉粥样硬化动物宿主代谢物,且此类代谢物中有89种与动脉粥样硬化发生发展有密切关系。5电针防治结合作用可能是通过调节粪球菌属、苏黎世杆菌属、罗斯氏菌属、双歧杆菌属、考拉菌属及多尔氏菌属的相对丰度,上调对AS有治疗和预防作用的宿主代谢物,下调对AS有促进作用的宿主代谢物,进而改善宿主脂代谢、氨基酸代谢等途径以实现抗AS作用。

邢晓辉^[8]（2020）在《ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3调控动脉粥样硬化脑卒中神经损伤的作用研究》文中认为第一部分ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3参与脑卒中神经损伤调节的作用研究研究背景脑卒中（Cerebral stroke）目前占脑血管病发病率约35%,40%的存活者遗留严重残疾,病死率高达50%以上,是威胁中、老年人健康的主要疾病之一,是世界范围内引起人类残疾和死亡的主要原因之一,是一个重要的公共健康问题。近年来临床中多采用手术清除血肿、去骨瓣减压术、动脉内膜剥脱术、脱水降颅内压、神经营养及高压氧等综合治疗手段,虽然能挽救部分病人的生命,但脑卒中存活者仍有很高的致残率。脑卒中后血肿及脑组织水肿的机械压迫和破坏可对神经系统细胞产生直接杀伤作用,而脑卒中后周围脑组织继发缺血缺氧会进一步导致神经元细胞等的坏死和凋亡,造成严重的神经功能缺失。已经开始有大量的研究试图阐明脑卒中神经损伤的病理机制以及脑卒中的治疗靶点,同时试图发现更好更快可以直接避免缺血性卒中损伤的治疗措施。如何减少脑卒中后神经元细胞的坏死和凋亡,是改善这类患者预后的关键。脂肪间充质干细胞（Adipose Derived Stem Cells,ADSCs）是一种从成体脂肪间充质中获得的干细胞,因其无明显的免疫排斥反应、亦可自体移植,具有多向分化潜能等优点,近年来成为干细胞移植研究的热点。ADSCs移植治疗多种疾病所致的神经功能缺损已获得有价值的研究进展。本人所在课题组前期已成功构建了 SD大鼠脑卒中模型,同时分离出ADSCs进行体外培养扩增,并诱导成神经元样细胞,然后注射到大鼠损伤脑组织局部,观察到受损脑组织局部不成熟神经元细胞增多、神经突触再生明显、细胞有丝分裂活动增强,局部神经组织损失面积减少,可促进大鼠的神经功能恢复。在综合大量动物实验的基础上,课题组又开展了自体ADSCs局部注射治疗脑卒中临床试验研究。研究结果证实在脑卒中患者血肿腔周围损伤的脑组织局部注射ADSCs治疗,可在近期（6个月）内有效改善患者的神经功能缺失,且效果优于静脉注射和蛛网膜下腔注射。但同时我们也发现ADSCs治疗组患者在12个月之后的神经功能评分与对照组比较无明显统计学差异,表明ADSCs治疗脑卒中后神经损伤远期效果较差,仍不能令人满意。如何提高移植后ADSCs神经修复效果是研究者面临的课题之一。这就提示我们要对ADSCs治疗脑卒中的作用机制进行深入研究,找到关键作用分子并进行靶向调控,是提高ADSCs临床治疗效果的关键。间充质干细胞在过去被认为能分化成不同类型的细胞,但是现在更多的研究关注间充质干细胞和其他细胞的相互作用和对其他细胞的影响,特别是研究和其他细胞的信息交流。近来通过细胞外囊泡进行信息交流吸引了更多的研究兴趣。有许多不同类型的分泌细胞外囊泡,它们在大小、细胞来源、生物合成、内容物和释放的生理环境都有不同。外泌体（Exosomes）是一种由细胞内溶酶体微粒内陷形成、直径在40-100nm的多囊泡体。它含有蛋白质、mRNAs和miRNAs等遗传物质,作用于靶细胞并调控相关靶基因表达,具有实现细胞间物质交换及信息传递等功能,参与体内多种病理生理过程。外泌体能够通过多种途径进行分离,通过电子显微镜进行特征描述和标记蛋白进行鉴定。目前研究认为,ADSCs移植治疗神经损伤性疾病,神经功能的改善主要获益于细胞的旁分泌机制,而外泌体是干细胞旁分泌效应中发挥主要作用的因子。干细胞来源的外泌体可提供生长因子等细胞保护因子,能够起到抗凋亡、促进血管生成、增强神经细胞分化及修复受损组织等多种作用。外泌体在ADSCs神经修复中的作用已经成为其作用机制研究的热点。已有大量研究证实脂肪间充质来源的干细胞可分泌外泌体,并在干细胞的生理作用中起到重要作用。在脑卒中相关外泌体研究中,Xin等报道ADSCs可通过分泌外泌体miR-133b被神经元及星形胶质细胞摄取后促进轴突生长。且ADSCs移植联合miR-133b过表达治疗对神经轴突可塑性及神经突触重塑方面效果优于单纯ADSCs治疗。该团队还首次用ADSCs源外泌体替代ADSCs治疗脑卒中动物模型,同样可改善脑卒中预后。然而,外泌体的内容物在不同的病理情况下发挥的作用不同,这种不同也许会导致靶细胞完全相反的命运。因此,研究在特定病理情况例如缺氧和缺血情况下外泌体的生物学功能将会大有收获。此外,本研究将尝试为缺血缺氧神经损伤的治疗提供新的理论依据。在外泌体的内容物中,有研究显示miRNAs调控缺血性脑卒中病理生理学结局中的重要过程。它是一组小（大约22核苷酸）、单链非编码RNA,在基因表达中具有重要的作用。miRNAs既能促进亦能抑制神经胶质细胞及脑血管内皮血细胞的凋亡,也能够调节急性脑缺血介导的脑卒中。但是脂肪间充质干细胞外泌体来源的miRNA是否可以在脑缺氧、缺血情况下参与神经胶质细胞及脑血管内皮细胞的凋亡调节过程还不是很清楚。在此研究中,我们探讨了脂肪间充质干细胞来源的外泌体对缺血、缺氧模型中神经胶质细胞及脑血管内皮细胞的保护作用,认为其机制主要是通过外泌体miR-21及miR-342对该两种细胞中caspase-3蛋白的调节来完成的。同时通过我们大量的研究工作亦可以为缺血性脑卒中提供潜在的细胞治疗策略。研究目的1.检测miR-21、miR-342在干细胞外泌体及脑卒中体外模型中的表达水平。2.分析miR-21、miR-342表达水平与脑卒中细胞凋亡间的关系。3.评估干细胞外泌体通过干预miR-21、miR-342的表达对卒中损伤的调控作用。4.研究miR-21、miR-342参与脑卒中损伤的调控机制及调节靶点。研究方法1.培养人源脂肪间充质干细胞,采用超速离心法成功提取外泌体并利用电子显微镜进行鉴定。培养人源神经胶质T98细胞及血管内皮细胞HCMEC,配置适当浓度氯化钴溶液（COC12）成功建立T98及HCMEC缺血缺氧模型,RNA-Seq、MTT及qRT-PCR方法分别检测、筛选差异表达miRNAs,并从中选取特异性高的 miRNA（miR-21、miRNA-342）。2.电子显微镜下观察T98及HCMEC细胞凋亡情况,并采用LP3000瞬时转染方法转染miR-21及miR-342的mimic及inhibitor,观察细胞凋亡及改善情况与miRNA表达的关系。3.间充质干细胞利用qRT-PCR方法验证差异表达miRNAs,将外泌体与缺血缺氧细胞模型共培养,观察细胞凋亡及改善情况。干扰干细胞miR-21及miR-342表达量,再次分离得到外泌体并共培养,通过qRT-PCR方法、Western Blot及流式细胞学技术方法观察细胞凋亡及改善情况。4.通过荧光素酶检测方法检测miR-21及miR-342在脑卒中损伤模型中的作用靶点及蛋白caspase-3,结合生物信息技术验证miRNAs及其靶基因作用的细胞信号通路,同时观察脑卒中细胞凋亡情况与caspase-3表达的相关性,再次验证miR-21及miR-342在脑卒中损伤模型中的作用靶点,尝试为脑卒中损伤的调节提供潜在的细胞治疗策略。研究结果1.miR-21、miR-342在脑卒中神经胶质T98细胞及HCMEC细胞中表达水平分析结果表明利用氯化钴溶液可以成功建立缺氧缺血模型,miR-21、miR-342在脑卒中神经胶质T98细胞及HCMEC细胞中表达水平具有明显特异性。脑卒中细胞模型建立后,miR-21表达降低（mean±SD,2.53±1.94）,miR-342表达升高（mean±SD,2.57±1.95）,miR-21与细胞凋亡程度呈负相关,miR-342与细胞凋亡情况呈正相关。2.分析miR-21、miR-342表达水平与脑卒中细胞凋亡间的关系脑卒中细胞模型建立后,miR-21表达降低,miR-342表达升高（mean±SD,2.57±1.95）,miR-21与细胞凋亡程度呈负相关,miR-342与细胞凋亡情况呈正相关。3.评估干细胞外泌体通过干预miR-21、miR-342的表达对卒中损伤的调控作用。干细胞利用LP3000成功瞬时转染mi-R-21及miR-342的生物模拟物,并利用qRT-PCR检测到相应miRNA的表达改变。干细胞外泌体干扰miR-21及miR-342表达对脑卒中损伤发挥相应调控作用,干细胞外泌体miR-21过表达可以改善脑卒中损伤模型中细胞凋亡情况,miR-342过表达则起到促进细胞凋亡作用。4.研究miR-21、miR-342参与脑卒中损伤的调控机制及调节靶点。外泌体作为一个转运微粒,通过细胞间miRNA和蛋白的交换在细胞间的信息交流中发挥重要的作用,研究特定病理情况下分泌的具有潜在生物学功能外泌体中的miRNA等内容物是很有必要的。因此,我们选择了此前文献报道的12种miRNA,既包括缺血缺氧过程中的miR-24,miR-146,又包括少突胶质细胞凋亡过程中的miR-21,592,138,342等。在这些miRNA中,脂肪间充质干细胞来源的外泌体miR-21在经过缺氧处理后被显着下调,而miR-342显着上调。这提供了一个潜在的外泌体两种miRNA的共同靶点,其在缺氧处理后的T98及HCMEC细胞中也许会影响caspase-3的表达。我们检测了缺氧处理后的T98及HCMEC细胞中的miR-21及miR-342,结果显示miR-21被显着下调、miR-342显着上调,提示缺氧过程中miR-21、342的改变和caspase-3表达改变之间有可能存在联系。因此使用两种miRNA的抑制物进行过表达及低表达功能实验,结果显示miR-21的表达与caspase-3的表达水平呈负相关,miR-342与caspase的表达呈正相关。结论1.脑卒中损伤后神经胶质细胞及血管内皮细胞的凋亡进展与miR-21及miR-342的表达具有明显相关性。2.间充质干细胞来源的外泌体可通过miR-21及miR-342参与改变神经胶质细胞及血管内皮细胞的凋亡。3.间充质干细胞外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3参与脑卒中损伤调节。意义本课题明确了我们能得出一个结论,即脂肪间充质干细胞源外泌体miR-21及miR-342、caspase-3有希望成为脑卒中治疗的潜在靶点。第二部分ADSCs外泌体通过miR-342-5p调控血管内皮细胞抗动脉粥样硬化改善脑卒中的作用研究研究背景脑血管疾病、心血管疾病和癌肿是导致人类死亡最常见的3类疾病。脑血管病的年人发病率在每十万人有150～200人,其中缺血性脑血管病约75%85%、脑出血约10%15%以及自发性蛛网膜下腔出血约5%9%。脑梗死30天病死率约15%33%,生存者均有程度不同的病残。虽然发达国家已大力开展对脑血管危险因素的防治,曾使脑血管病的发病率和死亡率在20世纪70年代有所降低,但在80年代初又有所回升。近年来,虽然神经科学在诊断、治疗以及基础研究上有很大的发展,但是脑血管病的治疗依旧是我们要面临的重大挑战。缺血性脑卒中见于很多种神经外科疾病的病理及生理过程中,如脑血管病、颅内肿瘤、脑外伤、术中暂时性血管阻断等;亦可见于心脏骤停、休克等全身性的病理过程。脑缺血可表现为不同的形式,例如局灶性和弥漫性脑缺血、永久性及暂时性脑缺血之分。但不论以哪种方式出现,脑缺血后的病理生理机制和生化改变基本相似,且与脑缺血的程度和持续时间高度相关。基本病理过程包括:能量衰竭、细胞离子平衡失调、酸中毒、钙内流、兴奋毒性作用和氧自由基介导的毒性作用等。研究表明,当颈动脉管腔狭窄程度<70%时,脑血流保持不变。可是,当狭窄≥70%时,管腔的横切面减少90%,即引起显着脑血流减少。动脉管腔内血栓形成或者栓塞是错综复杂的过程,受很多种因素相互作用:血液成分改变、血管壁内膜损伤、局部脑血流的特征例如流速、漩涡等。因颈动脉粥样硬化引起管腔高度狭窄进而导致脑供血不足是促成缺血性脑卒中的主要病因,因此颈动脉内膜剥脱术不仅可以增加CBF,而且可以消除潜在的脑血栓和栓塞风险进而达到防治缺血性脑卒中的目的。颈动脉粥样硬化,通常是由颈动脉壁上充满脂质的巨噬细胞积聚引起的,是脑血管疾病的主要潜在贡献者,并在全球范围内具有高发病率和高死亡率。一系列高脂血症引发的慢性炎症过程:包括修饰后的脂蛋白、单核细胞和T淋巴细胞与来自血管壁的细胞成分之间复杂的相互作用,均促进了动脉粥样硬化病变的形成。迄今为止,许多诊断技术已被用来评估脑血管疾病的风险和寻找其治疗方法,这些诊断技术通常分为侵入性和非侵入性:前者以侵袭性血管造影和光学断层扫描为例,后者以血液生物标志物、压力测试、CT和核扫描为例。值得注意的是,经过大量关于动脉粥样硬化发生的细胞及分子生物学方面的研究增强了人们对动脉粥样硬化发生的潜在危险因素及其临床特征的认识。因此,继续研究动脉粥样硬化形成的潜在机制,可有助于更好地防治这一系列的慢性疾病。动脉粥样硬化的发病机制可分为启动期、进展期和并发症期三个阶段。内皮细胞的损伤或功能障碍被认为是动脉粥样硬化斑块形成的关键原因。血管内皮细胞对血流紊乱的适应及对动脉分支部位血流冲击的易感性成为动脉粥样硬化发生的决定性因素。因此,寻找有效的方法来保护内皮细胞可能是预防动脉粥样硬化进展的有效策略。MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA,被认为是特异性信使RNA（mRNA）的重要转录后调节因子。近年来,大量文献研究发现,几种与促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化相关的miRNA表达失调是动脉粥样硬化发生发展的关键因子。据报道,许多miRNAs在脂质代谢、炎症和动脉粥样硬化形成中发挥重要的调控作用:miR-19b和miR-144-3p参与脂质代谢调控,miR-92a和miR-155作为炎症的关键调控因子,miR-30c和miR-126-5p预防动脉粥样硬化。因此,靶向miRNAs可能会缓解动脉粥样硬化的发展。尽管已经报道了大量与动脉粥样硬化相关的miRNA,但在寻找新的或有价值的miRNA和探索其在动脉粥样硬化中的潜在生物学功能方面仍有许多工作要做。本研究旨在筛选动脉粥样硬化相关的miRNA,并初步探讨其可能的调控机制。首先,通过RNA测序对比分析动脉粥样硬化患者和相应健康对照组中差异表达的miRNA和mRNA。建立血管内皮细胞损伤模型。其次,我们的目标miRNA:miR-342-5p是在生物信息学分析和实验验证的基础上鉴定出来的。我们还评估了miR-342-5p对血管内皮细胞损伤模型凋亡的影响。通过一系列的生物信息学分析和实验证实,miR-342-5p被识别为动脉粥样硬化相关靶点。最后,我们对脂肪间充质干细胞（ADSCs）来源的外泌体进行了分离及鉴定,并研究了它们对血管内皮细胞损伤模型中mi R-342-5p表达的影响。总之,这项工作发现并鉴定了一个与动脉粥样硬化相关的miRNA（miR-342-5p）,并发现了这个miRNA在动脉粥样硬化中发挥作用的潜在机制。研究目的1.检测人颈动脉粥样硬化标本与正常人颈动脉相比,miRNA、mRNA等的表达情况。2.建立体外内皮细胞损伤模型,采用WB、Hoechst和FCM等技术检测凋亡相关基因和功能,其中还检测了 miR-342-5p对内皮细胞损伤模型的作用。3.寻找并验证miR-342下游目标靶基因,研究抑制和过表达miR-342后对下游目标靶基因和蛋白表达水平的影响。4.分别干扰和过表达miR-342下游靶基因,研究其对血管内皮细胞抗动脉粥样硬化作用的影响。5.研究干细胞来源外泌体对miR-342-5p表达的影响。研究方法1.检测人颈动脉粥样硬化标本与正常颈动脉相比,miRNA、mRNA等的表达情况。利用RNA测序数据,通过一系列合适的分析工具来观察动脉粥样硬化样本中差异表达的miRNA和mRNA。利用火山图的方法对miRNAs和mRNAs在动脉粥样硬化组与正常组之间的不同进行差异化表达分析,其标准为|log2FC|>1 and P<0.05,Sanger Box将其结果进行可视化。基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。在文氏图中,在miR-342-5p的重叠靶点中发现了 Hub基因。2.建立体外内皮细胞损伤模型,检测凋亡相关基因和功能,检测miR-342-5p对内皮细胞损伤模型的作用。MTT方法筛选适当浓度H202建立体外内皮细胞损伤模型,采用Hoechst染色试剂盒法及流式细胞术分析检测血管内皮细胞凋亡率,RNA分离和实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测并再次验证差异表达miRNA。3.研究干细胞来源外泌体对miR-342-5p表达的影响。ADSCs外泌体的分离和鉴定,提取干细胞外泌体与内皮细胞损伤模型共培养,利用RT-PCR和Western blot方法分别检测外泌体对miR-342表达的影响,免疫印迹分析（Western-blot）等技术对靶基因转录及蛋白表达水平的影响。分别干扰和过表达miR-342及靶基因。运用RT-PCR和Western blot验证干扰效率及过表达效率,检测血管内皮细胞凋亡情况的改善。研究结果1.通过RNA测序分析差异表达的miRNA和mRNA分别对3例动脉粥样硬化患者的粥样硬化斑块和2例意外车祸患者的颈动脉正常样本进行RNA测序。RNA-seq技术检测筛选差异表达miRNAs,火山图筛选条件为:|log2FC|>1,p<0.05;动脉粥样硬化标本中共有141个miRNA差异表达,其中上调68个,下调73个。血管内皮细胞在H202 0、1000、1500和2000 um时的凋亡率分别为2.6%、11.1%、20.5%和41.1%。western blot分析发现,随着 H202 浓度的升高,cleaved-PARP/PARP、cleaved-caspase3/caspase3、cytochrome C、p53 的表达水平明显升高（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。同时,随着H202浓度的升高,Bcl-2与BAX的比值呈下降趋势（P<0.05,P<0.01）。以上结果共同支持了血管内皮细胞病变模型的成功构建。2.目的miRNA miR-342-5p被识别并促进H2O2损伤的血管内皮细胞的凋亡根据log2FC值排序,筛选出前30位上调的miRNA,其表达谱热图如图3A所示。随后,10 个 miRNAs（即 miR-147b-3p、miR-378d、miR-10399-3p、miR-146a-5p、miR-146b-5p、miR-2277-5p、miR-342-5p、miR-181a-3p、miR-378a-3p 和miR-142-3p）被认为是候选,它们在RNA测序中排名第一,或据报道与动脉粥样硬化相关。在血管内皮细胞损伤模型中,10个miRNAs中,has-RNA-342-5p的相对表达量最高。随着H2O2（1000、1500或2000 uM）浓度的逐渐升高,检测到miR-342-5p的表达。显然,随着H202浓度的增加,这一 miRNA表达逐渐增强。将血管内皮细胞分别转染miR-342-5p mimic、inhibitor及其相应的NC,然后用1500um H202处理,结果表明miR-342-5p可以促进血管内皮细胞的凋亡。3.在H20损伤的血管内皮细胞中,PPP1R12B被鉴定为miR-342-5p的靶点通过聚类分析可以将表达模式相似的基因聚在一起,说明它们可能具有共同的功能或参与共同的代谢和信号通路。利用RNA测序得到的差异表达mRNA进行聚类分析在RNA测序中,有2694个mRNA下调,这240个基因分别来自三个数据库。因此获得了 25个基因,它们不仅是miR-342-5p的靶点,而且在动脉粥样硬化中也被下调。接下来,这25个基因被用于GO和KEGG富集分析。这25个重叠基因的相互作用首先通过STRING分析,然后导入到Cytoscape中。KEGG分析表明,在这些hub基因中,得分最高的PPP1R12B同时与血管平滑肌收缩和催产素信号通路相关。miR-342-5p可以抑制血管内皮细胞损伤模型中PPP1R12B的表达。上述证据表明,在H202受损的血管内皮细胞中,PPP1R12B是miR-342-5p的靶标。4.ADSCs源外泌体可抑制H2O2损伤血管内皮细胞中miR-342-5p的表达。将ADSCs分离培养,从ADSCs培养上清液中纯化的外泌体进行TEM表征。结果如图5B所示,外泌体为直径30～150nm的圆形膜囊。western blot检测作为外泌体常用标记蛋白的CD9、CD63和TSG101的表达水平。将外泌体加入浓度为1500um的H2O2损伤的血管内皮细胞中。随后用q RT-PCR检测miR-342-5p的表达。结果表明,在H2O2受损的血管内皮细胞中,ADSCs源外泌体抑制了 miR-342-5p的表达。结论1.间充质干细胞来源外泌体能够抑制miR-342-5p的表达,保护内皮细胞抗动脉粥样硬化,其主要抑制氧化应激诱导的线粒体凋亡信号通路来实现。2.在H2O2受损的血管内皮细胞中,PPP1R12B是miR-342-5p的靶标。3.由ADSCs源外泌体介导的miR-342-5p具有参与调控血管内皮细胞抵抗动脉粥样硬化的作用。意义我们的研究可能为动脉粥样硬化的发病机制提供更好的理解,并为动脉粥样硬化的潜在治疗靶点提供有价值的见解。

徐磊^[9]（2020）在《白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究》文中认为缺血性脑血管病主要病理基础为动脉粥样硬化,在动脉粥样硬化形成过程中,炎性反应贯穿动脉粥样硬化发生发展的全过程,Smads信号通路可以抑制脂代谢、抑制炎症反应和氧化应激发挥抗动脉粥样硬化作用,白藜芦醇主要通过抗炎、抑制低密度脂蛋白氧化修饰、抑制泡沫细胞生成、抑制斑块内新生血管、抗氧化等发挥抗动脉粥样硬化的作用。然而白藜芦醇、Smads信号通路、脂代谢、炎性反应和动脉粥样硬化之间具有何种关系,目前仍不确切。本研究为明确白藜芦醇的抗动脉粥样硬化作用及其是否通过Smads信号通路的抗炎、抗动脉粥样硬化作用机制,在成功复制兔动脉粥样硬化模型基础上,采用不同影像技术对颈动脉粥样硬化的影像学特点进行比较分析,同时观察白藜芦醇对影像学变化的影响,采用免疫组化和Western-blot技术对兔颈动脉粥样硬化Smads信号通路以及巨噬细胞标志物RAM11、平滑肌标志物Actin、血管内皮细胞标志物CD31的表达进行研究,对兔主动脉弓动脉粥样硬化和血脂、Lp-PLA2水平对比分析。本文研究包括以下内容:1.兔颈动脉和主动脉弓动脉粥样硬化模型建立与评价目的:建立兔颈动脉以及主动脉弓动脉粥样硬化模型。方法:健康普通级新西兰兔8只,雄性,体重2.7-3.3kg,兔龄3个月,颈动脉粥样硬化组4只,主动脉弓动脉粥样硬化组4只;颈动脉粥样硬化组中对照组2只,进食普通饲料,高脂饮食联合兔部分颈动脉结扎手术2只。结扎后,饲养3个月后进行颈部血管超声检查,并且进行解剖颈手术操作如下:耳缘静脉留置套管针,耳缘静脉缓慢推注5%苯巴比妥钠注射液100 mg/kg,进行麻醉,手术在无菌条件下进行,颈正中切口,显露并分离左侧颈动脉,在LJZ-4D手术显微镜下用缝针穿过颈动脉血管中间位置,10-0丝线结扎部分动脉阻断部分血管,造成约50%狭窄,逐层缝合创口。颈动脉动脉,进行HE染色;主动脉弓动脉粥样硬化组4只,正常饮食组2只,高脂饮食组2只。饲养3个月。随后进行麻醉,解剖主动脉弓,进行HE染色。结果:超声检查发现对照组显示兔颈动脉光滑,未见斑块,实验组,兔颈动脉可见血管腔存在部分狭窄,狭窄处可见斑块形成;局部大体解剖见对照组颈部血管表面光滑、平整,无斑块形成,实验组可见结扎线处形成局部斑块。HE染色发现对照组管壁光滑,内膜无增生,平滑肌层形态正常,未见斑块形成,实验组见颈动脉内膜增厚,平滑肌层形态不规则,管腔变窄,斑块形成明显。NDG内膜光滑,FDG见内膜增厚,内膜下巨噬细胞浸润。结论:经超声和病理学证实,成功制备兔颈动脉和主动脉弓动脉粥样硬化模型。2.利用不同影像技术观察白藜芦醇对兔动脉粥样硬化影响的研究目的:观察不同影像技术兔颈动脉粥样硬化改变及白藜芦醇对其的影响。方法:将30只健康普通级新西兰兔,随机分配为对照组、高脂饮食+SPL组、高脂饮食+白藜芦醇+SPL组。手术操作同前。喂养3个月后,进行超声（GE,美国）检测颈动脉血流速度、狭窄程度、斑块质地;HRMRI（西门子,Skyra 3.0T,德国）检测斑块质地、狭窄程度;PET/CT（联影u MI510）检测斑块核素摄取量。结果:超声结果显示对照组管腔光滑,未见斑块形成;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组比较,颈动脉血流速度、狭窄程度减低（P>0.05）;斑块厚度、软斑块及混合斑块比例均较低（P<0.05）,斑块质地更趋于稳定斑块。HRMRI显示对照组颈总动脉形态正常,管腔内未见斑块;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组对比高脂饮食+SPL组颈动脉狭窄减轻,血管内斑块减小,导致狭窄程度减低。PET-CT显示与高脂饮食+SPL组比较,高脂饮食+白藜芦醇+SPL组斑块（狭窄）部位核素核素摄取（SUV）减少（P<0.05）。结论:超声、HRMRI、PET/CT影像学检查评估兔颈动脉粥样硬化模型存在不同的优势,验证兔颈动脉粥样硬化斑块存在的同时,提示可发现易损斑块存在,白藜芦醇具有抗动脉粥样硬化作用,具有降低斑块内代谢、促进斑块稳定的作用。3.白藜芦醇介导Smads信号通路抗动脉粥样硬作用的研究目的:探讨白藜芦醇对兔颈动脉粥样硬化Smads信号通路的影响及其通过抗炎等实现抗动脉硬化作用。方法:对照组、高脂饮食+SPL组、高脂饮食+白藜芦醇+SPL组,影像学检查后解剖取材颈动脉,采用HE染色进行病理学检查,采用Western-blot、免疫组化技术观察Smad2、Smad3、Smad7表达,采用免疫组化技术观察RAM11、Actin、CD31表达,定量分析Western-blot结果,应用IPP软件对免疫组化结果测量Area、IOD值,用SPSS19.0软件数据统计,进行t检验。结果:HE染色显示对照组管壁光滑,未见斑块形成,白藜芦醇+高脂饮食+SPL组对比高脂饮食+SPL组斑块厚度减低（P<0.05）。免疫组化和Western-blot技术发现高脂饮食+SPL组与对照组对比Smad2、Smad3表达增高,Smad7表现增高;高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组对比Smad2、Smad3表达减低,Smad7表达增高结果一致。高脂饮食+白藜芦醇+SPL组对比高脂饮食+SPL组CD31、RAM11、Actin定量分析明显减低（P<0.05）,并且高脂饮食+白藜芦醇+SPL组与高脂饮食+SPL组CD31、RAM11、Actin定量分析都高于对照组（P<0.05）。结论:高脂饮食可激活Smads信号通路,白藜芦醇可能通过抑制Smad2、Smad3表达,提高Smad7表达,抑制巨噬细胞浸润、平滑肌增生、新生血管生成实现抗动脉粥样硬化作用。4.白藜芦醇对动脉粥样硬化兔血脂、Lp-PLA2影响的研究目的:探讨白藜芦醇对兔动脉粥样硬化模型血脂、Lp-PLA2的影响。方法:将普通级新西兰兔随机分为NDG、FDG、RFG三组。实验前进行心脏采血,进食3个月后,再次进行心脏采血,采用化学发光法检测血脂、采用干式荧光免疫分析检测Lp-PLA2水平,采血后麻醉进行主动脉弓取材,行HE染色观察病理变化,观察主动脉弓内膜厚度、平滑肌层厚度、内膜/平滑肌层比值,数据统计分析均采用SPSS19.0软件,进行t检验。结果:实验后三组TC、HDL-C、LDL-C、Lp-PLA2具有统计学差异（P<0.05）,并且RFG比FDG组TC、LDL-C、Lp-PLA2数值减低,具有统计学差异（P<0.05）。结论:白藜芦醇通过调节血脂、抑制Lp-PLA2实现抗动脉粥样硬化。

汪岩^[10]（2020）在《大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究》文中认为研究目的:本研究旨在从亚细胞结构层面探讨城市大气颗粒物对血管内皮造成的损伤及毒作用机制。以多重经典细胞器（内质网、线粒体和溶酶体）为切入点,结合细胞程序性死亡方式（细胞凋亡与细胞自噬）讨论大气颗粒物诱导血管内皮细胞毒性的潜在机制,以及体内血管组织损伤的相关作用模式。研究方法:（1）以美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology,NIST）出品的城市大气颗粒物标准物质（编号1648a,PM SRM1648a）为研究对象,初步对颗粒物的成分、水合粒径和表面电位进行分析,并进行颗粒物内毒素含量的检测。选用人脐静脉血管内皮细胞系EA.hy926和HUVECs为体外实验模型,运用共聚焦显微镜观察法以及流式细胞仪侧向光检测值衡量血管内皮细胞对城市大气颗粒物PM SRM1648a的摄取情况。在细胞毒性层面,运用MTT和CCK8法检测细胞存活率并作为体外实验剂量筛选的依据;结合GSH/GSSG、MDA、NADP+/NADPH 和 C11-BODIPY581/591 等指标评估血管内皮细胞在大气颗粒物PM SRM1648a刺激下的氧化应激状态。在亚细胞结构层面,运用免疫荧光法检测γ-H2AX荧光灶点数以衡量DNA损伤;利用透射电子显微镜（透射电镜,Transmission Electron Microscope,TEM）观察血管内皮细胞对颗粒物的摄取以及细胞内超微结构的变化;（2）以内质网（Endoplasmic reticulum,ER）为核心,讨论大气颗粒物PM SRM1648a 触发血管内皮细胞内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）在自噬小体累积和细胞凋亡中的作用:TEM观察结果提示内质网结构出现撕裂扩张样改变,进一步运用ER-Tracker Blue-White DPX探针标记内质网,观察内质网荧光着色变化;运用DCFH-DA探针检测活性氧（Reactive oxygen species,ROS）;FITC-Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率;通过透射电镜法结合免疫荧光法观察自噬小体数量和LC3B的表达情况;运用western blot蛋白免疫印迹实验讨论颗粒物引起的内质网应激相关标志性蛋白GRP78/BIP、CHOP和caspase12,自噬标志性蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62,以及凋亡相关蛋白caspase9、caspase3、BCL-2和BAX的表达变化。进一步运用氧化应激抑制剂谷胱甘肽乙酯（Glutathione monoethy1 ester,GSH-MEE）和内质网应激广谱抑制剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid,4-PBA）探讨 ROS/ER stress 信号轴在颗粒物诱导血管内皮细胞自噬和凋亡中的作用;此外,运用自噬不同阶段调节剂3-Methyladenine（3-MA）、Rapamycin 和 Bafilomycin A1,探讨颗粒物暴露下,细胞自噬和内质网应激的相互关系,以及细胞自噬在细胞凋亡中发挥的作用;（3）以溶酶体损伤为核心,探讨颗粒物引起血管内皮细胞自噬小体累积与细胞毒性的具体原因:聚焦自噬动态过程,运用mRFP-GFP-LC3腺病毒载体检测颗粒物暴露下,EA.hy926和HUVECs血管内皮细胞中自噬流的通畅性;并在饱和浓度Bafilomycin A1的剂量下讨论颗粒物引起血管内皮细胞自噬小体累积的具体原因;LysoSensorTM Green DND-189探针法标记溶酶体并运用荧光半定量法检测溶酶体相对酸碱度pH;免疫荧光双标法（LAMP-2与LC3B）衡量溶酶体与自噬小体的共定位（即自噬溶酶体）;结合酶活性实验和蛋白表达量实验确定酸性磷酸酶（Acid phosphatase,ACP）以及溶酶体水解酶（Cathepsin B,CTSB）的活性和表达改变;（4）以线粒体动力学为核心,讨论颗粒物暴露扰乱血管内皮细胞线粒体分裂-融合平衡,进而引起炎症反应:检测线粒体功能学指标ATP、mtROS、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）等;运用 MitoTracker（?）Red CMXRos线粒体红色荧光探针观察线粒体形态学改变;qRT-PCR和western blot法分别检测线粒体动力学相关分子的表达情况;ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子的含量,如TNF-α、IL-1β等;Hoechst33258/PI双染法结合细胞上清液乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）的含量检测,初步判断细胞膜的损伤情况;运用流式细胞仪通过FLICA Caspase-1 Reagent FAM-YVAD-FMK/PI双染法检测细胞焦亡率和caspase1活性;运用caspase1特异性抑制剂Z-YVAD-FMK评估caspase1在颗粒物诱导血管内皮细胞炎症级联反应中的作用;以及运用si RNA慢病毒转染敲降技术敲低EA.hy926细胞中线粒体分裂调控基因DNM1L（DRP1）,在蛋白水平验证DRP1的表达量,重复上述相关实验指标评判线粒体分裂、caspase1酶活性、细胞炎症反应等,反向讨论颗粒物暴露经DRP1/caspase1/IL-1β信号通路扰乱血管内皮细胞线粒体分裂-融合平衡,进而触发炎症反应;（5）运用BALB/c小鼠模型,结合WHO建议的发展中国家第一阶段PM2.5过渡值（年均PM2.5浓度35μg/m3）、现实人群暴露情况、小鼠生理解剖结构以及外推系数等,设置低中高暴露剂量组,分别为1.28、5.5和11 mg/kg·bw/w。经过急性（7天）和亚急性（28天）暴露后,取肺泡灌洗液、血液标本以及肺、主动脉和心脏组织进行后续实验;Hematoxylin and eosin stain（H&E）、von kossa和Masson染色观察各组织样本的病理改变、钙离子沉积以及胶原蛋白沉积等;运用ELISA法检测肺泡灌洗液和血液样本中炎性因子以及氧化应激相关指标;BCA法检测肺泡灌洗液中总蛋白含量;流式抗体染色结合流式细胞仪侧向散射光数值检测肺泡灌洗液中总细胞数、单核细胞数、淋巴细胞数以及中性粒细胞数,进一步运用F4-80/CD11b/CD86/CD206流式抗体检测M1和M2型巨噬细胞比例;qRT-PCR法检测主动脉组织中炎性因子和氧化应激相关标志物基因层面的表达量;qRT-PCR法检测主动脉组织中亚细胞结构功能相关指标的表达改变,如内质网应激相关分子hspa5和ddit3,线粒体动力学相关分子dnm1l、fis1、mff、mfn1、mfn2和oopa1,以及溶酶体膜蛋白相关分子lamp1和lamp2;免疫组化、免疫荧光和western blot法检测主动脉组织中亚细胞结构功能相关指标蛋白水平的表达情况,如BIP、CHOP、DRP1、LAMP1和LAMP2;TUNEL法检测主动脉组织细胞凋亡率。综上方法,试图从体内水平初步揭示大气颗粒物引起细胞器功能紊乱参与血管组织损伤。研究结果:（1）体外细胞实验结果显示,大气颗粒物PM SRM1648a暴露下,血管内皮细胞比肺泡上皮细胞更为敏感。暴露于颗粒物24小时后,PM SRM1648a在相对低剂量下（10和20 μg/cm2;相当于32和64 μg/mL）,分别引起EA.hy926（P<0.05）和HUVECs（P<0.05）血管内皮细胞毒性,而未引起肺泡上皮细胞生存率降低。血管内皮细胞具有颗粒物摄取能力,并且颗粒物摄取先于细胞毒性的出现。同为人血管静脉内皮细胞株,PM SRM1648a对EA.hy926比HUVECs的细胞毒性更为显着,可能是因为EA.hy926细胞比HUVECs具有更强的颗粒物摄取能力。除了细胞毒性层面,PM SRM1648a可诱导DNA损伤,以及多重细胞器结构改变等;（2）PM SRM1648a引起血管内皮细胞胞内ROS过量释放和氧化应激,进一步损伤亚细胞结构功能,如内质网应激和结构损伤,从而影响血管内皮细胞自噬小体累积与凋亡。正常的自噬诱导可以保护PM SRM1648a引起的血管内皮细胞凋亡,抑制自噬或者破坏自噬降解过程会加剧颗粒物引起的内皮细胞损伤。内质网应激和自噬之间的相互对话表明内质网应激与LC3Ⅱ表达上调有关,而自噬过程对PM SRM1648a引起的内质网损伤并无显着影响。一定程度上探讨了内质网应激下,自噬诱导是颗粒物导致血管内皮细胞损伤的保护性因素;ROS/内质网应激通路和自噬降解功能障碍促进PM SRM1648a引起的血管内皮细胞凋亡;（3）20 μg/cm2（64 μg/mL）PM SRM1648a 导致 EA.hy926 血管内皮细胞内自噬小体累积、LC3Ⅱ高表达。在不同时间点LC3Ⅱ上调的具体原因不尽相同。短时间6小时内,自噬活性有所提高导致LC3Ⅱ的快速转化,参与自噬小体膜的合成;而随着暴露时间延长至24小时,LC3Ⅱ的增高归结于溶酶体降解清除能力受阻引起的缺陷型自噬。类似地,20μg/cm2（64μg/mL）剂量下,颗粒物暴露24小时后造成HUVECs内自噬小体累积,其原因归结于溶酶体损伤引起的缺陷型自噬。同时,20 μg/cm2 PM SRM1648a在暴露于EA.hy926细胞24小时后,ACP和CTSB溶酶体水解酶活性出现显着性降低（P<0.05,P<0.05）;在HUVECs中,ACP和CTSB活性检测同样显示类似的结果,于20μg/cm2剂量下暴露24小时后开始显着性降低。颗粒物引起的溶酶体损伤以及水解酶活性降低是引起自噬流阻断和降解清除能力削弱的关键因素。而氧化应激的恢复并不能缓解自噬流障碍和自噬溶酶体的减少,但可以缓解LC3Ⅱ的表达以及溶酶体膜蛋白LAMP-2的表达。PM SRM1648a经非氧化应激依赖型途径引起溶酶体水解酶失活,进而导致血管内皮细胞自噬流紊乱及后续降解异常,促进血管内皮细胞损伤甚至死亡;（4）线粒体是PM SRM1648a攻击人类血管内皮细胞的亚细胞结构靶标。大气颗粒物的摄入会破坏线粒体功能,包括mtROS增高、MMP减少和ATP消耗。同时,PGC-1α的降低表明PM SRM1648a损害线粒体生物发生。此外,20μg/cm2（64μg/mL）剂量暴露24小时后,PM SRM1648a导致线粒体形态呈现分裂样改变,分裂相关分子DRP1等异常上调;PM SRM1648a激活caspase1酶活性和炎症级联反应,caspase1抑制剂Z-YVAD-FMK可以显着降低颗粒物引起的caspase1激活及IL-1β炎性因子的释放;汇集DRP1介导的线粒体分裂通路以及caspase1介导的炎性通路发现,在PM SRM1648a的刺激下,si DNM1L（DRP1）慢病毒转染的EA.hy926细胞相对于空载病毒转染组细胞,线粒体形态有所恢复,caspase1酶活性（P<0.05）以及IL-1β含量（P<0.05）出现显着性降低,提示DRP1/caspase1/IL-1β信号轴参与颗粒物引起的血管内皮细胞线粒体分裂和炎性损伤。同等剂量20 μg/cm2暴露24小时后,EA.hy926细胞中凋亡率为23.43 ±1.76%（P<0.001）,焦亡率为 0.38±0.08%（P>0.05）;HUVECs 中凋亡率为17.30±1.61%（P<0.01）,焦亡率为0.41±0.07%（P>0.05）,同时结合细胞形态学、超微电镜结构以及流式细胞仪衡量细胞大小的前向散射光Forward Scatter,FSC值分析,细胞焦亡不是PM SRM1648a引起血管内皮细胞程序性死亡的主要作用模式;（5）急性（7天）和亚急性（28天）口咽吸入法暴露于不同浓度的PM SRM1648a（1.28、5.5 和 11 mg/kg·bw/w）,正常饲养环境的 BALB/c 雄性和雌性小鼠中出现局部和全身的氧化应激以及炎性反应,未见明显的主动脉脂质累积或斑块样沉积。亚急性组出现主动脉壁增宽以及主动脉根部胶原蛋白出现增多趋势。虽然未见显着性病理学损伤,亚急性暴露后,亚细胞结构层面分子表达出现改变,以内质网和线粒体相关分子改变为主,并且主动脉组织细胞凋亡率增高,以上结果均发生于雄性和雌性BALB/c小鼠中,无性别特异性。结论:亚细胞结构,如内质网、线粒体和溶酶体是PM SRM1648a损伤血管内皮细胞的重要靶点。颗粒物的暴露可以通过损害亚细胞结构功能进而导致血管内皮细胞炎症反应和细胞死亡。在探讨了内质网、溶酶体和线粒体结构功能紊乱后,亚细胞层面靶向毒性评估有助于更全面地了解大气颗粒物引起的血管内皮毒性。在进行环境颗粒物人群健康效应研究时,应综合考虑细胞毒性和亚细胞毒性,关注于早期的检查点,为全面掌握安全性评价信息及更好地实施危险度管理提供合理的基础资料。

二、血管内皮损伤与动脉粥样硬化关系探讨（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、血管内皮损伤与动脉粥样硬化关系探讨（论文提纲范文）

（1）西洋参丹参配伍调控PI3K/Akt/NF-κB通路稳定动脉粥样硬化易损斑块的作用机制研究（论文提纲范文）

（2）基于差异表达的LncRNA TUG1研究小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的作用机制（论文提纲范文）

（3）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（4）茶黄素减轻高脂诱导血管内皮损伤及动脉粥样硬化发展的作用及机制研究（论文提纲范文）

（5）二陈汤合桃红四物汤调控p53/SLC7A11介导的氧化损伤及铁死亡抗AS的机制研究（论文提纲范文）

（6）泽泻醇B乙酸酯通过调节肠道菌群和肠道雌激素受体抗绝经后动脉粥样硬化的机制研究（论文提纲范文）

（7）基于肠道菌群相关宿主代谢产物探讨电针防治动脉粥样硬化作用的实验研究（论文提纲范文）

（8）ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3调控动脉粥样硬化脑卒中神经损伤的作用研究（论文提纲范文）

（9）白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究（论文提纲范文）

（10）大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究（论文提纲范文）

四、血管内皮损伤与动脉粥样硬化关系探讨（论文参考文献）

• [1]西洋参丹参配伍调控PI3K/Akt/NF-κB通路稳定动脉粥样硬化易损斑块的作用机制研究[D]. 林泉. 中国中医科学院, 2021(02)
• [2]基于差异表达的LncRNA TUG1研究小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的作用机制[D]. 周芳. 湖北中医药大学, 2021(01)
• [3]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
• [4]茶黄素减轻高脂诱导血管内皮损伤及动脉粥样硬化发展的作用及机制研究[D]. 曾洁. 西南大学, 2021(01)
• [5]二陈汤合桃红四物汤调控p53/SLC7A11介导的氧化损伤及铁死亡抗AS的机制研究[D]. 何信用. 辽宁中医药大学, 2021(02)
• [6]泽泻醇B乙酸酯通过调节肠道菌群和肠道雌激素受体抗绝经后动脉粥样硬化的机制研究[D]. 孟庆海. 南京中医药大学, 2021(01)
• [7]基于肠道菌群相关宿主代谢产物探讨电针防治动脉粥样硬化作用的实验研究[D]. 沈宇平. 辽宁中医药大学, 2021(02)
• [8]ADSCs外泌体miR-21、miR-342通过caspase-3调控动脉粥样硬化脑卒中神经损伤的作用研究[D]. 邢晓辉. 山东大学, 2020
• [9]白藜芦醇抗动脉粥样硬化作用及其对Smads信号通路影响的研究[D]. 徐磊. 吉林大学, 2020(03)
• [10]大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究[D]. 汪岩. 东南大学, 2020

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