一、IL-2基因转导CD_3AK细胞免疫学功能的研究（论文文献综述）
王洪星[1]（2020）在《矢车菊素-3-0-葡萄糖苷对类风湿性关节炎治疗作用的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种常见自身免疫性疾病,其病理特征主要表现为关节滑膜炎症、炎性细胞浸润、滑膜成纤维状细胞（RA synovial fibroblast-like cell,RASF）异常增殖、血管翳形成以及关节软骨和骨组织损伤等。由于目前对RA病理机制尚不完全清楚,所以治疗该病的药物有限,主要是通过非甾体抗炎药物如阿司匹林和吲哚美辛、抗风湿药物（Disease-Modifying Anti-rheumatic Drug,DMARD）如甲氨蝶吟（methotrexate,MTX）和生物制剂如英夫利昔单抗（infliximab）和利妥昔单抗（rituximab）来抑制该病炎症和自我免疫。最新研究表明,RA治疗的锚定药物甲氨蝶呤可通过恢复调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）细胞的数目和功能来达到缓解RA的目的。虽然关于类风湿性关节炎患者外周血中调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）表型和绝对数量的数据存在争议,但更多的报道提示Treg的缺陷与RA中免疫细胞的失衡与异常激活激活有关。因此,筛选具有升高Treg细胞比例和功能的药物,可能是开发治疗RA新药的关键。CD38作为一种环腺苷二磷酸核糖水解酶（Cyclic ADP Ribose Hydrolase,cADPRH）可以代谢胞外烟酰胺二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,辅酶I,NAD+）,产生腺苷二磷酸核糖（ADPR）和环状腺苷二磷酸核糖（Cyclic ADP Ribose,cADPR）。cADPR和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAADP）是两种结构不同的信使,它们分别动员胞内质和溶酶体内钙离子（Ca2+）储存。因此,CD38通过控制细胞外核苷酸稳态和细胞内钙流量参与多种生理、病理活动,如感染、肿瘤、免疫和衰老等。我们前期通过寡核苷酸芯片（oligonucleotide microarrays,Illumina Human HT-12 v4表达组芯片）,实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR）和免疫组化方法（Immunohistochemistry）发现与骨关节炎（osteoarthritis,OA）（n=40）和强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）（n=27）滑膜相比,CD38在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）（n=42）滑膜组织中特异性高表达。有人利用CD38敲除小鼠制备牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎（Collagen-Induced Arthritic,CIA）模型,发现CD38敲除后可以明显缓解CIA的发生和发展。这些结果建议CD38对RA的重要作用和作为治疗靶点的可能性。我们前期通过流式细胞术检测还发现CD38（+）CD56（+）细胞在RA外周血（n=103）中比例显着升高,且与临床表现正相关。CD56是自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）重要的标志物。NK细胞是人体重要的免疫细胞。与肿瘤和感染密切相关。如NK细胞即可通过直接接触杀伤又可通过抑制调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的分化和功能抑制肿瘤进展。NK细胞与类风湿性关节炎密切相关。如NK细胞既可以通过调节骨代谢,介导骨侵蚀,又可以通过影响分泌TNF-α、IFN-γ等细胞因子调节B、T、巨噬细胞等免疫细胞或成纤维细胞的活性和功能间接或者直接参与RA的进程。众所周知,CD38在促进NK细胞的活化中发挥重要作用。有研究者报道,CD38（+）CD56（bright）CD16（-）NK通过抑制CD4（+）T细胞的增殖,参与类风湿性关节炎的进展。这些结果提示CD38（+）NK细胞对RA的重要作用和作为治疗靶点的可能性。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷通常为氯化矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Kuromanin Chloride,Cyanidin-3-O-glucoside Chloride,1-Benzopyrylium,5,7-dihydroxy-2-（3,4-dihydroxyphenyl）-3-（β--D-glucopyranosyloxy）-,chloride,C3G）,其分子式为C21H21C1011,结构母核为2-苯基苯并吡喃阳离子,属于类黄酮化合物。据报道,C3G具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化药物作用。研究发现,C3G也是CD38的抑制剂,可通过与CD38活性部位结合,竞争性抑制CD38的功能。因此,我们推断C3G具有治疗RA的可能性。本研究以牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠（Collagen-Induced Arthritic,CIA）和体外培养的RA滑膜成纤维细胞（RA synovial fibroblast-like cells,RASFs）、RA滑液和健康人外周血单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）为模型,探索C3G对RA潜在的作用及机制。方法:本研究计划用C3G处理CIA大鼠,观察处理后大鼠关节炎症、关节组织病理、外周血和关节滑液中各淋巴细胞亚型及炎性因子的变化。本研究也用C3G刺激体外培养的RASF,观察处理后RASF细胞增殖、凋亡、细胞周期以及RASF培养液中各炎性因子分泌的变化。本研究还计划探索CD38参与RA和C3G治疗RA的细胞免疫学机制和分子通路。我们用C3G孵育外周血或RA关节滑液来源的MNCs,观察共培养后各淋巴细胞亚型和各炎性因子的变化。基于上述观察结果,本研究重点分析CD38（+）NK细胞和Treg细胞的变化。我们用C3G直接培养NK细胞、MNC和Treg细胞,观察C3G是否直接作用这些细胞,以及NK细胞中cADPR和Ca2+的相对含量及CD38基因表达。也基于上述观察结果,本研究将CD38（+）NK细胞与MNC细胞共培养,重点观察CD38（+）NK诱导MNC分化Treg细胞的机制。结果:1.C3G对CIA大鼠病程的作用。我们以CIA大鼠作为RA的动物模型,用C3G治疗CIA大鼠后,用流式细胞技术分析CIA大鼠外周血、关节滑液中各细胞亚型和细胞因子。结果表明,C3G注射后大鼠CIA有明显缓解,而且外周血和关节滑液中炎症因子IL-6和IFN-r浓度降低,抑炎因子IL-10水平升高。C3G注射可升高CIA大鼠外周血和滑液中Treg细胞的比例、降低CD38（+）NK细胞比例下降。这些结果说明,C3G对RA和CIA有治疗作用。2.C3G对RA滑膜成纤维细胞增殖、凋亡作用。我们以RASF细胞作为RA的体外模型,用C3G处理后的RASF增殖能力降低,细胞凋亡水平升高,培养液中IL-6分泌水平也降低。3.C3G对外周血和滑液中单个核细胞作用。我们以外周血和滑液来源的MNC细胞作为RA的体外模型,用C3G分别培养外周血和RA滑液来源的MNC,发现C3G可以降低MNC中CD38（+）NK细胞比例,升高Treg细胞及IL-10（+）Treg细胞比例。C3G同时提升MNC培养液中IL-2和IL-10分泌,降低IL-6和IFN-r分泌。4.C3G对Treg细胞和NK细胞作用。为了探索C3G诱导Treg细胞比例的分子机制,（1）我们用C3G培养Treg细胞,发现C3G不直接影响Treg细胞增殖和分泌IL-10。（2）我们用C3G刺激NK细胞后和Treg细胞共培养,发现NK细胞降低MNC中Treg细胞和IL-10（+）Treg细胞比例。C3G通过NK细胞提高Treg细胞的比例和IL-10分泌功能。（3）我们用C3G培养NK细胞,发现C3G可降低NK细胞中CD38的mRNA和蛋白水平的表达,同时降低培养液中cADPR和Ca2+的浓度。这些结果说明,C3G也有效的抑制CD38的表达和活性。以上结果提示,C3G可能通过影响CD38（+）NK细胞影响Treg细胞和IL-10分泌功能。5.C3G处理后的CD38（+）NK细胞对MNC作用。为了验证以上猜想,我们用C3G培养去除CD38（+）NK的MNC,发现C3G不影响MNC中Treg细胞的比例及细胞因子分泌水平。与C3G处理的CD38（+）NK共培养后MNC中Treg细胞比例升高,IL-6和IFN-γ的浓度降低,IL-10的浓度升高。以上结果提示,C3G通过降低CD38（+）NK细胞比例去提升MNC中Treg细胞的比例,从而增加IL-10分泌和降低IL-6和IFN-r水平。6.Sirt 6对CD38（+）NK细胞分泌功能的影响。为了探究C3G对CD38（+）NK细胞分泌功能的影响及机制。我们C3G处理CD38（+）NK细胞后,（1）WB和real-time PCR结果表明C3G升高Sirt 6基因表达水平和降低NKG2D表达水平。（2）流式结果表明,C3G处理后CD38（+）NK培养液中TNF-α的浓度升高,IFN-γ的浓度降低。（3）为了验证TNF-α、IFN-γ在Treg细胞分化中的作用,我们分别用TNF-α、IFN-γ、anti-IFN-γ抗体和anti-TNF-α抗体加入到CD38（+）NK与去除CD38（+）的MNC培养体系中,实验表明TNF-α促进C3G处理的CD38（+）NK细胞提升MNC中IL-10（+）Treg细胞比例,IFN-γ促进C3G处理的CD38（+）NK细胞降低MNC中IL-10（+）Treg细胞比例。（4）为了探究Sirt6对CD38（+）NK分泌功能的影响,我们将去除CD38（+）NK的MNC与Sirt 6 siRNA转染后的CD38（+）NK细胞共培养,结果提示,CD38（+）NK细胞通过Sirt 6基因表达抑制TNF-a和IFN-r分泌。以上结果表明,C3G通过促进CD38（+）NK细胞中Sirt 6表达,影响CD38（+）NK细胞分泌功能。7.Sirt 6抑制剂对大鼠CIA作用。为了明确Sirt6在C3G治疗RA中发挥的重要作用,我们用C3G联合Sirt 6抑制剂注射CIA大鼠发现CIA大鼠足趾仍然肿胀,Treg细胞比例仍较低。与C3G处理的对照组相比,C3G联合Sirt 6抑制剂处理后CIA大鼠足趾炎症明显升高。与CIA对照组相比,C3G处理后CIA大鼠和C3G联合Sirt 6抑制剂处理CD38（+）NK 比例均下降,而且二者无明显差异。这些结果证明Sirt 6抑制剂不影响CD38（+）NK数量,而可能是通过改变其功能降低Treg细胞比例来阻止C3G对CIA的治疗作用。结论:C3G对CIA和RA有治疗作用。C3G处理抑制CD38+NK细胞比例、RASF增殖和促炎细胞因子分泌,但增加Treg细胞比例。C3G在CD38+NK细胞内提高Sirt6的表达和抑制NKG2D的表达并刺激TNF-α的分泌、减少IFN-γ的分泌,结果刺激MNC分化为Treg细胞。上述发现为C3G作为治疗RA药物应用于临床提供了理论依据。
曹韪凡[2]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中研究说明近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
韩露[3]（2020）在《CD103+ CD8+组织定居T细胞在食管鳞癌中的免疫学特性和功能研究》文中提出食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,虽然近几年手术和新辅助放化疗在临床治疗上已经取得很大进展,但ESCC患者的5年生存率仍然很低。基于肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）的免疫治疗是治疗肿瘤的有效方法之一,可能因为CD8+TIL含有不同的细胞亚群,从而导致患者的临床疗效差异较大。因此,深入探究CD8+T淋巴细胞有助于我们发现和肿瘤诊断、治疗、预后更相关的T淋巴细胞亚群。组织定居记忆（tissue-resident memory,TRM）T细胞是最近几年发现的新的淋巴细胞亚群。TRM细胞可产生效应细胞因子,对病原体感染的细胞能直接产生细胞毒性,从而参与抗肿瘤免疫反应。CD103+CD8+TRM细胞在人肿瘤组织中已有报道,但这些研究仅限于用免疫组化的方法回顾性分析TRM细胞的浸润比例和患者生存预后的关系,对其在人肿瘤组织中的特性及功能还未做进一步研究。CD103+CD8+TRM细胞在人ESCC肿瘤组织中是否存在及其在抗肿瘤免疫反应中的免疫学特性及功能至今未有研究报道。为了探索CD103+CD8+TRM细胞在ESCC中的存在情况,我们首先对TCGA数据Ⅰ-Ⅳ期ESCC的转录组测序（RNA-sequencing,RNA-Seq）结果进行分析。研究发现在ESCC肿瘤组织中,CD8A基因表达与TRM细胞标记基因-整合素αE亚单位（ITGAE,又名CD103）基因表达呈正相关性（r=0.4786）,CD8A高表达的肿瘤组织样本富集较高的ITGAE基因（P<0.001）,并且在CD8A高达的肿瘤组织样本中,TRM细胞相关基因RUNX3、CD69、CXCR6明显高于CD8A低表达的肿瘤组织样本（P<0.01、P<0.0001、P<0.0001）;进一步分析 CD9、RUNX3、CXC6与ITGAE基因的关系,发现CD69、RUNX3、CXCR6与ITGAE基因的表达也具有显着正相关性（r=0.3189、r=0.2478、r=0.5142）,并且 CD69、RUNX3、CXCR6在ITGAE基因高表达的肿瘤组织样本中表达明显高于ITGAE基因低表达的肿瘤组织样本（P<0.01、P<0.05、P<0.0001）;此外,ITGAE与PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3、TIGIT等免疫检查点分子及颗粒酶B、干扰素-γ杀伤性分子对应的基因之间显着正相关（r=0.4631、r=0.4108、r=0.3869、r=0.4394、r=0.4788、r=0.5054、r=0.3682）;与ITGAE低表达的肿瘤组织相比,ITGAE高表达的肿瘤组织样本也高表达PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3和TIGIT等免疫检查点基因（P<0.0001、P<0.0001、P<0.001、P<0.001、P<0.001）,并高表达颗粒酶B和干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）（P<0.0001、P<0.001）等杀伤性分子基因。以上结果表明食管鳞癌在基因水平可能存在CD103+CD8+TRM细胞,并且可能是肿瘤免疫反应中的主要效应细胞。ESCC中表达较高的CD103+CD8+TRM细胞相关基因,接下来通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）验证新鲜初治ESCC手术标本中CD103+CD8+TRM细胞的存在情况。结果显示ESCC肿瘤组织中存在CD103+CD8+TRM细胞,为（60.47±3.99）%;并且高表达PD-1、TIM-3免疫检查点,PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+表达依次为（48.51±4.74）%、（29.09 ± 4.61）%、（39.73±5.03）%;同时也高表达CD69及低表达CD62L、CCR7,依次为（57.66±7.65）%、（2.42±0.89）%、（4.42±1.20）%,表明 CD103+CD8+T细胞有可能是一群肿瘤特异性T细胞,并具有组织定居T细胞的表型特征。为了了解化疗药物对肿瘤组织样本中CD103+CD8+TRM细胞的影响,我们进一步用FCM方法分析新辅助化疗后的ESCC患者中CD103+CD8+TRM细胞的浸润情况,结果发现新辅助化疗后ESCC肿瘤组织中CD103+CD8+T细胞的浸润比例为（65.11±6.20）%,并且高表达PD-1、TIM-3免疫检查点,PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+表达依次为（52.40±6.31）%、（42.15±6.09）%、（52.43±5.80）%;并且,新辅助化疗后肿瘤组织中CD103+CD8+TRM细胞的比例,及 CD103+CD8+TRM 细胞上 PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+的表达比例与初治患者相比无统计学差异（P>0.05）,推测CD103+CD8+TRM细胞可能不受化疗药物的影响。回顾性分析2012年9月到2013年5月初治的76例ESCC癌旁组织和癌组织蜡块标本中CD103和CD8 T细胞的浸润情况,并收集患者的临床病理信息。结果显示,癌组织和癌旁组织均有CD8+和CD103+细胞浸润,但组织多色免疫荧光显示癌组织中大多数CD103+细胞共表达CD8+,显示CD103+CD8+T细胞表型,而在癌旁组织中大多数CD103+细胞不共表达CD8+,表明癌组织中CD103+细胞是T细胞来源。另外,Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank检验结果发现CD103+和CD8+T细胞的高表达与ESCC患者较好的临床预后有关。以上结果表明CD103+CD8+TRM细胞和ESCC好的临床预后关系密切。我们进一步研究观察到,在ESCC新鲜组织标本中,与CD103-CD8+T细胞相比,CD103+CD8+T细胞Ki67增殖能力强,为（8.29±1.10）%,可分泌IFN-γ、IL-2 并且表达 CD107a,为（6.55±2.08）%、（4.24 ± 1.52）%、（11.71±1.94）%。另外,由于CD103+CD8+T细胞高表达PD-1,为了探究PD-1阻断对CD103+CD8+T细胞的影响,用anti-PD-1抗体和CD103+CD8+T细胞共孵育,发现CD103+T细胞在anti-PD-1抗体阻断后IFN-γ和 IL-2分泌能力增强,依次为（11.00±3.15）%、（5.71±1.64）%。为了更充分研究 anti-PD-1 药物对 CD103+CD8+T细胞的影响,我们运用化学致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）饮水法建立小鼠原发食管癌模型,检测anti-PD-1抗体治疗原位食管癌小鼠后,小鼠体内CD103+CD8+T细胞的变化情况。结果显示食管癌小鼠经anti-PD-1抗体治疗后,食管组织肿瘤灶数目明显较少,对照组和anti-PD-1抗体治疗组肿瘤数目分别为4.14±0.59,2.28±0.35,有统计学差异（P<0.05）;免疫组化结果显示食管肿瘤组织浸润的CD103+淋巴细胞（H-Score评分）在对照组和治疗组分别为0.08±0.01,0.14±0.01,两组之间有统计学差异（P<0.05）,由此推测anti-PD-1抗体对小鼠的治疗作用有可能和CD103+T细胞的浸润增加有关。以上几部分研究对CD103+CD8+TRM细胞的存在及特性有了初步认识,最后以4-NQO诱导的食管癌小鼠为研究对象,FCM分选脾脏CD103-CD8+T细胞和CD103+CD8+T细胞,利用新一代RNA-seq技术,初步探索CD103-CD8+T细胞和CD103+CD8+T细胞的转录组差异表达基因。结果显示CD103+CD8+T细胞相对于CD103-CD8+T细胞差异表达基因的功能富集主要集中在细胞毒功能、细胞免疫反应、细胞粘附功能及相关的信号通路。这与以往的研究相吻合,表明CD103+CD8+T细胞可能参与了食管癌肿瘤组织中的免疫反应。综上所述,ESCC中存在CD103+CD8+TRM细胞,并且与患者的预后密切相关,是一群可能不受化疗药物影响,在肿瘤环境中容易被活化,容易产生应答的肿瘤反应性T细胞。并且,靶向PD-1后,CD103+CD8+TRM细胞功能有所增强,为食管癌免疫治疗的联合治疗提供有效的理论基础。
麻春辉[4]（2020）在《激活素A调控小鼠NK细胞活性作用及其机制》文中研究说明NK细胞是一种起源于骨髓前体细胞的大颗粒淋巴细胞,是机体重要的固有免疫细胞。当机体受到病毒感染或肿瘤生长和侵袭时,NK细胞被快速招募到受损的组织器官中,清除受感染细胞或发生恶变的细胞;NK细胞还可通过产生的细胞因子,调节免疫细胞功能。激活素A（Activin A）属于转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族因子,可由多种免疫细胞产生,如单核巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞以及Th2细胞等,参与多种免疫细胞功能调节。IL-9（Interleukin-9,IL-9）是一种重要的促炎细胞因子,主要由Th9细胞产生。但是,NK细胞能否产生Activin A及IL-9?Activin A对小鼠NK细胞功能又有何影响?仍不清楚。因此,本研究首先分析小鼠NK细胞是否能产生Activin A及IL-9,同时确定小鼠NK细胞是否属于Activin A应答细胞,进而揭示Activin A通过自分泌/旁分泌方式调控小鼠NK细胞活性作用及其相关机制。一、研究方法1.细胞因子检测采用细胞内细胞因子染色方法检测Balb/c小鼠NK细胞产生的Activin A、IL-2、IL-9、IL-10及IFNγ,ELISA法检测小鼠NK细胞分泌成熟Activin A及IL-9水平。2.激活素受体检测免疫双荧光染色及流式细胞术分析激活素II型受体（ActRIIA及ActRIIB）在小鼠NK细胞表面的表达。3.Smad3基因敲低实验采用pGCsi-U6/Neo-GFP对照质粒和pGCsi-U6/Neo-GFP-Smad3 shRNA表达质粒分别转染小鼠NK细胞,检测敲低Smad3基因表达对Activin A刺激的小鼠NK细胞产生细胞因子的影响4.IIAhigh和IIAlowNK细胞亚群分析采用流式细胞术检测小鼠外周血、淋巴结、脾脏及肝脏ActRIIAhigh(IIAhigh)NK和ActRIIAlow(IIAlow)NK细胞比率。吉姆萨染色观察流式细胞术分选的IIAhigh和IIAlowNK细胞形态学特征,BrdU法检测IIAhigh和IIAlowNK细胞增殖能力,与YAC-1细胞共孵育检测细胞杀伤活性,贴壁法检测细胞粘附能力。NS-1细胞移植瘤内注射Activin A,流式细胞术检测Activin A体内作用对移植瘤内IIAhighNK细胞比率的影响。二、研究结果1.小鼠NK细胞分泌Activin ART-PCR结果显示,小鼠NK细胞不仅表达ActivinβA mRNA,也表达ActRIIA、ActRIIB及Smad2,3,4 mRNA。细胞内细胞因子染色显示,小鼠NK细胞内存在Activin A蛋白表达。ELISA检测结果显示,IL-2可以促进体外培养NK细胞分泌成熟Activin A。2小鼠NK细胞表达激活素受体免疫双荧光染色显示Balb/c小鼠NK细胞同时表达NK细胞标志CD49b和ActRIIA,流式细胞术进一步证实Balb/c小鼠CD3-CD49b+NKp46+NK细胞表达ActRIIA及ActRIIB。3.Activin A对NK细胞活性的影响研究显示Activin A可下调小鼠NK细胞IFNγ产生,但却上调IL-2产生,而对IL-10的产生没有影响。BrdU增殖试剂盒检测结果显示,IL-2可以明显促进NK细胞增殖及杀伤活性,而Activin A则对NK细胞增殖具有抑制作用,但对杀伤活性没有明显影响。作为阳性对照的CXCL12能促进小鼠NK细胞黏附,Activin A也能增加NK细胞黏附。4.激活素A抑制小鼠NK细胞IL-9表达细胞内细胞因子染色结果显示,小鼠外周血和脾脏CD3+CD4+Th细胞和小鼠外周血和脾脏CD3-CD49b+NKp46+NK细胞均表达IL-9。Activin A可以促进小鼠CD4+Th细胞产生IL-9,但却显着抑制NK细胞IL-9产生。Western blotting结果表明,Activin A明显上调小鼠NK细胞ActRIIA、Smad3及p-Smad3蛋白水平。添加激活素A阻断剂Follistatin（FST）或敲低Smad3基因均可以减弱Activin A对IL-9释放的抑制作用。5.IIAhigh和IIAlowNK细胞亚群特征流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结、肝脏NK细胞,结果显示,不同组织器官中的NK细胞均有不同程度的ActRIIA（IIA）表达,据此可将NK细胞分为IIAhigh与IIAlow两个亚群。研究显示小鼠IIAhighNK细胞CD25、精氨酸酶1（Arg1）及诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）表达量均高于IIAlowNK细胞;而IIAlowNK细胞CD11b表达量高于IIAhighNK细胞。研究还显示IIAhighNK细胞IFNγ、IL-2、IL-10及IL-9产生能力强于IIAlowNK细胞;IIAhighNK细胞亚群杀伤活性强于IIAlowNK细胞亚群;自然状态下两者增殖能力没有区别,而IL-2作用的IIAlowNK细胞亚群比IIAhighNK细胞亚群具有更强的增殖能力,IIAlowNK细胞比IIAhighNK细胞具有更强的粘附能力。体内实验显示,NS-1细胞移植瘤内注射Activin A,可以明显增加瘤内具有杀伤活性的IIAhighNK细胞比率。三、结论综上所述,小鼠NK细胞既是Activin A来源细胞,也是Activin A应答细胞;NK细胞还是IL-9来源细胞,Activin A可以促进CD4+Th细胞产生IL-9,但却抑制NK细胞产生IL-9,提示激活素A作用于不同细胞产生不同的生物学效应;依据激活素IIA型受体表达可将小鼠NK细胞分为IIAhigh及IIAlowNK细胞亚群,两个亚群细胞生物学特征和活性均不同。上述资料提示,Activin A作为NK细胞重要的调控因子,可能通过自分泌或旁分泌的方式调控NK细胞功能,但有关NK细胞亚群的生理病理学意义,仍有待进一步深入研究。
张良[5]（2020）在《WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究》文中认为第一部分WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究研究背景与目的:B细胞产生保护性抗体是机体体液免疫应答对抗病毒、细菌等微生物感染入侵的最重要机制之一,体液免疫应答形成的记忆B细胞和长寿命浆细胞是机体适应性免疫应答的核心,而该过程的产生依赖于生发中心B细胞免疫应答（Germinal Center B cell reaction）,活化的B细胞在此历经克隆增殖、体细胞超频突变、抗体类别转换、抗体亲和力成熟等过程,这些过程也需要与一类特殊的CD4辅助T细胞即滤泡辅助性T淋巴细胞（Follicular Helper T cell,Tfh）的相互作用。在急性LCMV病毒感染模型中,CD4辅助T细胞在不同的TCR信号、细胞因子、信号转导分子、核转录因子的调控下主要分化成Tfh细胞和Th1细胞,分别发挥辅助B细胞和CD8 T细胞的作用。Tfh的分化是一个多步骤的过程,涉及到DC细胞和活化T细胞间突触、TCR-MHCⅡ的相互作用,共刺激分子、细胞因子及信号转导分子对其主要转录因子BCL6的调控决定Tfh早期分化命运;早期分化的Tfh迁移至GC,在此处与GCB细胞间通过频繁的细胞接触、细胞因子、共刺激分子等相互作用进一步发育为GCTfh,在GC中Tfh和GCB间相互作用,既促进GCB免疫应答,也促进和维持GCTfh的分化和功能。急性LCMV病毒感染是研究CD4辅助T细胞分化、Tfh分化发育、生发中心B细胞免疫应答、抗体生成、Th1功能和免疫记忆的理想模型之一。Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome,WAS）是一种少见的X-连锁隐性遗传性免疫缺陷病,该病由编码WAS蛋白（WASp）的WAS基因突变所致,WAS患儿易感染各种病原,包括病毒、细菌、真菌等。WASp仅在造血系统表达,是肌动蛋白多聚化和细胞骨架重塑的关键分子,通过细胞骨架依赖及非依赖途径在造血细胞分化、迁移,免疫突触形成,细胞信号传导中起重要作用,WASp缺陷可导致多种免疫细胞的功能异常,导致机体对病原体产生特异性抗体功能缺陷和细胞免疫应答缺陷。但目前WASp缺陷如何影响感染状态下CD4 T与B淋巴细胞的免疫应答的机制尚不十分清楚,本研究使用急性LCMV病毒感染WASKO小鼠为模型,探讨WASp缺陷对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响和可能的分子机制。方法:通过流式细胞术检测不同时间段急性LCMV病毒感染后WASKO和WT小鼠脾脏中CD4辅助T细胞中Th1和Tfh细胞亚群的比例、主要分化发育相关的共刺激分子、信号转导分子和主要的核转录因子,检测GCB发育、GCB亚群、GCB的主要核转录因子BCL6。利用四聚体技术检测抗原特异性Th1和Tfh细胞的比例。通过NP-KLH免疫小鼠后,检测小鼠脾脏记忆B细胞前体细胞比例,探讨抗原特异性GCB细胞的分化。通过WASKO/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证WAS蛋白缺陷在急性LCMV病毒感染时特异性T和B细胞免疫缺陷是否为固有存在。结果:WASKO小鼠在急性LCMV病毒感染条件下CD4辅助T细胞早期分化阶段出现IL2-CD25-STAT5轴信号转导障碍导致Th1细胞发育障碍,进而Tfh分化占优势;WASp缺陷影响Tfh进一步发育的主要功能分子BCL6和ICOS,导致GCTfh的发育障碍;WASKO小鼠GCB主要的核转录因子BCL6表达障碍,GCB暗区形成障碍;GCB细胞分化异常表现为GCB分化为多克隆性记忆B细胞前体细胞比例增高而分化成多克隆性记忆B细胞存在障碍;NP-KLH免疫条件下抗原特异性GCB分化为记忆B细胞前体细胞比例增加,但分化形成抗原特异性记忆B细胞存在障碍。WT小鼠GCB细胞内WASp呈现异质性表达的现象,并且BCL6的表达量与WASp呈正相关。结论:WASp作为肌动蛋白骨架蛋白调节因子通过多种途径参与了急性LCMV病毒感染中CD4辅助T细胞的早期分化命运、Tfh的发育和GCB免疫应答和记忆B细胞形成的过程。第二部分PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究研究背景与目的:活化的磷酸肌醇3-激酶δ综合征（Activated phosphoinositide 3-kinaseδsyndrome APDS）是一种由PIK3CD增功能突变（gain-of-function（GOF）mutation）引起的常染色体显性遗传性原发性免疫缺陷病,该基因编码磷酸肌醇3-激酶δ（PI3Kδ）的催化亚基p110δ。PI3Kδ是包含p110δ催化亚基和p85a调控亚基的异二聚体,催化产生磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯,PI3Kδ主要表达在白细胞中并在其增殖生存和激活中起重要作用。APDS患者临床主要表现为反复窦肺感染、支气管扩张、良性淋巴组织增生、疱疹病毒感染以及自身免疫性疾病,其免疫表型主要为高Ig M、低Ig G、CD4 T淋巴细胞减少、衰老耗竭性CD8 T淋巴细胞增加。目前研究阐明Tfh和GCB的异常导致患者出现低Ig G,但患者出现高Ig M血症的机制尚不十分清楚。在机体边缘区B细胞（marginal zone B cell,MZB）及B1细胞是产生Ig M的主要来源,患者和小鼠模型中均发现在B细胞亚群中MZB及B1细胞比例增加和滤泡B细胞的明显减少,且增多的MZB和B1与自身免疫性疾病和肺部感染易感性相关,但p110δ过度活化如何导致MZB和B1细胞增加的机制尚不清楚。早期B细胞在骨髓发育后进入脾脏进一步发育分化成熟,逐渐经历过渡性B细胞T1、T2阶段分化为成熟的滤泡B细胞和MZB,目前的研究表明在更早的T1B阶段即存在ADAM10阳性的细胞亚群为专职发育成MZB的前体细胞以及CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+的过渡性B细胞为专职发育成B1的前体细胞。本实验拟通过检测APDS小鼠脾脏前体B细胞亚群,探讨PI3Kδ过度活化是否在过渡性B细胞阶段即影响了专职的MZB前体细胞和B1前体细胞的分化进而导致B细胞的分化发育异常。方法:通过流式细胞术检测APDS小鼠和WT小鼠脾脏T1B、T2B、CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+B、ADAM10+T1B等B细胞各亚群的比例。通过APDS/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证B细胞各亚群的发育分化异常是否为固有存在。结果:与WT小鼠相比,APDS小鼠脾脏成熟滤泡B细胞比例下降,CD19+B220+CD21+CD23-CD93-和CD19+B220+CD21+CD1d+CD93-MZB增加,CD19+B220low CD5+B1细胞增加,CD19+B220+CD21-CD23-CD93-的双阴性B细胞比例增加;APDS小鼠CD19+B220+Ig M+CD23-CD93+的T1B细胞比例增加,CD19+B220+Ig M+CD23+CD93+的T2B细胞比例下降;APDS小鼠脾脏B1细胞前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+、MZB前体细胞ADAM10+T1B细胞亚群比例增高。结论:PI3K过度活化通过影响T1B细胞ADAM10的表达使得在T1B细胞阶段专职的MZB前体细胞分化增加是APDS小鼠MZB细胞发育增加而成熟滤泡B细胞发育减少的重要机制之一;PI3K过度活化在过渡性B细胞阶段导致脾脏前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+分化增加进而导致脾脏B1细胞的发育增加。第三部分一例RAC2基因自发突变患儿临床研究研究背景:RAC2蛋白（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2,RAC2）属于GTP酶的Rho超家族的成员,其主要表达于造血系统,作为中性粒细胞NADPH组成元件参与粒细胞ROS产生、作为分子开关通过调节GTP结合状态（活化状态）与GDP结合状态（失活状态）间的相互转换促发下游级联反应发挥免疫细胞骨架重排、细胞伪足形成、吞噬细胞黏附趋化吞噬功能、T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育、迁移、活化及参与PAK1等多种信号通路信号传导发挥多种生物信息功能。RAC2基因突变病例极其罕见,既往报道RAC2基因突变方式包括常染色体显性失功能突变方式导致中性粒细胞功能严重障碍而表现为CGD的临床症状,部分患儿表现为T淋巴细胞的严重减少;以及常染色体隐性失功能突变方式导致CVID的临床表现;这两种遗传方式导致的RAC2蛋白的表达明显下降或缺失,为失功能（loss of function,LOF）的突变。随着基因测序技术的发展和广泛应用,目前逐渐有RAC2常染色体显性增功能突变方式导致RAC2蛋白活性增强（gain of function,GOF）的病例报道,此类患儿的临床表现各异,其粒细胞ROS活性增强,T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低,对于T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低的机制目前不清楚。本中心收治1例RAC2基因自发突变的患儿,该突变位点未见报道,临床主要变现为反复的肺部感染和支气管扩张,我们对其临床和部分免疫细胞功能进行了初步研究。研究方法:分离外周血单个核淋巴细胞及中性粒细胞,进行一代测序;通过流式细胞术检测患儿淋巴细胞亚群表型;通过CD3+CD28及PMA+离子霉素体外刺激检测T淋巴细胞增殖功能;通过鲁米诺放大化学发光法检测中性粒细胞ROS的产生;通过流式细胞术检测中性粒细胞肌动蛋白的表达情况;通过共聚焦显微镜观察中性粒细胞及T淋巴细胞极化状态;通过蛋白免疫印迹检测RAC2蛋白的表达情况;通过流式细胞术检测中性粒细胞和T淋巴细胞及B淋巴细胞凋亡;通过流式细胞术检测单个核淋巴细胞亚群RAC2的表达情况。结果:患儿为RAC2基因自发错义突变,患儿单个核淋巴细胞及中性粒细胞均存在此突变,其免疫表型为联合免疫缺陷,其T细胞增殖功能减低,粒细胞产生ROS功能增强,粒细胞肌动蛋白表达增强;患儿中性粒细胞及T淋巴细胞体外刺激时细胞actin和RAC2极化状态缺陷;患儿中性粒细胞RAC2蛋白表达增强;患儿中性粒细胞和淋巴细胞凋亡增加;患儿淋巴细胞中存在RAC2高表达亚群。结论:本研究发现一例罕见的RAC2基因自发突变,表现为增功能突变,免疫表型为联合免疫缺陷,其淋巴细胞及中性粒细胞功能均受影响。
刘振广[6]（2018）在《灵芝多糖脂质体和脂质立方液晶纳米粒免疫增强作用的研究》文中指出灵芝是担子菌纲多孔科灵芝属真菌,是我国传统的补益药。现代药理学研究表明,灵芝多糖作为灵芝中主要的活性成分之一,具有调节免疫、抗衰老、抗肿瘤、保肝护肝、抗氧化和强心等作用。但灵芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP）属于大分子多糖,在应用时存在体内代谢较快,作用时间短、靶向性弱、易聚集等不足。因此,为了提高灵芝多糖靶向性或延长其作用时间,对其新剂型的开发显得尤为重要。脂质体是一种微小囊泡,它具有类似生物膜结构的磷脂双分子层。脂质体不仅能够有效递送药物,而且能作为疫苗递送系统。脂质立方液晶纳米粒具有两亲性脂质分散在水溶液中自组装成含双连续水区和脂质区的闭合脂质双层“蜂窝状”结构,能够包封各种不同极性和剂量的药物,具有多样化的药物包裹性,具有很多应用功能,如保护药物活性、控制药物释放、靶向给药以及阻止药物分子间发生聚集等。脂质立方液晶纳米粒因其独特的内部结构能够有效地运载药物或抗原。将灵芝多糖包封于脂质体和脂质立方液晶纳米粒中,不仅可以利用脂质体和脂质立方液晶纳米粒的良好药物载体优势帮助灵芝多糖有效递送,还可以利用二者优点,弥补二者不足,从而更有效地发挥免疫增强作用。因此,本研究将灵芝多糖分别包封于脂质体和脂质立方液晶纳米粒中,制备成灵芝多糖脂质体（Ganoderma lucidum polysaccharide liposome,GLPL）和灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒（Ganoderma lucidum polysaccharide Cubosome,GLPC）,对其质量和稳定性进行了评价,并从体外试验和体内试验研究了其免疫增强作用和作用机理。试验分为以下八个部分:试验Ⅰ 灵芝多糖脂质体的制备及制备条件的优化为了得到包封率高的灵芝多糖脂质体,本试验采用逆相蒸发法制备灵芝多糖脂质体并用响应曲面法优选GLPL制备的最佳条件。首先,以GLPL的包封率和载药量为指标,考察了 4个单因素对GLPL制备的影响,筛选出磷脂与胆固醇质量比、磷脂与吐温80的质量比、超声时间等对GLPL制备影响较大的3个单因素。然后,采用响应面分析法以包封率为响应值研究单因素试验筛选出的3个因素对GLPL制备的影响,经过优化后得到GLPL最佳制备条件为:磷脂与胆固醇质量比11:1,磷脂与吐温80质量比为10.5:1和超声时间为1 1min。在最佳制备条件下进行验证试验,得到的GLPL的包封率实测平均值为71.43±0.49%,与包封率预测值相比,相对误差仅为1.6%。所制备的GLPL,经过透射电镜观察发现形状呈类球形,大小均一;经过马尔文粒度分析仪测得粒径为164.3±9.2 nm。试验Ⅱ灵芝多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和分化的影响为了研究灵芝多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖及分化的影响。本试验将不同浓度的灵芝多糖脂质体单独或者与LPS或PHA同时加入小鼠脾脏淋巴细胞中,采用MTT法和流式细胞仪分别测定了 GLPL对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和脾脏淋巴细胞分化的影响。结果显示,在单独或者协同LPS、PHA作用下,GLPL均能明显刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖。在浓度为62.5μg/mL时,GLPL单独或者协同LPS、PHA刺激淋巴细胞增殖的作用最强,且显着好于GLP、BL及空白对照组;与GLP相比,GLPL能够更加有效地促进T淋巴细胞向CD4方向分化。试验表明GLP经过脂质体包封后对脾脏淋巴细胞增殖的作用和对脾脏淋巴细胞的分化得到明显增强。试验Ⅲ 灵芝多糖脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响为了研究灵芝多糖脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力、分泌细胞因子等功能的影响,本试验将不同浓度的GLPL、GLP和空白脂质体加入到小鼠腹腔巨噬细胞中,利用流式细胞仪检测药物对腹腔巨噬细胞吞噬荧光标记的大肠杆菌的能力和MHCⅡ分子表达的影响,采用ELISA法测定药物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子以及炎症因子NO、iNOS的影响。结果显示,GLPL能显着增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能和表面MHCⅡ分子的表达,能显着促进巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α、IFN-γ等细胞因子,并通过促进iNOS的活性进一步促进NO的产生,且在一定浓度下,效果好于GLP。试验表明GLP经过脂质体包封后活化巨噬细胞的能力更强。试验Ⅳ 灵芝多糖脂质体对OVA免疫小鼠的免疫增强作用为了研究灵芝多糖脂质体包封OVA后的质量评价和免疫增强作用,本试验首先采用冷冻复融法将OVA包封于GLPL中,分别测定在4℃和37℃保存时在不同时间点的脂质体中OVA的包封率和4℃保存时不同时间点的脂质体的粒径和分散系数。然后,将120只5周龄的BALB/c小鼠随机均分成6个组,分别皮下免疫含不同免疫增强剂的OVA,每周免疫一次,重复免疫三次。在首免后24h和48h,收集小鼠淋巴结,采用流式细胞仪检测树突状细胞表面分子的表达;在三免后14天,各组随机抽取4只,无菌取脾脏,分离脾淋巴细胞,分别采用MTT法和流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞增殖和分化;收集不同时间段的小鼠血清,采用ELISA法测定OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a以及细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-4、IL-6的浓度。结果显示,GLPL包封抗原后在4℃保存时,包封率下降速度低于37℃保存时;其粒径和分散系数在28天内变化较小,稳定性较好;佐剂活性试验结果显示,GLPL能显着促进小鼠淋巴结中DCs的成熟,促进脾脏淋巴细胞的增殖和分化,提高小鼠体内OVA特异性抗体、IFN-γ、TNF-α和IL-4的水平以及IgG2a/IgG1的比值,且效果均好于GLP。试验表明GLP经过脂质体包封后不仅促进小鼠淋巴结内树突状细胞的成熟和活化脾脏淋巴细胞的能力增强,而且提高小鼠体液免疫和细胞免疫应答的作用也增强。试验Ⅴ 灵芝多糖脂质体对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用为了研究灵芝多糖脂质体作为PCV-2苗佐剂的免疫增强作用,本试验将100只小鼠分成5组,分别免疫不同免疫增强剂的PCV-2疫苗,一周后二免。在一免后7、14和21天,采用ELISA法测定血清中特异性IgG水平及抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α的浓度;并在一免后的21天,采集小鼠脾脏,制作组织切片,采用HE染色观察各组脾脏组织学变化。结果显示,与GLP组和BL组相比,GLPL更能有效地促进小鼠产生PCV-2特异性IgG、抗体亚型IgG1.、IgG2a、IgG3及细胞因子IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α;脾脏组织学结果显示,GLPL能够显着刺激小鼠脾脏脾小体的增大。试验表明GLPL作为PCV-2苗的免疫增强剂能够显着提高小鼠对PCV-2的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,且效果好于GLP。试验Ⅵ 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备方法优选及质量评价为了制备稳定性良好和包封率高的灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒,本试验对GLPC的制备方法进行了筛选,比较了不同分散介质对GLPC质量的影响,并对其基本特征进行了分析检测。结果发现,乙醇分散法制备的GLPC包封率较高;以双蒸水为分散介质制备的GLPC更加稳定;所制备的GLPC平均包封率为89.5±3.51%,粒径分析发现脂质立方液晶纳米粒包封GLP后,GLPC的粒径发生了轻微的增大,小角X散射实验SAXS（small-angle x-ray scattering,SAXS）结果显示GLPC晶型为Pn3m。试验表明采用乙醇分散法制备灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒质量较好。试验Ⅶ 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用为了探讨灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒作为PCV-2疫苗免疫增强剂的免疫增强作用,本试验分别将灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒、灵芝多糖和空白脂质立方液晶纳米粒作为PCV-2的免疫增强剂,免疫小鼠,在一免后7、14和21天,采用ELISA法测定血清中特异性IgG水平及抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α的浓度;在一免后24h和48h,采集淋巴结,采用流式细胞仪测定了淋巴结中DCs的成熟状态;在一免后7天,分别采用免疫组化法和流式细胞仪检测了淋巴结中抗原的含量和中央记忆T细胞和效应记忆T细胞的比例。结果显示,GLPC不仅能显着提高血清中PCV-2特异性IgG的水平和抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的浓度,而且能够显着地促进血清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-17和TNF-α的分泌;同时,结果显示GLPC能够促进淋巴结中DCs的成熟,提高抗原从皮下到淋巴结的转运效率和中央记忆细胞与效应记忆细胞的比例,与GLP相比效果更好。试验表明GLPC能够显着地促进淋巴结中DCs的成熟和记忆T细胞的产生,从而提高机体对PCV-2产生更强的体液免疫和细胞免疫应答。试验Ⅷ修饰后灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对小鼠免疫OVA的免疫增强作用为了将OVA吸附到灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的表面并研究其佐剂作用机理,本试验首先将两种阳离子修饰物十六烷基三甲基溴化按（cetyltrimeth-ylammonium bromide,CTAB）和聚二烯丙基二甲基氯化铵(Poly（diallyldimethylammo-nium chloride,PDDAC）分别修饰到GLPC的表面,制备成阳离子脂质立方液晶纳米粒。然后,将阳离子脂质立方液晶纳米粒作为OVA免疫增强剂,免疫小鼠,以GLPC为对照。在首免后24h和48h,收集小鼠淋巴结,采用流式细胞仪检测淋巴结中树突状细胞表面分子的表达;在三免后14天,分别采用MTT法和流式细胞仪检测并计算脾脏淋巴细胞增殖指数和淋巴细胞分化;在三免后14和28天,收集小鼠血清,采用ELISA法测定特异性IgG、IgG1、IgG2a以及细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-4、IL-6的浓度。在三免后28天,采用转录组测序技术检测小鼠脾脏基因表达变化。结果显示,经过PDDAC 修饰的脂质立方液晶（PDDAC modified GLPC,PDDAC-GLPC）作为 OVA免疫增强剂同GLPC相比,不仅能有效地促进机体产生OVA特异性IgG,提高细胞因子的分泌和刺激脾脏CD4+和CD8+T细胞增殖,而且能明显地促进小鼠淋巴结内树突状细胞的成熟,效果好于GLPC。CTAB修饰的脂质立方液晶（CTAB modified GLPC,CTAB-GLPC）作为OVA免疫增强剂,除了在提高特异性IgG的效果与GLPC相比差异不显着外,其他方面效果均好于GLPC组。进一步经过对脾脏基因测序发现PDDAC-GLPC的免疫增强作用主要通过NOD样受体通路、PI3K-ATK信号通路、细胞因子互作和白细胞跨内皮迁移作用激活脾脏的免疫反应。试验表明PDDAC-GLPC能显着地促进淋巴结DCs的成熟和脾脏中4条信号通路的活化,从而促进机体产生更强的体液免疫和细胞免疫应答。
张卫云[7]（2018）在《献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析》文中研究指明背景和目的慢性乙型病毒性肝炎（CHB）的发生及发展机制与乙肝病毒变异、宿主的免疫状态、宿主性别、年龄、遗传基因和肝脏内炎症活动密切相关。然而,隐匿性HBV感染（OBI）在病毒学特征、合并感染、宿主免疫应答以及表观遗传学等方面尚未阐述清楚,特别是感染宿主的分子与细胞免疫功能少有报道。本研究目的为探讨献血人群的隐匿性HBV感染状态,揭示OBI携带者HBV特异性分子细胞免疫反应特征与OBI发生的作用机制。研究对象2016年8月至2017年12月广州血液中心无偿献血者人群。建立的研究队列包括:OBI 组 37 例,CHB 组 53 例（含 CHB-HBeAg-组 42 例,CHB-HBeAg+组 11例）,HBV感染康复组47例,HBV非感染组56例（含疫苗免疫组33例,正常对照组23例）,合计193例。方法采用化学发光法对研究队列血浆样品进行乙肝表面抗原（HBsAg）检测,核酸检测法（NAT）检测HBVDNA,qPCR定量检测病毒载量,巢式PCR进行病毒基因扩增并测定其核苷酸序列。采用HBV Core和HBV Pol多肽库特异性刺激物,体外刺激研究人群外周血单个核细胞（PBMCs）,采用T细胞增殖试验（CFSE）检测T细胞增殖情况,酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ的频数,细胞内细胞因子染色（ICS）检测 IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数及细胞来源,流式微球试验（CBA）检测PBMCs分泌细胞因子的总体水平。采用SPSS 20.0统计分析软件,正态分布的计量资料采用两独立样本t检验,多组间比较采用One-Way ANOVA分析;非正态资料组间比较采用Mann-Whitney U检验,各组间比较采用Mann-Whitney U检验;相关性检验采用Spearman’s相关分析;P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.OBI献血者人群特征。研究发现HBcAb阳性的献血者人群OBI发生率较高,特别是在单独HBcAb 阳性者更高;OBI发生率随年龄增长而增高,男性高于女性;OBI毒株基因型以B型为主。2.T细胞增殖特征。采用CFSE方法,在非特异性刺激物PHA刺激下,以CD8+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异不显着（P=0.403）,但OBI组和CHB组的增殖率低于正常对照组（74.0%,78.1%vs.82.1%）;在特异性刺激物HBV Core和Pol多肽库刺激下,以CD4+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异显着（P<0.001）,其中OBI组和CHB组的增殖率显着高于正常对照组（3.0%,3.3%vs.1.7%）,差异显着（3.0%vs.1.7%,P=0.016;3.3%vs.1.7%,P<0.001）。3.特异性IFN-γ分泌T细胞频数测定。采用ELISPOT检测方法,在PHA刺激下,OBI组和CHB组特异性T细胞的免疫应答高于其他三组,差异显着（P=0.004）。在三种重组蛋白（HBcAg,HBsAg-ayw,HBsAg-adw）和多肽库的刺激下,总体比较六组研究对象特异性T细胞应答强度,结果差异显着（P<0.05）。OBI组（160 SFC/106 PBMCs）对HBcAg重组蛋白刺激的应答强度高于正常对照组（95 SFC/106 PBMCs）,低于CHB-HBeAg-组（208 SFC/106 PBMCs）。在HBV Core和Pol多肽库刺激下,OBI组（25 SFC/106 PBMCs）和CHB-HBeAg-组（25 SFC/106 PBMCs）的应答强度均高于正常对照组（5 SFC/106 PBMCs）。比较两种多肽刺激下的总体阳性反应率,HBV Core多肽库显着高于HBV Pol多肽库（44.6%vs.16.1%）,HBV Core多肽库刺激下的T细胞ELISPOT阳性反应率以OBI组（64.0%）最高,其次是HBV感染康复组（53.2%）,显着高于正常对照组（21.7%）。4.胞内细胞因子T细胞频数及胞外分泌型细胞因子水平测定。ICS检测结果显示,在PMA刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在OBI组和CHB组中均高于正常对照组（P<0.05）,而分泌IL-17A和IL-21的T细胞频数在OBI组均低于CHB组（P<0.05）。在HBV Core多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在HBV感染康复组中高于OBI组和正常对照组（P<0.05）;而分泌IL-2和IL-10的T细胞频数在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。在HBV Pol多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21的CD4+和CD8+T细胞频数在CHB组显着低于其他组（P<0.05）,而分泌IL-10和TGF-β的CD4+T细胞频数在OBI组显着低于其他组（P<0.05）。胞外分泌型细胞因子水平CBA检测结果显示,在HBV Core多肽刺激下,IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）;在HBVPol多肽刺激下,IFN-γ、IL-2和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。ICS与CBA实验检测细胞内、外因子结果基本一致。5.MDSCs水平测定。根据细胞亚群计数显示,OBI携带者外周血中M-MDSCs水平显着低于CHB患者（P<0.001）,而与正常对照组差异不显着（P=0.860）;G-MDSCs水平在五组人群中无差别（P=0.914）。OBI携带者和CHB患者外周血中 M-MDSCs 和 G-MDSCs 水平与 ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、ALB、ADA、CHE、γ-GT和TP等肝功能指标无相关性（P>0.05）。结论OBI携带者和CHB患者均呈现显着高于HBV感染康复者及非感染者的HBV特异性T淋巴细胞增殖反应;OBI携带者与HBV感染康复者及CHB患者均呈现显着的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数增高,以OBI组阳性反应率最高,HBV感染康复组和CHB-HBeAg-组次之,CHB-HBeAg+组最低;HBV感染康复组特异性分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21细胞因子的CD4+和CD8+效应T细胞频数显着增高,而OBI组和CHB组分泌IL-10细胞因子的抑制T细胞频数增高,CHB组效应T细胞频数较低而OBI组分泌IL-2和IL-17A的T细胞频数相对升高;CHB组分泌IL-10细胞因子水平增高,而OBI组分泌IL-17A细胞因子水平相对较高。因此,OBI携带者的HBV特异性T效应细胞反应水平居于HBV感染康复者与CHB患者之间,而CHB患者T抑制细胞反应水平较高,从而导致了三组HBV感染者的不同转归状态。创新之处1.献血者人群通常为未经抗病毒等治疗的健康人群。本论文以HBV感染不同转归状态的献血者为研究对象,排除了抗病毒治疗等干扰;采用新鲜分离的PBMCs进行实验,避免了淋巴细胞由于冻存和复融发生死亡和免疫功能的改变对结果的影响。2.与以往研究选用HBV重叠多肽不同,本研究合成的HBV Core和HBV Pol多肽是经研究证实能刺HBV产生特异性细胞免疫应答的HLA-Ⅰ型和HLA-Ⅱ型限制性多肽,结果更能反应HBV感染后不同转归人群对T淋巴细胞免疫应答状态。3.本研究根据HBV感染献血者不同转归状态,分析了 T细胞亚群分泌的七种特异性细胞因子的频数及分泌型细胞因子的水平,阐明了 OBI携带者、CHB患者及HBV感染康复者的三种转归状态的分子细胞免疫基础。
张雷[8]（2018）在《肿瘤坏死因子α诱导蛋白8对脓毒症小鼠CD4+CD25+调节性T细胞免疫功能的影响及其机制》文中研究表明研究背景和目的:肿瘤坏死因子α诱导蛋白8（TNFAIP8）是近年肿瘤研究中发现的一种新蛋白,隶属TNFAIP8家族,在多种肿瘤组织中过表达,可能参与肿瘤发生及细胞存活/死亡过程。TNFAIP8在免疫器官/细胞,如脾脏、胸腺及T细胞中表达,但其是否参与特定T亚群——CD4+CD25+调节性T细胞的功能调节,继而影响脓毒症疾病进程,迄今尚不清楚。本研究旨在探讨TNFAIP8在CD4+CD25+Treg中的表达及功能,并分析其可能的调节机制。实验方法:分离正常小鼠脾脏CD4+CD25+Treg,利用蛋白印迹及逆转录-聚合酶链式反应技术检测TNFAIP8在Treg中的表达水平。体外实验以TNFAIP8干扰/过表达慢病毒转染Treg,利用LPS刺激模拟脓毒症环境;体内实验时,小鼠尾静脉注射干扰/过表达慢病毒后饲育2周,进行CLP建模。Treg细胞标志性分子CTLA-4和Foxp3的表达采用流式细胞术检测;CCK-8法检测Treg对T细胞的增殖抑制效应;Annexin V法检测Treg凋亡率;Treg细胞转化生长因子（TGF）-β、白介素（IL）-10,Treg/T细胞共培养体系细胞因子水平,T细胞中活化蛋白1（AP-1）及活化T细胞核因子（NF-AT）等均采用ELISA法检测。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路活化水平亦采用蛋白印迹法检测。统计学方法:定量数据以x±s标示并录入SPSS23.0分析,采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较多 组总体差异,组间比较采用 LSD-t 检验,P<0.05 时存在统计学显着性差异。研究结果与结论:1.Treg中存在TNFAIP8蛋白和基因水平表达。2.体外实验中,与正常脾脏Treg相比较,转染TNFAIP8-siRNA干扰慢病毒Treg细胞CTLA-4、Foxp3表达显着降低,IL-10、TGF-β分泌量明显减少;Treg凋亡率显着增高,其对T细胞的增殖抑制效应也明显减弱,T细胞IL-2分泌量明显增加,AP-1和NF-AT活性显着增强,Th细胞向Th 1方向极化。而转染TNFAIP8-RNA过表达慢病毒Treg细胞CTLA-4、Foxp3表达显着上调,IL-10、TGF-β分泌量明显增加;而Treg凋亡率显着下降,其对T细胞增殖抑制也明显增强,T细胞IL-2分泌量明显减少,AP-1和NF-AT活性显着减低,Th细胞向Th2方向极化。3.体内实验中,与野生型CLP小鼠相比,TNFAIP8-siRNA-CLP 小鼠脾脏 Treg 中 CTLA-4、Foxp3 表达及 IL-10、TGF-β分泌均明显减低,细胞凋亡率升高,其对T细胞增殖抑制也明显减弱,T细胞IL-2分泌和AP-1、NF-AT活性提高,Th细胞向Th1方向分化;而TNFAIP8-RNA-CLP小鼠Treg相应指标也表现出与体外实验相似的变化趋势。4.与正常Treg相比,转染TNFAIP8-siRNA/TNFAIP8-RNA的Treg中p-JNK表达明显升高/减低,p-ERK及p-p38表达各组间无显着差异。综上,TNFAIP8可能通过JNK信号通路影响脓毒症小鼠Treg细胞的免疫抑制效应。
谢宁[9]（2018）在《CAR-T细胞治疗复发难治弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效分析》文中进行了进一步梳理背景多年以来,恶性肿瘤的基本治疗方法包括手术、化疗和放疗,以及近年来针对肿瘤干细胞的靶向药物治疗。尽管这些治疗方案有助于改进患者的疗效,但大多数恶性肿瘤患者的预后仍然很差。随着生物基因工程技术的发展,科研人员通过基因工程技术研发出了嵌合型抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）T细胞,通过细胞免疫治疗的方式来杀伤肿瘤细胞。作为新的治疗恶性肿瘤的新模式,CAR-T细胞能够识别并结合相应肿瘤细胞表面抗原,活化T细胞,进一步刺激T细胞分泌细胞因子,从而杀伤肿瘤细胞。目前,临床应用携带CD19抗原的CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤已取得突破性进展,国内外多个临床试验研究结果均表明CD19 CAR-T细胞对血液系统肿瘤具有显着疗效,尤其治疗急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）的完全缓解率（CR）能够达到70%-94%,对患者的生存率和生活状态都有明显的改善。应用CD19 CAR-T细胞治疗B细胞淋巴瘤的临床研究结果显示,B细胞淋巴瘤的缓解率能达到35%-52%。但长期观察后发现,用CD19 CAR-T细胞治疗B-ALL或者B细胞淋巴瘤的患者,均能够观察到疾病复发的病例,许多研究文献中也分析了可能导致复发的因素,例如由于肿瘤细胞表面CD19抗原阴性而导致免疫逃逸等。并由此引发了科研人员开发其他肿瘤表面抗原的热潮,希望能够从中找到能够作为靶向抗原的类型,从而联合多个靶向抗原共同作用于肿瘤细胞,减少免疫逃逸的发生。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是常见的血液系统恶性肿瘤类型,现阶段针对DLBCL的临床治疗方案包括化疗、放疗及与美罗华等分子靶向药物联合的化疗。虽然靶向药物的应用能够提高疾病的缓解率,但作为恶性肿瘤,淋巴瘤的复发仍然不能避免。随着基因工程技术的发展,人类采用细胞免疫的方法来杀灭肿瘤细胞成为可能。DLBCL的肿瘤细胞表面表达CD19抗原,应用CD19CAR-T细胞治疗DLBCL的研究结果均显示治疗有效。但其疗效明显低于治疗B-ALL的疗效,并且,也同样无法避免疾病复发的发生。CAR-T细胞的治疗过程中,通过活化T细胞功能,分泌IFN-γ细胞因子杀伤肿瘤细胞,同时还能够刺激单核细胞分泌多种细胞炎性因子,比如,TNF-α、IL-6、IL-10等调节免疫应答。但是多项研究均证实恶性淋巴瘤细胞自身具备分泌多种细胞因子的能力,并且,研究结果证实IL-10在恶性淋巴瘤患者体内的含量增高,且其含量高低与淋巴瘤的预后及疾病复发相关。研究结果显示,在应用CD19 CAR-T细胞治疗后,患者体内多种细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10）的含量水平均会发生变化,治疗后期对细胞因子水平的监测结果,尤其是IL-10的含量变化能否反应出与疾病复发相关,能够为CAR-T细胞治疗后疾病的预后起到提示作用。目的本研究分为两部分,第一部分,转染CD19 CAR基因的病毒至人外周血T淋巴细胞,制备CD19 CAR-T细胞,鉴定CAR-T细胞的质量并检测CAR-T细胞的体外杀伤活性。第二部分,将CD19 CAR-T细胞回输到复发难治的DLBCL患者体内,评估疗效,并观察治疗后患者体内细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10）含量水平的变化,并分析IL-10的含量变化能否提示DLBCL疾病的复发。方法第一部分,制备CD19 CAR基因载体,感染复发难治DLBCL患者外周血T淋巴细胞,制备CD19 CAR-T细胞。观察该细胞的形态,检测转染的情况,并评价转染细胞的体外杀伤效应。第二部分,用CD19 CAR-T细胞回输治疗11例复发难治DLBCL患者,评估疗效,分析患者IL-10的水平变化与DLBCL疾病的复发的相关性。结果CD19 CAR-T细胞镜下观察细胞形态良好,生长旺盛,流式细胞仪检测结果提示CD19 CAR-T细胞符合治疗及试验用需求,且其体外杀伤靶细胞的能力随着细胞数增多而增强,两者具有正相关性,且杀伤能力明显强于无CAR结构的293T细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。用CD19 CAR-T细胞治疗11例复发难治性DLBCL患者,经疗效评估CR率为50%,总缓解率为60%,患者未出现由于输注CAR-T细胞引起的不良反应。外周血CAR基因拷贝数的变化趋势与细胞因子含量的变化趋势大致相同。CD19 CAR-T细胞的疗效与回输剂量无关（P=0.08）,与是否有骨髓侵犯无关（P=0.487）。2例患者在治疗后3个月左右复发,这2例复发患者外周血中CAR基因含量水平均逐步降低至消失,其余未复发患者外周血中CAR基因含量虽然存在波动性变化,但仍维持在较高水平。这提示了是否复发与外周血中CAR基因的存在时间相关。在2例复发患者中还观察到其外周血中CAR基因含量水平下降的同时,细胞因子IL-10的水平反向增高,随着获得CR后患者外周血CAR基因拷贝数不断减少,复发患者体内IL-10含量变化趋势与无复发患者体内IL-10含量变化趋势相反,差异有统计学意义（P=0.009）。结论1.CD19 CAR-T细胞质量符合试验需求,且体外杀伤淋巴瘤细胞能力强。2.CD19 CAR-T细胞治疗复发难治性DLBCL患者有效,28天CR率50%。总缓解率（ORR）60%。治疗过程无不良事件发生。3.CD19 CAR-T细胞的疗效与回输剂量无关,与是否有骨髓侵犯无关。4.疾病复发与外周血CAR基因存在时间相关,当外周血中CAR基因拷贝数减少时,外周血IL-10水平增多,与疾病复发相关。
朱会芳[10]（2017）在《TGFβ3-Smads/Spl-DcR3信号通路轴介导肝细胞癌免疫逃逸》文中研究表明肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前世界上致死率最高的恶性肿瘤之一,也是我国发病率和死亡率位居前列的肿瘤之一,手术、化疗和放疗等方法仍是目前治疗肝癌的主要手段,但是其治疗效果并不十分理想。因此,探索肝癌发生的分子调控机制以及在此基础上寻求肝癌治疗的新策略有着极为重要的意义。DcR3（decoy receptor 3,诱骗受体3,又称TR6）,是近年发现的一种新的肿瘤坏死因子受体超家族成员之一,是由271个氨基酸残基所组成,因其组成的氨基酸序列中缺少跨膜结构域,所以DcR3是一种分泌型的细胞因子。研究显示肿瘤组织中高表达的DcR3可以通过多种方式诱导肿瘤细胞逃避免疫细胞的识别和杀伤,从而促进肿瘤的发生、转移和免疫逃逸。但是DcR3在肝癌组织中高表达的分子调控机制以及肝癌免疫逃逸中的作用及机制尚未完全阐明。因此,在本课题中,我们应用细胞因子芯片、免疫荧光和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）技术证实肝癌组织中细胞因子TGFβ3和DcR3的表达明显高于癌旁正常肝组织;利用Real time PCR、western blotting和IHC技术检测肝癌新鲜标本和石蜡标本中DcR3的表达情况,发现肝癌组织DcR3的表达上调,与肝癌患者的HbsAg感染和肝硬化有关,与肝癌的分化程度、是否转移和患者的不良预后相关;然后利用免疫共沉淀、染色质共沉淀技术和双荧光素酶报告实验证明了细胞因子TGFβ3通过Smads-Sp1信号通路调控了肝癌细胞中DcR3的表达上调;其次,我们通过构建稳定高表达和敲低DcR3的肝癌细胞株,应用体内外实验证明:肝癌细胞中高表达的DcR3促进了肝癌细胞的增殖和迁移,并抑制了 CD4+T淋巴细胞的分化和分泌功能;最后,我们建立肝癌细胞和CD4+T淋巴细胞共培养体系,利用流式细胞术、免疫荧光共聚焦技术和酶联免疫吸附实验,并结合细胞因子芯片结果初步证明:肝癌细胞上调的DcR3通过与CD4+T淋巴细胞中的配体LIGHT竞争性结合而抑制了 CD4+T细胞的免疫调控功能。综上所述,本文深入探讨了肝癌细胞中DcR3高表达的分子机制,证实了TGFβ3-Smads/Sp1信号通路调控DcR3的表达;肝癌细胞通过高表达DcR3促进肝癌细胞的增殖和迁移;同时,肝癌细胞中高表达的DcR3通过与CD4+T淋巴细胞中的配体LIGHT竞争性结合而抑制了 CD4+T细胞的免疫调控功能。因此,本文探讨了 TGFβ3-Smads/Sp1-DcR3信号通路轴介导肝细胞癌免疫逃逸的初步机制,为寻求肝癌免疫治疗的新策略提供了理论基础。
二、IL-2基因转导CD_3AK细胞免疫学功能的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IL-2基因转导CD_3AK细胞免疫学功能的研究（论文提纲范文）
（1）矢车菊素-3-0-葡萄糖苷对类风湿性关节炎治疗作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（3）CD103+ CD8+组织定居T细胞在食管鳞癌中的免疫学特性和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写一览表 |
| 前言 |
| 第一章 TCGA数据分析食管鳞癌(ESCC)CD8A和ITGAE(CD103)基因的表达 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TCGA数据分析ITGAE(CD103)和CDBA基因在ESGG中的表达情况 |
| 3.2 ITGAE基因和免疫检查点及细胞毒性分子相关基因的关系 |
| 3.3 ITGAE基因和CD8A基因表达与临床病理特征的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 初治食管鳞癌新鲜标本CD103~+CD8~+TRM细胞的浸润比例 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 初治ESCC患者的临床病理特征 |
| 3.2 CD103~+ TRM细胞在ESGC新鲜标本中的浸润比例 |
| 3.3 CD103~+CD8~+TRM细胞PD-1和TIM3的表达 |
| 3.4 癌组织CD103~-T细胞及CD103~+T细胞PD-1和TIM3的表达 |
| 3.5 癌旁组织和癌组织CD103~+T细胞其他的表型特征 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 新辅助化疗后食管鳞癌CD103~+CD8~+TRM细胞的浸润比例 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 新辅助化疗ESCC患者的临床病理特征 |
| 3.2 新辅助化疗后ESCC新鲜标本CD103~+TRM细胞的浸润比例 |
| 3.3 CD103~+CD8~+TRM细胞PD-1和TIM3的表达 |
| 3.4 新辅助化疗后ESCC癌组织CD103~-T细胞和CD103~+T细胞PD-1和TIM3的表达 |
| 3.5 CD103~+CD8~+TRM细胞浸润比例和PD-1分子表达在新辅助化疗后和初治患者癌组织中的差异 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 CD103~+CD8~+TRM细胞与食管鳞癌患者的生存预后分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ESCC患者的临床病理特征 |
| 3.2 CD8~+和CD103~+在ESCC组织蜡块中的表达 |
| 3.3 Cox比例风险回归模型 |
| 3.4 CD8~+和CD103~+的表达和ESCC患者的生存率分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 CD103~+CD8~+TRM细胞的免疫学功能及靶向PD-1的干预研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 新鲜ESCC标本CD103~+TRM细胞Ki67的表达 |
| 3.2 新鲜癌组织CD103~+TRM细胞IFN-γ、CD107a和IL-2的分泌 |
| 3.3 anti-PD-1抗体阻断对CD103~+TRM细胞IFN-γ、CD107a和IL-2分泌的影响 |
| 3.4 4-NQO成功诱导食管癌小鼠 |
| 3.5 anti-PD-1抗体治疗后,小鼠食管肿瘤灶数目变化情况 |
| 3.6 anti-PD-1抗体治疗后,小鼠食管组织淋巴细胞浸润情况 |
| 3.7 anti-PD-1抗体治疗后,小鼠食管淋巴细胞IFN-γ分泌情况 |
| 3.8 anti-PD-1抗体治疗后,小鼠脾脏淋巴细胞数量及IFN-γ分泌情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第六章 转录组测序分析CD103~+CD8~+T细胞和CD103~-CD8~+T细胞的差异表达基因 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 分选得到纯度高的脾脏淋巴细胞 |
| 3.2 样品检测结果 |
| 3.3 差异表达基因的筛选 |
| 3.4 差异表达基因聚类分析 |
| 3.5 GO富集分析 |
| 3.6 差异表达基因KEGG富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 CD103~+ CD8~+组织定居记忆T细胞在肿瘤免疫中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（4）激活素A调控小鼠NK细胞活性作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 激活素A |
| 1.1.1 激活素A及其经典信号传导 |
| 1.1.2 激活素的免疫调节作用 |
| 1.2 NK细胞 |
| 1.2.1 NK细胞的分化发育 |
| 1.2.2 NK细胞的功能 |
| 1.2.3 NK细胞的异质性 |
| 1.2.4 NK细胞与疾病 |
| 1.3 IL-9 |
| 1.4 主要研究内容和意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验常用仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 磁珠分选NK细胞 |
| 2.3.2 细胞因子细胞内染色 |
| 2.3.3 流式细胞术检测细胞表面分子CD25 及CD11b |
| 2.3.4 流式细胞术检测Activin A |
| 2.3.5 流式细胞术检测细胞内Arg1 及i NOS |
| 2.3.6 免疫双荧光染色 |
| 2.3.7 RT-PCR |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.3.9 NK细胞粘附实验 |
| 2.3.10 NK细胞杀伤实验 |
| 2.3.11 NK细胞增殖实验 |
| 2.3.12 ELISA |
| 2.3.13 Smad3 基因敲低实验 |
| 2.3.14 NS-1 荷瘤鼠实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 小鼠NK细胞分泌Activin A |
| 3.1.1 NK细胞表达Activin βA m RNA及蛋白 |
| 3.1.2 IL-2 促进NK细胞分泌Activin A |
| 3.2 激活素受体在小鼠NK细胞表达 |
| 3.3 Activin A对NK细胞活性的影响 |
| 3.3.1 Activin A对小鼠NK细胞IFNγ、IL-2 及IL-10 产生的影响 |
| 3.3.2 Activin A对小鼠NK细胞增殖的影响 |
| 3.3.3 Activin A对小鼠NK细胞杀伤活性的影响 |
| 3.3.4 Activin A促进小鼠NK细胞粘附 |
| 3.4 Activin A对NK细胞IL-9 产生的调控作用 |
| 3.4.1 小鼠T细胞及NK细胞表达IL-9 |
| 3.4.2 Activin A对小鼠NK细胞IL-9 产生的抑制作用 |
| 3.4.3 FST抑制Activin A对NK细胞IL-9 产生的调控作用 |
| 3.4.4 Activin A促进小鼠NK细胞Smad3 磷酸化 |
| 3.4.5 Smad3 敲低减弱Activin A抑制NK细胞IL-9 释放作用 |
| 3.5 ⅡA~(high)和ⅡA~(low)NK细胞亚群特征 |
| 3.5.1 Act RIIA高表达和低表达小鼠NK细胞的鉴定 |
| 3.5.2 IIA高表达和低表达小鼠NK细胞的形态学差异 |
| 3.5.3 ⅡA~(high)细胞和ⅡA~(low)NK细胞表达功能分子的差异 |
| 3.5.4 ⅡA~(high)细胞和ⅡA~(low)NK细胞亚群产生细胞因子的差异 |
| 3.5.5 ⅡA~(high)细胞和ⅡA~(low)NK细胞亚群杀伤功能比较 |
| 3.5.6 ⅡA~(high)细胞和ⅡA~(low)NK细胞亚群增殖能力比较 |
| 3.5.7 ⅡA~(high)细胞和ⅡA~(low)NK细胞亚群粘附能力比较 |
| 3.6 Activin A增加NS-1 细胞移植瘤内IIA~(high)NK细胞比率 |
| 3.6.1 Activin A对NS-1 移植瘤生长的影响 |
| 3.6.2 肿瘤组织ⅡA~(high)和ⅡA~(low)NK细胞亚群比率 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 一例RAC2基因自发突变患儿临床研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（6）灵芝多糖脂质体和脂质立方液晶纳米粒免疫增强作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 疫苗佐剂 |
| 1.1 佐剂在疫苗中的作用 |
| 1.2 疫苗的免疫应答 |
| 1.3 佐剂的免疫应答 |
| 2 纳米粒作为疫苗或药物递送系统的研究 |
| 2.1 脂质体 |
| 2.2 脂质立方液晶纳米粒 |
| 2.3 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 |
| 2.4 聚谷氨酸 |
| 3 中药多糖的免疫调节作用 |
| 3.1 中药多糖对免疫器官的影响 |
| 3.2 中药多糖对免疫细胞的影响 |
| 3.3 中药多糖对细胞因子的影响 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 灵芝多糖脂质体的制备及制备条件的优化 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 灵芝多糖脂质体的制备 |
| 2.2 灵芝多糖脂质体包封率的测定 |
| 2.3 灵芝多糖脂质体制备工艺的优化 |
| 2.4 灵芝多糖脂质体粒径的测定和形态观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 单因素试验结果 |
| 3.2 BBD试验设计及分析 |
| 3.3 响应面结果分析 |
| 3.4 GLPL粒径以及电镜下的形态 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 灵芝多糖脂质体对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和分化的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠脾脏淋巴细胞增殖的测定 |
| 2.2 脾脏淋巴细胞分化的检测 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 药物单独刺激脾脏淋巴细胞增殖的变化 |
| 3.2 药物协同LPS刺激脾B淋巴细胞增殖的变化 |
| 3.3 药物协同PHA刺激脾T淋巴细胞增殖的变化 |
| 3.4 对小鼠脾脏淋巴细胞分化的作用 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 灵芝多糖脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导、分离与培养 |
| 2.2 腹腔巨噬细胞活性检测 |
| 2.3 腹腔巨噬细胞吞噬能力测定 |
| 2.4 腹腔巨噬细胞表面分子MHCⅡ表达的测定 |
| 2.5 NO含量以及iNOS活性的测定 |
| 2.6 细胞因子含量测定 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 灵芝多糖脂质体对腹腔巨噬细胞活性的影响 |
| 3.2 灵芝多糖脂质体对腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响 |
| 3.3 GLPL对巨噬细胞表面表达分子MHCⅡ表达的影响 |
| 3.4 GLPL对细胞因子水平的影响 |
| 3.5 GLPL对巨噬细胞NO产量的影响 |
| 3.6 GLPL对巨噬细胞iNOS活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 灵芝多糖脂质体对OVA免疫小鼠的免疫增强作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 粒径稳定性的测定 |
| 2.2 抗原包封率稳定性检测 |
| 2.3 动物分组及免疫程序 |
| 2.4 淋巴结中树突状细胞(DCs)表面分子的测定 |
| 2.5 淋巴细胞增殖的测定 |
| 2.6 小鼠脾脏T淋巴细胞分化的测定 |
| 2.7 血清中OVA特异性抗体及抗体亚型的测定 |
| 2.8 细胞因子的测定 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 OVA包封率的变化 |
| 3.2 粒径及PDI的变化 |
| 3.3 淋巴结中DCs的成熟 |
| 3.4 脾脏淋巴细胞增殖的变化 |
| 3.5 小鼠脾脏淋巴细胞的分化 |
| 3.6 OVA特异性IgG及其亚型的变化 |
| 3.7 细胞因子水平的变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 灵芝多糖脂质体对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 疫苗配制 |
| 2.2 动物分组及处理 |
| 2.3 ELISA法测定PCV-2特异性IgG的浓度 |
| 2.4 ELISA法测定IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的浓度 |
| 2.5 血清细胞因子含量测定 |
| 2.6 脾脏组织学分析 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 GLPL对血清中PCV-2特异性IgG及抗体亚型含量的影响 |
| 3.2 GLPL对血清中IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α含量的影响 |
| 3.3 脾脏组织学变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备方法优选及质量评价 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备 |
| 2.2 乙醇分散法中分散介质的优化 |
| 2.3 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒包封率的测定 |
| 2.4 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒粒径和Zeta电位的测定 |
| 2.5 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的形态观察 |
| 2.6 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒小角X散射测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 两种制备方法对GLPC包封率的影响 |
| 3.2 乙醇分散法中不同分散介质对GLPC包封率和稳定性的影响 |
| 3.3 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒粒径及Zeta电势 |
| 3.4 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒表面形态 |
| 3.5 GLPC小角X散射分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对PCV-2苗免疫小鼠的免疫增强作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 疫苗制备 |
| 2.2 动物分组及处理 |
| 2.3 血清中PCV-2特异性IgG含量的测定 |
| 2.4 血清中IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3浓度的测定 |
| 2.5 血清中细胞因子的测定 |
| 2.6 淋巴结中记忆T细胞反应的检测 |
| 2.7 检测淋巴结中抗原含量的检测 |
| 2.8 淋巴结中树突状细胞（DCs)表面分子的测定 |
| 2.9 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清中PCV-2特异性抗体和抗体亚型的变化 |
| 3.2 GLPC对血清中IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-12p70和TNF-α含量的影响 |
| 3.3 淋巴结中抗原量变化 |
| 3.4 淋巴结中DCs的成熟 |
| 3.5 淋巴结中记忆T细胞的变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 修饰后灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒对OVA免疫小鼠的免疫增强作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 两种阳离子修饰灵芝多糖脂质立方液晶纳米粒的制备及质量评价 |
| 2.2 两种修饰脂质立方液晶纳米粒对小鼠免疫OVA的免疫增强作用 |
| 2.3 脾脏组织转录组测序分析 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同修饰脂质立方液晶纳米粒的粒径、电势、OVA吸附率及SAXS分析 |
| 3.2 两种修饰脂质立方液晶纳米粒对小鼠免疫应答的影响 |
| 3.3 小鼠脾脏基因表达情况 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 攻读博士学位期间发表和完成的论文 |
| 致谢 |
（7）献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 研究目的与意义 |
| 第一章 隐匿性乙型肝炎病毒感染的鉴定和分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 主要仪器和设备 |
| 1.2.3 主要试剂 |
| 1.2.4 主要溶液的配制 |
| 1.2.5 血清肝功能和HBV血清标志物检测 |
| 1.2.6 血浆HBV DNA提取 |
| 1.2.7 乙肝病毒载量的测定 |
| 1.2.8 BCP/PC、Whole genome、PreS/S片段的扩增 |
| 1.2.9 HBV野毒株全基因参照序列的获取 |
| 1.2.10 OBI样品基因分型 |
| 1.2.11 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 HBsAg-/DNA+人群的基本特征 |
| 1.3.2 HBsAg-/DNA+样品qPCR的检测 |
| 1.3.3 HBsAg-/DNA+样品Nested-PCR的检测 |
| 1.3.4 HBsAg-/DNA+样品的分类 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 隐匿性乙型肝炎病毒感染T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 外周血单个核细胞的提取 |
| 2.2.6 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 2.2.7 CFSE染色、细胞培养及流式细胞术检测 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 研究队列基本资料 |
| 2.3.2 PHA刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.3 HBV Core多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.4 HBV Pol多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PHA刺激下的非特异性免疫应答 |
| 2.4.2 HBV Core多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 2.4.3 HBV Pol多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 第三章 隐匿性乙型肝炎病毒感染特异性分子与细胞免疫反应特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.2.5 ELISPOT检测IFN-γ试验 |
| 3.2.6 ICS检测胞内细胞因子试验 |
| 3.2.7 CBA检测细胞培养液中细胞因子试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ELISPOT检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ |
| 3.3.2 ICS检测T细胞亚群的细胞分泌频数 |
| 3.3.3 CBA检测PBMCs分泌细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 HBV特异性T细胞应答反应 |
| 3.4.2 HBV特异性T细胞亚群分泌频数 |
| 3.4.3 HBV特异性T细胞分泌细胞因子水平 |
| 第四章 隐匿性乙型肝炎病毒感染与髓源抑制性细胞的关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 4.2.5 流式细胞术检测MDSCs |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 研究队列基本资料 |
| 4.3.2 外周血M-MDSCs和G-MDSCs的频数比例 |
| 4.3.3 M-MDSCs和G-MDSCs频数与肝功能指标的相关性 |
| 4.3.4 M-MDSCs和G-MDSCs频数与HBV DNA及HBsAg的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词语表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）肿瘤坏死因子α诱导蛋白8对脓毒症小鼠CD4+CD25+调节性T细胞免疫功能的影响及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 TNFAIPS对小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞免疫调节功能的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 脓毒症后TNFAIPS介导CD4~+CD25~+Treg免疫抑制功能及其机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 TNFAIPS介导cD4~+CD25~+Treg凋亡相关信号通路 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）CAR-T细胞治疗复发难治弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 CD19 CAR-T细胞的制备及质量检测 |
| 1.1 序言 |
| 1.2 材料试剂仪器 |
| 1.3 方法与步骤 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二章 CD19 CAR-T细胞治疗复发难治性DLBCL的有效性 |
| 2.1 序言 |
| 2.2 方法与步骤 |
| 2.3 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 CAR-T细胞—肿瘤治疗的新希望 |
| 参考文献 |
（10）TGFβ3-Smads/Spl-DcR3信号通路轴介导肝细胞癌免疫逃逸（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 DcR3在肝癌组织中表达水平的检测 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 第二章 DcR3表达上调的调控机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 第三章 DcR3对肝癌细胞生物学特性的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 第四章 DcR3对T淋巴细胞免疫调控作用的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 第五章 DcR3对T淋巴细胞免疫调控作用的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、IL-2基因转导CD_3AK细胞免疫学功能的研究（论文参考文献）
- [1]矢车菊素-3-0-葡萄糖苷对类风湿性关节炎治疗作用的研究[D]. 王洪星. 山东大学, 2020(04)
- [2]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [3]CD103+ CD8+组织定居T细胞在食管鳞癌中的免疫学特性和功能研究[D]. 韩露. 郑州大学, 2020(08)
- [4]激活素A调控小鼠NK细胞活性作用及其机制[D]. 麻春辉. 吉林大学, 2020(08)
- [5]WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究[D]. 张良. 重庆医科大学, 2020(01)
- [6]灵芝多糖脂质体和脂质立方液晶纳米粒免疫增强作用的研究[D]. 刘振广. 南京农业大学, 2018(07)
- [7]献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析[D]. 张卫云. 南方医科大学, 2018
- [8]肿瘤坏死因子α诱导蛋白8对脓毒症小鼠CD4+CD25+调节性T细胞免疫功能的影响及其机制[D]. 张雷. 中国人民解放军医学院, 2018
- [9]CAR-T细胞治疗复发难治弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效分析[D]. 谢宁. 郑州大学, 2018(07)
- [10]TGFβ3-Smads/Spl-DcR3信号通路轴介导肝细胞癌免疫逃逸[D]. 朱会芳. 南方医科大学, 2017(01)