一、FAP-1的表达与结肠癌抵抗Fas受体介导的细胞凋亡的关系（论文文献综述）
向磊[1]（2021）在《姜黄素对结肠癌细胞增殖、凋亡与转移的影响及机制研究》文中研究指明一、研究背景结肠癌（colorectal cancer,CRC）是临床上常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率位居各类肿瘤的前列,已严重影响到人们的生活质量。结肠癌临床治疗常采用的方式有手术切除、放疗、化疗、免疫疗法和分子靶向治疗等。手术切除主要适用于早期局限转移的肿瘤患者,如Ⅰ期结肠癌,Ⅱ、Ⅲ期结肠癌则采用手术与化疗结合治疗,而进展性晚期结肠癌治疗主要以化疗为主。可见在各阶段结肠癌的治疗中,化学药物治疗占有重要地位,已成为结肠癌的主体治疗方式。氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）、奥沙利铂（Oxaliplatin）和伊立替康（Irinotecan）是临床治疗结肠癌常用化疗药,其中5-FU作为结肠癌的基础药物,在过去40多年中一直是重要的化疗主体药物,是目前临床上应用最广的尿嘧啶类抗代谢药物,属于不典型的细胞周期特异性药,除了主要作用于S期细胞外,对处于细胞周期其它时相的细胞亦有作用。该药的疗效显着,抗癌谱较广。然而,5-FU会对患者产生的较强毒副作用以及难以逆转的耐药性。鉴于5-FU等结肠癌化疗药物都具有较强的毒副作用,影响了患者的生活质量,故很有必要研发疗效好、毒副作用低的抗癌新药或能够对传统化疗药物起到减毒增效作用的药物。因此,在我国传统中草药中分离筛选无毒或低毒的天然抗肿瘤有效成分具有重要意义。姜黄素（curcumin,CUR）是中药姜黄（Curcuma longa L.）根茎中提取出的一种多酚类化合物。现代研究发现姜黄素具有抗感染、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药理作用。已有的研究发现,CUR对体外培养的包括结肠癌在内的多种常见肿瘤细胞都有着显着的抑制作用,然而,关于姜黄素对结肠癌细胞生长抑制作用、诱导凋亡作用和迁移抑制作用的分子机制尚未完全揭示,有待于进行全面而深入的研究。二、研究目的本课题的研究目的是,在细胞水平和分子水平上全面研究CUR对结肠癌细胞的生长、增殖、迁移的抑制效应和凋亡诱导效应及其分子机理。了解CUR对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞增殖和凋亡的影响以及CUR对HCT-116细胞转移能力的影响;比较CUR与常用化疗药5-FU在抑制结肠癌细胞的生长、转移和诱导该细胞凋亡的作用效果;揭示CUR抑制结肠癌细胞生长、转移和诱导该细胞凋亡的分子机制,为CUR应用于结肠癌的临床治疗提供初步的实验依据。三、实验方法体外培养人结肠癌HCT-116细胞株、人结肠癌SW620细胞株至对数生长期,使用不同剂量的CUR和5-FU体外作用细胞后,再分别通过下列实验方法检测CUR和5-FU对结肠癌HCT-116细胞和结肠癌SW620细胞生长、凋亡与转移调控的相关实验指标。1.运用CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验检测CUR和5-FU对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞增殖能力的影响,探索CUR对这两种结肠癌细胞的半数抑制浓度（IC50）,并以此结果为依据,拟定后续实验分组所用浓度;2.运用CCK-8实验检测不同浓度CUR对结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞作用不同时间的增殖抑制效应,并统计计算CUR对结肠癌细胞的增殖抑制率;3.运用平板克隆实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞生长活力的影响,并统计实验结果,计算CUR对HCT-116细胞的生长活力抑制率;4.运用PI单染流式细胞术检测CUR对结肠癌HCT-116细胞周期的影响;5.运用AO/EB双染法观察CUR对结肠癌HCT-116细胞凋亡形态的影响,并统计观察结果,计算结肠癌细胞的凋亡率;6.运用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测CUR对结肠癌HCT-116细胞、SW620细胞凋亡的诱导效应,并计算结肠癌细胞的凋亡率;7.运用RT-qPCR实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞Fas、FADD、caspase-8、caspase-3 mRNA表达的影响,并计算其相对表达水平;8.运用Western blot实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞NF-κB、Fas、FADD、caspase-8、caspase-3蛋白表达的影响,并计算其相对表达水平;9.运用细胞划痕实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞的迁移能力的影响,并计算CUR对结肠癌细胞的迁移的抑制率;10.运用Transwell侵袭实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞侵袭能力的影响,并计算CUR对结肠癌细胞侵袭的抑制率;11.构建人工转移模型,检测CUR对结肠癌HCT-116细胞在小鼠肺中转移的抑制效应,并计算其转移抑制率;12.运用明胶酶谱实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞MMP-9表达的影响,并计算其相对表达水平;13.运用Western blot实验检测CUR对结肠癌HCT-116细胞E-cadherin、Claudin-3蛋白表达的影响,并计算其相对表达水平。四、结果1.CCK-8实验所得IC50检测结果表明,CUR体外作用结肠癌HCT-116细胞24 h的IC50为22μM,CUR体外作用结肠癌SW620细胞24 h的IC50为49μM。2.CCK-8实验结果显示,与对照组（Control）相比,不同浓度CUR和5-FU体外作用于结肠癌HCT-116细胞、SW620细胞24 h、36 h和48 h后,其生长和增殖能力被CUR显着抑制（*P<0.05）,且姜黄素对细胞生长与增殖抑制率随着浓度和时间的增加而升高,呈现剂量与时间依赖效应。此外,CUR高剂量组的增殖抑制率与5-FU组相比,无显着性差异（P>0.05）。3.平板克隆形成实验结果显示,不同浓度CUR和5-FU体外作用HCT-116细胞24 h后,与Control组相比,能显着抑制该细胞的生长分裂活性（*P<0.05）,且其抑制率随着浓度的增加而升高;此外,CUR高剂量组的克隆形成抑制率与5-FU组相比,无显着性差异（P>0.05）。4.基于PI单染的流式细胞术检测结果显示,与Control组比较,CUR能使HCT-116细胞显着地阻滞在细胞周期的S期（P>0.05）。5.凋亡形态学显微观察结果显示,不同浓度CUR体外作用于HCT-116细胞24 h后,与Control组相比,呈现早期凋亡和晚期凋亡形态的细胞比例增多,凋亡率均有显着性差异（*P<0.05）,且其凋亡率随着浓度的增加而升高;同时,高剂量CUR组细胞的凋亡率与5-FU组相比,无显着性差异（P>0.05）。6.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术实验结果显示,CUR体外作用于HCT-116和SW620细胞24 h和48 h后,与Control组对比,各实验组中发生凋亡细胞的比例显着增加,凋亡率均有显着性差异（*P<0.05）,且细胞凋亡率随药物浓度和作用时间的增加而升高;此外,高剂量CUR组细胞的凋亡率与5-FU组相比无显着性差异（P>0.05）。7.细胞划痕实验的结果显示,CUR体外作用于HCT-116细胞后,与Control组相比,各剂量CUR组能显着抑制划痕愈合,其愈合率均有显着性差异（*P<0.05）,且其愈合率随着浓度的增加而降低;此外,CUR高剂量组的愈合率与5-FU组相比无显着性差异（P>0.05）。8.Transwell实验的结果显示,CUR体外作用于HCT-116细胞后,与Control组相比,各剂量组CUR均能显着抑制肿瘤细胞穿越小室,其穿越抑制率均有显着性差异（*P<0.05）,且穿越抑制率随着浓度的增加而升高;但高剂量CUR组的抑制率与5-FU组相比无显着性差异（P>0.05）。9.人工转移模型实验的结果提示,CUR作用于HCT-116细胞后,与Control组相比,能显着抑制HCT-116细胞转移至小鼠肺中（*P<0.05）。10.明胶酶谱实验检测结果表明,CUR体外作用于HCT-116细胞后,与Control组相比,各实验组中HCT-116细胞MMP-9的表达水平显着降低（*P<0.05）,并且呈现出剂量依赖效应。11.RT-qPCR实验结果表明,CUR体外作用于HCT-116细胞24 h后,与Control组相比,显着增强了该细胞Fas、FADD、caspase-8、caspase-3等基因的m RNA的相对表达水平（*P<0.05）。12.Western blot实验结果显示,不同剂量CUR体外作用于HCT-116细胞24 h后,与Control组相比,显着升高了Fas、FADD、caspase-8、caspase-3、E-cadherin等蛋白的相对表达水平,显着抑制了NF-κB、Claudin-3蛋白的相对表达水平（*P<0.05）。五、结论1.姜黄素能显着抑制体外培养的结肠癌HCT-116和SW620细胞生长与增殖能力,呈现出剂量和时间依赖的特点,且姜黄素对于结肠癌细胞增殖的抑制作用能够达到5-FU作用的水平;2.姜黄素可将结肠癌HCT-116细胞阻滞在细胞增殖周期的S期,从而抑制该细胞的分裂增殖。3.姜黄素显着诱导结肠癌HCT-116细胞和SW620细胞发生凋亡,并呈现剂量依赖效应,且其诱导凋亡能力可达到5-FU作用的水平;4.姜黄素显着抑制结肠癌HCT-116细胞在体内和体外的转移能力,并呈现剂量依赖效应,且CUR的转移抑制能力可达到5-FU的作用水平;5.姜黄素诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡的潜在分子调控机制可能与激活Fas死亡受体通路信号有关;姜黄素抑制结肠癌HCT-116细胞转移的潜在分子机制可能与抑制EMT的发生有关;其共同的上游靶点可能受NF-κB的调控。
陈媛媛[2]（2021）在《长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制》文中研究说明一、背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球第三大最常见的癌症,尽管早期诊断和干预方面的技术进步已经有效改善了结直肠癌的总体生存率,但鉴于结直肠癌高复发率、高转移性及抗癌治疗的耐受性,晚期结直肠癌患者的预后仍然较差。术前放疗是晚期结直肠癌的常规治疗方法之一,但是近三分之一的结直肠癌患者对放疗表现出低敏感性或者完全抵抗。因此,放疗抵抗仍是治疗结直肠癌面临的主要挑战。在“精准医疗”的时代,探索克服放疗抵抗的新靶点或新分子,是个体化治疗结直肠癌患者的重要工具,对于提高结直肠癌患者的总体生存率有十分重要的意义。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是一种精确的信号级联系统,可以检测DNA损伤并决定受损细胞的命运,是肿瘤生物学研究的重要领域之一,尤其在肿瘤的放疗敏感性调控中起关键作用。肿瘤细胞产生放疗抗性的重要原因是,癌细胞可以识别电离辐射诱导的DNA损伤,并通过激活各种途径修复这些损伤,癌细胞对DNA损伤具有较高的修复活性,因此对放疗产生高度抵抗。结直肠癌的发生也与癌基因、抑癌基因和DNA修复相关基因突变有关,如KRAS、TP53和BRCA1/2突变等,这些突变会引起基因组不稳定性,促进癌变过程。研究显示,靶向DNA损伤修复可以有效提高结直肠癌对放疗的敏感性,但关于DNA损伤修复的调控机制仍不清楚,研究发现了很多新的调控分子在DDR中发挥关键作用。因此,进一步寻找肿瘤中DNA损伤修复异常激活的新靶点或新分子,对于克服放疗抵抗、提高癌症治愈率具有重要意义。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）可以调节多种生物学过程,如细胞周期、细胞分化、X染色体失活、m RNA选择性剪接、RNA转录和翻译等。多项研究表明,lnc RNA失调是结直肠癌发生的主要因素之一,它通过调控其靶基因的表达,影响结直肠癌中的信号通路、癌细胞转移以及对放疗的敏感性。lnc RNA在DNA损伤修复中具有重要作用,它可以通过直接或间接的转录方式与蛋白质、DNA或RNA相互作用,调控DNA损伤修复。因此lnc RNA通过DNA修复通路调控结直肠癌对放疗的敏感性已经成为临床研究的一个重要领域,探索能够通过DDR通路调节结直肠癌放疗抗性的候选lnc RNA及其分子机制,对于改善结直肠癌患者的临床疗效意义重大。但是,目前大多数lnc RNA在DDR中的功能在很大程度上尚未阐明。ATR是检查点信号通路的中心转导因子,它可被DNA损伤和复制应激激活,在DNA损伤修复、细胞周期调节和细胞凋亡中具有广泛的功能和重要的生理意义。基于我们前期发现DNA损伤修复关键分子ATR具有结合lnc RNA能力的认知前提,本课题以此为切入点,利用RNA免疫共沉淀与高通量测序（RIP-seq）筛选出与ATR结合的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR验证,筛选出与ATR结合丰度最高的SCARNA2,从DNA损伤修复角度,全面探索了它调控结直肠癌放疗敏感性的具体效应及分子机制,为开发潜在的、预测结直肠癌放疗敏感性的标志物和治疗靶点提供了新的科学依据。二、研究内容及方法（一）Lnc RNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨1、RIP-seq筛选ATR结合的lnc RNA首先选用ATR抗体通过RNA免疫共沉淀方法（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）富集与ATR结合的RNA,通过高通量二代测序筛选与ATR结合的lnc RNA,选取排名前30位的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR的方法验证它们与ATR的相互作用关系,发现SCARNA2与ATR的结合丰度最高,因此将目标靶分子确定为SCARNA2。通过探究SCARNA2在15种细胞系的基础表达量,确定研究细胞系为结肠癌细胞系HCT116和HT29。2、DNA损伤对SCARNA2表达水平的影响将HCT116和HT29细胞经电离辐射（Ionizing radiation,IR）、DNA损伤诱导剂喜树碱（Camptothecin,CPT）或依托泊苷（Etoposide,ETO）处理后,在不同时间点分别提取细胞的RNA,经反转录和RT-PCR检测SCARNA2转录水平的变化。将HCT116和HT29细胞分别与DDR通路抑制剂（DNA-PKcs抑制剂Nu7441、ATM抑制剂Ku-55933、ATR抑制剂VE-821）孵育后,再分别用IR、CPT或ETO处理细胞后,在SCARNA2响应DNA损伤最明显的时间点提取RNA,RT-PCR检测DDR通路抑制剂对SCARNA2转录水平的影响。3、SCARNA2对DNA损伤修复通路的影响通过慢病毒包装质粒系统构建SCARNA2敲低（sh-SCARNA2）、CRISPR Cas9敲除（sg-SCARNA2）和过表达（SCARNA2-OE）稳转细胞系,通过RT-PCR测定下调和过表达效率。通过彗星电泳检测SCARNA2下调细胞照后的DNA损伤程度;通过免疫荧光的方法检测SCARNA2干扰细胞在照后0、0.5、4、8、12和24 h形成γH2AX和53BP1 foci的动态变化情况。最后通过蛋白凝胶电泳（Western Blot,WB）的方法检测SCARNA2下调细胞经IR、CPT或ETO处理后,DDR通路相关蛋白分子的表达水平变化情况。（二）Lnc RNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径的调控作用及机制1、下调SCARNA2对细胞照后基因转录组的影响取对照组和SCARNA2敲除组细胞,通过RNA-seq检测下调SCARNA2对照后基因转录组的影响。2、SCARNA2对非同源末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）和同源重组（Homologous recombination,HR）修复方式的影响通过构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统测定SCARNA2下调细胞中NHEJ或HR的修复效率。通过免疫荧光检测下调SCARNA2对细胞核中形成RAD51和RPA2 foci的动态变化过程的影响。3、SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定通过RNA pull down实验筛选HCT116细胞中与SCARNA2结合的蛋白复合物,然后通过质谱检测,筛选与SCARNA2结合的蛋白。4、SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作情况的影响通过免疫共沉淀的方法探讨SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作及蛋白修饰的影响。（三）Lnc RNA SCARNA2促进DNA损伤修复调控结直肠癌放疗敏感性1、SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的影响采用SCARNA2下调和过表达细胞系,经IR、CPT、ETO等处理后,通过克隆形成率、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以及Western Blot检测SCARNA2对结肠癌细胞存活率、增殖能力和细胞活力、细胞凋亡率及细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响,进而探究SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用。通过流式细胞术和Western Blot检测结肠癌细胞经IR、CPT、ETO等处理后,SCARNA2对细胞周期进程以及周期通路相关蛋白水平变化的影响。2、SCARNA2对裸鼠荷瘤（CDX）模型放射敏感性的影响构建人源肿瘤细胞系裸鼠皮下荷瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）,通过测量照后裸鼠皮下荷瘤肿瘤的体积,探究SCARNA2对瘤体细胞增殖能力的影响;通过对肿瘤组织进行TUNEL染色,检测SCARNA2肿瘤细胞的凋亡情况;通过对肿瘤组织进行免疫组化染色,探究SCARNA2对HR通路相关分子蛋白表达水平的影响。通过以上体内实验,探究SCARNA2对裸鼠皮下肿瘤放疗敏感性的调控作用。3、SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结肠癌组织中的表达差异通过组织芯片荧光原位杂交（Florescence In-Situ Hybridization,FISH）的方法分别检测临床结直肠癌病人放疗敏感和抵抗的肿瘤组织中,SCARNA2、ATR的表达以及二者共定位情况。具体研究内容及方法见技术路线图（图1）图1.技术路线图三、研究结果:（一）Lnc RNA SCARNA2可以促进结肠癌细胞的DNA损伤修复1、通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,它在结肠癌细胞中的基础表达量相对较高,并且以时间依赖性的方式响应由IR、CPT和ETO诱导的DNA损伤应答;当使用ATM和ATR抑制剂后,显着抑制了SCARNA2对DNA损伤的响应,说明DNA损伤诱导的SCARNA2上调受ATM/ATR激酶调控。2、下调SCARNA2会显着加重电离辐射导致的DNA损伤,同时延缓了DNA损伤的修复过程;并且抑制了由IR、CPT或ETO诱导的ATR-Chk1通路的激活。（二）Lnc RNA SCARNA2通过HR通路调控DNA损伤修复1、SCARNA2通过HR通路促进DNA损伤修复,下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2在损伤位点的募集,进而延缓了DNA损伤修复过程。2、SCARNA2结合蛋白主要富集在细胞周期、DNA损伤修复、DNA复制与合成、RNA转录及翻译等通路。SCARNA2的缺失会对细胞周期、细胞凋亡以及DNA损伤刺激反应的相关基因转录组产生影响。此外,下调SCARNA2可以抑制ATR与HR通路相关蛋白如Top BP1、NBS1、Mre11、Chk1等的相互作用。3、SCARNA2的缺失抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化,其机制可能与Chk1甲基化或泛素化的修饰方式有关。（三）Lnc RNA SCARNA2通过促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌的放疗敏感性1、照射和DNA损伤剂处理后,下调SCARNA2可以降低结肠癌细胞的存活能力、增殖能力和细胞活力;促进细胞凋亡,抑制G2/M周期阻滞。2、通过移植瘤内多点注射sg-SCARNA2慢病毒载体,成功下调了瘤体细胞内SCARNA2的表达水平,发现下调SCARNA2可以抑制照后肿瘤的生长速度、促进肿瘤细胞的凋亡,并抑制照后肿瘤细胞的HR修复通路。3、相较放疗敏感的结直肠癌组织,SCARNA2在放疗抵抗的结直肠癌组织中的表达水平高了80%左右（p<0.00001）。四、结论:本研究通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,通过一系列的体内外生物学实验发现SCARNA2与结肠癌细胞的DNA损伤修复和放射敏感性密切相关,SCARNA2的缺失可以抑制结肠癌细胞的DNA损伤修复能力。与DNA损伤诱导剂或IR联合使用,可以促进肿瘤细胞凋亡,增加了结肠癌细胞对放射的敏感性。通过对其具体机制的探讨,发现SCARNA2通过HR修复方式参与DNA损伤修复。缺失SCARNA2抑制了ATR下游靶点Chk1的磷酸化,其机制可能与Chk1发生了甲基化或泛素化修饰有关。同时,下调SCARNA2抑制了CDC25C的磷酸酶活性和Wee1的激活,进而通过影响Cyclin B/CDC2复合物的活性抑制G2/M期阻滞,由此明确SCARNA2通过激活ATR-Chk1-CDC25C/Wee1通路调控细胞周期进程。综上所述,SCARNA2有潜力成为结直肠癌的放疗增敏新靶点。此外,SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着,也有望作为潜在的结直肠癌放疗预后生物标志物。
贾步云[3]（2021）在《基于lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路研究藤黄酸B对胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响及机制》文中研究说明背景胃癌作为消化系统常见的恶性肿瘤,发病率在各种癌症当中位居前列。藤黄中蕴藏着多种氧杂蒽酮类抗肿瘤活性物质,其中藤黄酸B（morellic acid,MA）具有潜在的抗胃癌的活性,其体内外抗胃癌的作用及作用机理值得深入的探讨。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lncRNAs）作为细胞中重要的调控因子,与包括肿瘤在内的多种疾病有着密切的关系。lncRNAs能够作为caspase上游信号分子影响肿瘤细胞程序性死亡过程。因此,本研究首次尝试从lncRNAs调控caspase介导的肿瘤细胞凋亡及焦亡的角度探讨MA体内外抗胃癌作用的机制。目的观察MA对于胃癌的体内外的抗癌活性;以lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1信号通路促进胃癌细胞caspase-3依赖的凋亡和焦亡为切入点,探讨MA抗胃癌作用的分子机制。方法（1）MA提取分离纯化与含量测定乙醇超声提取、中压制备色谱分离及高压色谱纯化的方法对藤黄中MA进行分离;高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法对MA进行含量测定及有机溶剂（甲醇,乙醇,二甲亚砜）中放置稳定性的考察。（2）MA抗胃癌活性及其诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡体外研究。MTT实验观察梯度浓度的MA对不同胃癌细胞体外抑制作用;划痕实验观察胃癌细胞迁移。Annexin V-PI双染法检测胃癌细胞凋亡率;Western blot法测定胃癌细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bcl-2以及Bax的表达水平;荧光倒置显微镜观察胃癌细胞焦亡形态;乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测胃癌细胞LDH释放率;测定胃癌细胞焦亡相关蛋白GSDME N端肽段（GSDME N terminal,GSDME-NT）以及IL-18的蛋白表达水平。（3）MA抗胃癌活性及其诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡体内研究。采用小鼠胃癌MFC细胞制备BALB/c小鼠胃癌皮下移植瘤模型,实验动物随机的分为:模型组（Model）,MA低剂量组（MA-L）,MA中剂量组（MA-M）,MA高剂量组（MA-H）和阳性药5-氟尿嘧啶组（5-FU）,另设正常对照组（Normal）;选择肿瘤体积、肿瘤重量、肿瘤抑制率、以及动物体重经时变化作为指标,观察MA对小鼠皮下移植瘤生长的影响;HE染色观察肿瘤病理形态的影响;免疫组化法测定MA胃组织中Ki67表达量。测定胃癌组织中凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bcl-2以及Bax的表达水平,焦亡相关蛋白GSDME-NT以及IL-18的蛋白表达水平,研究MA对体内胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响。（4）MA促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的分子机制研究。RT-qRCR法测定不同浓度MA对胃癌细胞以及动物实验中各组动物胃癌组织中lncRNA GAS5的表达水平的影响。采用siRNA构建lncRNA GAS5低表达细胞,实验细胞分为:非靶序列siRNA对照组（NC-siRNA组）、非靶序列siRNA给药组（NC-siRNA+MA组）,lncRNA GAS5低表达对照组（GAS5-siRNA组）,lncRNA GAS5低表达给药组（GAS5-siRNA+MA组）。检测lncRNA GAS5低表达胃癌细胞的凋亡率、焦亡形态、LDH释放,检测lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5、miR-23a和Apaf-1mRNA水平以及cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、GSDME-NT、Apaf-1和IL-18蛋白表达。采用shRNA慢病毒包装构建lncRNA GAS5低表达细胞稳转细胞株,用得到的稳转株制备lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型,实验动物分为:非靶序列shRNA对照组（NC-shRNA组）、非靶序列shRNA给药组（NC-shRNA+MA组）,lncRNA GAS5低表达对照组（GAS5-shRNA组）,观察MA对lncRNA GAS5低表达胃癌动物体内肿瘤生长的影响;测定lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5、miR-23a和Apaf-1 mRNA水平以及cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、GSDMENT、Apaf-1和IL-18蛋白表达。结果（1）藤黄酸B提取分离与稳定性成功分离得到MA,经HPLC色谱峰的面积归一化方法测定及计算纯度为98.3%;MA在DMSO溶液中45 d内稳定性良好。（2）藤黄酸B在体外具有较强的抗胃癌活性,并能够诱导MKN-45以及MFC细胞发生caspase-3依赖的凋亡及焦亡。MA对于胃癌BGC-823,SGC-7901,HGC-27 MKN-45以及MFC细胞的IC50值分别为6.216±0.23μM,3.859±0.11μM,4.518±0.17μM,2.964±0.25μM和1.81±0.16μM。其中,对于MKN-45和MFC细胞的抑制活性最强。MA（1μM、2μM和4μM）处理组的胃癌细胞的迁移能力被显着的抑制（P<0.05或P<0.01）。MA（1μM、2μM和4μM）处理组胃癌细胞凋亡率显着升高,细胞中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和Bax的表达显着上调,Bcl-2的表达显着下调（P<0.05或P<0.01）。MA（1μM、2μM和4μM）处理胃癌细胞,均出现了明显的焦亡形态。MA（1μM、2μM和4μM）处理组胃癌细胞LDH释放率,显着增加,细胞中GSDME-NT以及IL-18表达显着上调（P<0.05或P<0.01）。（3）藤黄酸B具有体内抗胃癌活性,并能在体内诱导胃癌细胞发生caspase-3依赖凋亡及焦亡。在小鼠胃癌皮下移植瘤模型中,MA及阳性药5-FU对小鼠皮下肿瘤生长均有显着的抑制作用。疗程第15天,MA（1、2和4mg/kg）各剂量组以及阳性药5-FU（100mg/kg）对于小鼠体内肿瘤的抑制率分别为:79.32±7.69%,92.36±4.21%,92.18±2.99%和87.64±6.30%。肿瘤组织病理形态观察发现,模型组肿瘤组织中肿瘤细胞细胞核完整,细胞排列相对致密。MA（1、2和4mg/kg）各剂量组及阳性药5-FU（100mg/kg）组肿瘤组织中可见散在分布的凋亡以及坏死的肿瘤细胞,胞间出现裂隙,细胞核出现固缩和破裂的形态。MA（1、2和4mg/kg）各剂量组以及阳性药5-FU（100mg/kg）组动物肿瘤组织中的Ki67蛋白的表达量均显着降低,胃癌组织中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax、GSDME-NT和IL-18的表达显着上调,Bcl-2的表达显着下调（P<0.05或P<0.01）。（4）MA通过调控lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡。在体外,MA（1μM、2μM和4μM）处理的MKN-45细胞和MFC细胞中lncRNA GAS5的水平显着提高（P<0.05或P<0.01）。在小鼠皮下移植瘤模型中,MA（1、2和4mg/kg）各剂量组及阳性药组动物肿瘤组织中lncRNA GAS5水平均显着提高（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞凋亡率显着提高,细胞出现了显着的焦亡形态,LDH的释放率显着增加,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）诱导胃癌细胞凋亡、焦亡及增加LDH释放率的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞中lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA水平显着上调,miR-23a水平显着下调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）上调lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA以及下调miR-23a的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDME-NT、Apaf-1以及IL-18蛋白表达显着上调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）对于这些蛋白水平的上调作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。在lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型中,MA（2 mg/kg）组动物肿瘤体积和重量明显减小,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2 mg/kg）对于动物肿瘤生长的抑制作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2 mg/kg）组胃癌组织中lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA水平显着上调,miR-23a水平显着下调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2 mg/kg）上调lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA以及下调miR-23a的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2 mg/kg）组胃癌组织中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDMENT、Apaf-1以及IL-18蛋白表达显着上调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2mg/kg）对于这些蛋白水平的上调作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。结论MA具有体内外抗胃癌的作用,其作用机制可能与其上调胃癌MKN-45及MFC细胞中lncRNA GAS5水平,靶向吸附miR-23a,拮抗miR-23a对Apaf-1的抑制作用,进而激活caspase-9及caspase-3,促进胃癌MKN-45及MFC细胞发生凋亡和焦亡相关。
陶鹏先[4]（2021）在《PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究》文中指出肝癌是世界排名第5的高致死性恶性肿瘤,因高侵袭性、高复发性而着称,其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占约90%以上。而作为与肿瘤浸润、转移密切相关的失巢凋亡（anoikis resistance,AR）抵抗在肝癌中的研究一直处于边缘领域。作为HCC发生发展中的重要凝血相关纤溶因子PAI-1既往证实与HCC的浸润转移密切相关,但其临床预后意义及与基础研究往往相左。是否PAI-1因子在HCC中发挥其浸润转移重要调控作用是通过引起肿瘤细胞AR表型引起,既往并无相关报道。目的 探索PAI-1在肝癌中的生物学意义及其是否调控肝癌细胞失巢凋亡抵抗表型和具体调控机制。方法 1、使用免疫组化（IHC）分析PAI-1在肝癌组织中表达情况,并结合临床基线资料统计其与肝癌患者临床预后（总体生存率,OS）结局;2、使用Western-blot,RT-PCR技术验证PAI-1在HCC细胞中的相对mRNA及蛋白表达水平;验证PAI-1调控HCC细胞中的凋亡蛋白表达水平（cleaved caspase-3）,EMT蛋白表达水平（E-cahdarin,N-cahdarin,Vimentin）;以及验证PAI-1调控HCC细胞AR的信号通路蛋白表达（PTEN,PI3K,p-85α,AKT及p-AKT）;3、使用慢病毒载体工具构建PAI-1 RNAi及Ovexpression HCC稳转细胞株进一步验证PAI-1调控HCC细胞mRNA及蛋白表达水平;4、使用流式Annexin V-FITC/PI法检测HCC细胞的anoikis表型以及PAI-1调控HCC anoikis表型;5、使用细胞划痕愈合实验、Transwell实验以及CCK-8实验验证PAI-1调控HCC细胞的增殖、浸润、转移表型;6、使用生物信息学技术分析在HCC中PAI-1调控PTEN/PI3K/AKT信号通路的下游蛋白分子及临床意义;7、通过构建体内HCC肝内转移模型,验证PAI-1在体内调控HCC浸润转移表型及相关调控机制。结果 1、通过本课题组分析统计174例肝癌患者临床资料及IHC结果,发现PAI-1表达与HCC患者生存预后呈正相关,PAI-表达越低,肝癌患者预后越差（Log-rank,p=0.027）;测量肝癌患者IHC切片Mean-IOD值,验证癌旁vs癌组织（p<0.000）,并且随着临床分期的升级,PAI-1表达呈明显下降趋势;使用COX单因素回归分析PAI-1表达（HR=1.662,95%CL=1.380-2.546,p=0.000）,多因素COX回归分析PAI-1表达（HR=2.303,95%CL=1.852-2.654,p=0.000）,提示相较其他因素,PAI-1可以作为独立的预后因子,低表达是高表达预测风险的1.662倍/2.303倍。2、PAI-1基因在蛋白及mRNA表达水平上基本一致（VS L02）在PLC/PRF/5、SMMC 7721以及MHCC-97H表达均为低表达;慢病毒构建稳转株:PAI-1高表达细胞组（Hep G2、Huh 7）共设三个敲减靶点,敲减效率最低达到80%以上（Hep G2 sh-PAI-1#53.3%,sh-PAI-2#84%,sh-PAI-3#23%;Huh sh-PAI-1#71%,sh-PAI-2#83.3%,sh-PAI-3#66.1%）,低表达组（SMMC 7721以及MHCC-97H）过表达效率达到70%以上（MHCC-97H 84%,SMMC 7721 76.2%）。高表达细胞系悬浮48h后PAI-1表达明显下降,而低表达组sus 48h却呈明显上升趋势（p<0.001,VS贴壁48h组）,对高表达细胞系敲减PAI-1基因后,细胞悬浮48h PAI-1表达明显下降（p<0.001,VS sh-NC sus 48h,悬浮sus（suspension））。而对低表达组过表达PAI-1基因后,细胞悬浮48h PAI-1表达明显上升（p<0.001,VS OV-NC sus 48h）;验证cleaved-caspase 3表达,在高表达细胞系中,敲减PAI-1细胞系sus 48h凋亡率明显下降（VS sus 48h sh-NC,p<0.001）,而在低表达细胞系中缺恰恰相反（VS sus 48h OV-NC,p<0.001）;探索EMT表型蛋白（N-cadherin,E-cadherin,Vimentin）表型蛋白变化,细胞悬浮48h后EMT,发现PAI-1表达越高,悬浮细胞浸润及转移能力越差,反之越强（VS sh-NC sus 48h/OV-NC sus48h,p<0.001）;分别对PTEN,PI3K,PI3K磷酸化蛋白p85α,AKT,AKT磷酸化蛋白p-akt表达水平分析,sh组细胞悬浮48h后,PTEN表达明显降低（VS sh-NC sus 48h,p<0.001,***）,而p85α和p-akt表达升高（VS sh-NC sus 48h,p<0.001,***）。相较sh-NC组,sh组细胞贴壁48h后,PTEN表达明显降低,p85α和p-akt表达升高,但相较悬浮组,细胞悬浮后信号通路下游蛋白激活更为明显;与之相反,相较OV-NC组,OV组细胞悬浮48h后,PTEN表达增高,p85α和p-akt表达降低（VS OV-NC sus 48h,p<0.001,***）,而贴壁48h PTEN表达虽然也有增高,p85α和p-akt表达降低趋势,变化趋势并不太明显（VS OV-NC sus 48h,p>0.05）,未磷酸化蛋白PI3K,AKT相较NC组却未发生明显改变。3、使用流式Annexin V-FITC/PI凋亡检测高表达细胞经过PAI-1基因敲除后,sus 48h凋亡率明显下降（sus 48h sh-NC-Hep G2 43.32%±4.23%VS sus 48h shPAI-1-Hep G2 15.38±1.68%、sus 48h sh-NC-Huh 7 53.7%±7.23%VS sus 48h sh-PAI-1-Huh 7 15.35.7%±3.33%,p<0.001）,而对于低表达细胞系,则恰恰相反（sus48h OV-NC-SMMC 7721 21.41%±3.36%VS sus 48h OV-PAI-1-SMMC 772144.41±4.35%、sus 48h OV-NC-MHCC-97H 17.21%±3.63%VS sus 48h OV-PAI-1-MHCC-97H 32.16%±3.88%,p<0.001）。4、划痕实验可见PAI-1高表达细胞,当PAI-1基因敲除后,相较sh-NC组,Hep G2划痕相对面积愈合速度明显加快（0.86 cm2±0.21 cm2 VS 0.14 cm2±0.06cm2,p<0.001）,Huh 7趋势同前（0.98 cm2±0.16 cm2 VS 0.57 cm2±0.21 cm2,p<0.001）;而对于PAI-1低表达细胞,相较OV-NC组,趋势则恰恰相反,MHCC-97H划痕相对面积愈合速度明显降低（0.12 cm2±0.02 cm2 VS 0.38 cm2±0.11 cm2,p<0.001）,SMMC 7721趋势同前（0.29 cm2±0.17 cm2 VS 0.74 cm2±0.18 cm2,p<0.001）。Transwell实验可见,PAI-1高表达细胞,当PAI-1基因敲除后,相较sh-NC组,Hep G2浸润及转移能力明显增强（invasion:32±4 VS 8±3,p<0.001;migration:22±2 VS 6±3,p<0.001）,Huh 7趋势同前（invasion:298±14 VS 78±13,p<0.001;migration:324±22 VS 85±16,p<0.001）;PAI-1低表达细胞,当过表达PAI-1基因后,相较OV-NC组,趋势则恰恰相反,MHCC-97H浸润及转移能力明显降低（invasion:23±5 VS 107±21,p<0.001;migration:21±4 VS 94±15,p<0.001）,SMMC 7721趋势同前（invasion:112±22 VS 198±13,p<0.001;migration:124±18VS 237±26,p<0.001）。使用cck-8检测HCC增殖率,细胞增殖表型基本相同NC组（OV-MHCC 97H VS OV-NC组,p=0.017;OV-SMMC 7721 VS OV-NC组,p=0.024）。5、根据各种在线生物信息学预测网站,我们预测AKT1作为PTEN及PAI-1主要调控蛋白,可能参与PAI-1激活/失活PTEN,调控PI3K/AKT信号通路。6、为构建PAI-1调控体内肝癌细胞转移瘤模型,我们对OV-NC及OV-PAI-1 MHCC-97H荷瘤NOD/SCID小鼠肝脏标本进行HE染色并对两组肝癌转移灶拍照比对。相较OV-PAI-1组,OV-NC组小鼠肝脏肝癌细胞转移灶明显增多,并且质地明显较硬。使用小动物成像技术显影小鼠CDX成瘤强度及分析其肿瘤平均ROIs值。可见OV-NC组显影强度明显高于OV-PAI-1组,相较OV-NC组,OV-PAI-1组ROIs显着降低（3648±457 VS 9874±688,p<0.001）。为验证体内PAI-1调控HCC预后,绘制Kaplan-Meier生存曲线,相较OV-NC组,OV-PAI-1组小鼠生存周期明显延长（VS OV-NC,p=0.0037）。使用western-blot验证OVNC及OV-PAI-1两组小鼠荷瘤组织蛋白中PAI-1,PTEN,PI3K,p-85α,AKT及p-AKT蛋白表达水平。相较OV-NC组,OV-PAI-1组PAI-1表达明显升高,PTEN蛋白表达升高,而p-85α及p-AKT蛋白表达降低（p<0.001）,而PI3K及AKT表达水平无明显变化。结论 本课题组通过临床、体内、体外三个层面对PAI-1在肝癌中调控作用做了系统的分析、验证,证实:1、PAI-1在HCC中普遍低表达,与患者预后呈正相关;2、PAI-1参与HCC的浸润、转移、增殖表型,从而与HCC的AR表型密切相关;3、PAI-1通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路介导了肝癌细胞AR表型发生,从而促进肝癌的浸润转移能力。
刘伟[5]（2012）在《输注FasL基因转染的血管内皮细胞抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究》文中指出背景：免疫豁免区域表达有高水平的FasL,仔细的研究表明这些免疫豁免区域的细胞通过表达的FasL和渗透的炎症细胞上表达的Fas相互作用并诱导其凋亡来实现其免疫豁免的效果。我们合理的设想这种FasL和Fas的相互作用可以用于保护移植物免受急性排斥。我们进一步设想血管内皮细胞,因为其不受FasL的杀伤作用可以用作FasL基因表达的载体。方法：我们先行建立了慢病毒rFasL/嘌呤霉素表达体系,以进一步使转染的内皮细胞特异性而且持续的表达FasL。具体实验中我们先建立大鼠急性肝移植排斥模型的并将其分为四组：第一组为肝移植后规律使用FK506抗排斥的阳性对照组,第二组为肝移植后不做任何其他处理的阴性对照组,第三组为在肝移植过程中输注转染FasL基因的内皮细胞的实验组,第四组为输注携带FasL基因慢病毒的对比组。每组24对供受体大鼠。我们分别观察术后各组大鼠的AST和BIL数值和各组的术后生存天数。结果：输注转染FasL的内皮细胞组和输注携带FasL基因病毒组的AST和BIL数值介于使用FK506的阳性对照组和不做任何处理的阴性对照组之间。术后输注转染FasL的内皮细胞组和输注携带FasL基因病毒组的大鼠的生存天数明显长于阴性对照组,但短于使用FK506的阳性对照组。结论：这个在体实验清楚地证明转染FasL基因的内皮细胞和携带FasL基因的慢病毒输注能显着保存移植物的功能和延长其生存天数。
肖治宇,李祖勇,吴畏,伍刚,姚和瑞[6]（2009）在《结肠癌SW480细胞FAP-1表达与奥沙利铂化疗耐药关系的研究》文中认为目的探讨结肠癌FAP-1表达与其对奥沙利铂化疗耐药间的关系。方法用奥沙利铂处理结肠癌SW480细胞,用MTT法评价其细胞增殖能力,以RT-PCR法评价FAP-1 mRNA表达水平。结果奥沙利铂化疗仅能一定程度上抑制结肠癌SW480的增殖,但随作用时间的延长,SW480细胞仍能继续增殖。经过奥沙利铂化疗FAP-1的表达上调。结论奥沙利铂化疗可引起FAP-1表达的上调,增强肿瘤细胞对抗Fas诱导的细胞凋亡。这可能与结肠癌对奥沙利铂化疗的耐药相关。
李乾[7]（2009）在《塞来昔布抗胃癌作用机制及Fas、FasL在胃癌中表达意义的研究》文中认为研究背景胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率居我国各类恶性肿瘤的首位。临床早期胃癌大多无症状或症状不典型,早期诊断困难;临床就诊者大部分属于中、晚期,失去手术机会或术后易复发。因此,提高胃癌患者生活质量和无病生存期的化疗显得很重要。目前常用的化疗药物副作用大且疗效欠佳。因此寻找新的安全有效的非细胞毒化疗药物是目前胃癌等消化道肿瘤防治方面需要迫切解决的课题。细胞增殖和凋亡是细胞生物学行为的两个重要方面,肿瘤的发生即为细胞恶性增殖和凋亡失控所致。近年来,Fas和FasL在消化道肿瘤中尤其在胃癌前病变、胃癌中的表达及其与细胞凋亡之间的关系已引起广泛关注。Fas是细胞表面重要的死亡受体,与其配体FasL结合活化并传导凋亡信号是诱导细胞凋亡的重要途径,Fas与FasL结合后,通过胞浆内Fas相关死亡域蛋白（FADD）,再和门冬氨酸特异半胱氨酸蛋白酶（caspase-8）酶原发生相互作用,激活caspase-8酶原,进一步激活多种caspase联级反应,最终导致细胞凋亡。既往研究已证明胃癌前病变及胃癌组织表达FasL,不仅可以介导表达Fas的胃癌前病变及胃癌细胞凋亡,而且可能介导胃癌前病变及胃癌组织中表达Fas的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）发生凋亡,从而使胃癌细胞逃逸机体自身免疫清除,成为胃癌发生、发展的重要潜在生物学基础。深入研究胃癌及局部淋巴结组织Fas、FasL的表达,为进一步阐明Fas凋亡系统在胃癌发生、发展及免疫逃逸机制和防治方面提供实验依据。NSAIDS降低胃肠道肿瘤发生的危险性,已成为肿瘤防治领域的研究热点。国外多项大规模的流行病学研究、动物实验和临床研究均发现,长期规律服用非甾体抗炎药（NSAIDS）能使结肠癌发病的危险性降低。我们前期研究发现吲哚美辛（IN）和塞来昔布具有抗结肠肿瘤细胞增殖效应。然而传统的NSAIDS如IN,在抑制COX-2的同时抑制了COX-1,长期服用对胃肠道及肾等脏器产生损害,限制了其在临床上的广泛和长期应用。新型NSAIDS,选择性抑制COX-2,则既有抑瘤作用,又避免了胃肠道副作用。选择性COX-2抑制剂抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡的研究,倍受肿瘤学专家们关注。国内外多个研究发现塞来昔布有抑制胃癌细胞增殖凋亡作用,对其作用的分子机理研究仅局限于对环氧化酶-2的活性抑制。一些研究表明COX-2抑制剂通过抑制环氧化酶-2的活性,减少前列腺素E2的释放,进而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。但选择性COX-2抑制剂塞来昔布对细胞周期调控具有重要意义的细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p16和p21表达的影响,及对细胞Fas、FasL凋亡途径中Fas、FasL蛋白表达和凋亡相关调控因子Bcl-2蛋白表达的影响,国内外尚未见相关文献报道。探讨选择性COX-2抑制剂塞来昔布对BGC-823胃癌细胞抑瘤作用,从细胞周期调控系统,Fas、FasL凋亡系统与凋亡信号转导通路调控等层面,“立体”和系统地研究胃肿瘤细胞增殖和凋亡调控网络,揭示选择性COX-2抑制剂塞来昔布抑制BGC-823胃癌细胞增殖和凋亡调控机理,将为包括塞来昔布在内的选择性COX-2抑制剂抗胃癌等肿瘤的临床应用提供实验依据,为发现新的分子靶标提供新的思路。第一章塞来昔布抑制BGC-823胃癌细胞增殖及对p16和p21表达的影响目的:研究塞来昔布对体外培养的BGC-823胃癌细胞增殖的影响及对细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p16和p21表达的影响。方法:采用MTT比色法检测塞来昔布对BGC-823胃癌细胞增殖的抑制;通过流式细胞仪技术研究不同浓度的塞来昔布对BGC-823胃癌细胞周期的影响;通过RT-PCR技术检测塞来昔布对细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p16 mRNA及p21 mRNA表达的影响。结果:①塞来昔布浓度为20,40,60,80,100,120μmol/L,24hr时抑制率（%）分别为:7.63±2.66,13.33±0.95,18.83±0.91,24.63±1.55,33.20±1.14,55.00±6.50;48hr时抑制率（%）分别为:10.72±3.20,25.16±2.70,37.22±1.60,42.42±2.41,46.79±4.57,91.64±4.14:72hr时抑制率（%）分别为:10.91±1.61,31.39±3.20,54.82±1.25,62.41±5.51,74.88±1.02,98.17±0.69。塞来昔布各浓度组均抑制胃癌细胞BGC-823的生长,并呈时间和浓度依赖性。②流式细胞仪检测结果显示:塞来昔布浓度为0,20,40,60,80,100μmol/L时,G1期细胞数比例分别为0.603±0.016,0.643±0.006,0.671±0.005,0.708±0.008,0.750±0.007,0.787±0.006;S期细胞数比例分别为0.307±0.006,0.223±0.003,0.209±0.005,0.193±0.015,0.157±0.005,0.122±0.006。塞来昔布随浓度增加G1期细胞数比例逐渐增加,S期细胞数比例逐渐减少。各浓度组间细胞数比例两两比较,具有显着性差异（P＜0.05）。③RT-PCR结果显示不同浓度塞来昔布作用于BGC-823胃癌细胞后,塞来昔布各浓度组p16 mRNA和p21 mRNA扩增产物均有表达。塞来昔布浓度为0,20,40,60,80,100μmol/L时,p16 mRNA表达的相对丰度分别为:0.223±0.006,0.296±0.012,0.381±0.008,0.438±0.017,0.494±0.002,0.663±0.068;p21 mRNA表达的相对丰度分别为:0.435±0.045,0.642±0.098,0.730±0.014,0.813±0.069,0.907±0.058,1.030±0.051,p16 mRNA和p21 mRNA表达的相对丰度随塞来昔布浓度增加而增加。各浓度组间相对丰度两两比较,具有显着性差异（P＜0.05）。结论:①塞来昔布抑制BGC-823胃癌细胞增殖,呈时间和浓度依赖性。②塞来昔布干预BGC-823胃癌细胞增殖,使G1期细胞数增多,S期细胞数减少,阻滞胃癌细胞周期于G1期。③塞来昔布通过上调细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21mRNA和p16 mRNA表达,抑制BGC-823胃癌细胞周期进展。第二章塞来昔布诱导BGC-823胃癌细胞凋亡及对Fas、FasL及Bd-2表达的影响目的:研究塞来昔布诱导BGC-823胃癌细胞凋亡及对凋亡相关蛋白Fas、FasL及Bcl-2表达的影响。方法:通过流式细胞仪技术观察不同浓度的塞来昔布对BGC-823胃癌细胞凋亡的影响;通过WesternBlotting技术检测塞来昔布对凋亡相关蛋白Fas、FasL和Bcl-2表达的影响。结果:①流式细胞仪检测发现:塞来昔布浓度在0,20,40,60,80,100μmol/L时,凋亡细胞比率（%）分别为:0.503±0.018,5.870±0.325,11.396±0.267,17.567±0.376,24.439±0.326,52.933±2.575;随塞来昔布浓度增加凋亡细胞比率增加。各浓度组间凋亡细胞比率两两比较,具有显着性差异（P＜0.05）。②WesternBlotting结果显示:塞来昔布浓度为0,20,40,60,80,100μmol/L时,作用BGC-823胃癌细胞48h后,Fas蛋白相对含量分别是0.1113±0.0037,0.1017±0.0065,0.1975±0.0100,0.3297±0.0053,0.4595±0.0045,0.5204±0.0148;FasL蛋白相对含量分别是0.8070±0.0268,0.7311±0.0780,0.6254±0.0501,0.5465±0.0180,0.4378±0.0081,0.3760±0.0034;Bcl-2蛋白相对含量分别是0.5448±0.0049,0.5213±0.0326,0.4256±0.0421,0.3934±0.0305,0.2659±0.0121,0.2294±0.0081。在0～100μmol/L浓度范围内Fas蛋白表达上调和FasL、Bcl-2蛋白表达下调,均呈浓度依赖性。各浓度组间蛋白相对含量两两比较,具有显着性差异（P＜0.05）。结论:①塞来昔布诱导BGC-823胃癌细胞凋亡,在一定范围内呈浓度依赖性。②塞来昔布在一定浓度范围内,Fas蛋白表达呈浓度依赖性上调,FasL、Bcl-2蛋白表达呈浓度依赖性下调。③塞来昔布诱导胃癌细胞凋亡可能与Fas蛋白上调,FasL、Bcl-2蛋白下调有关。第三章Fas、FasL在胃癌及局部淋巴结组织中表达意义目的:探讨胃癌及局部淋巴结组织中Fas、FasL蛋白的表达与胃癌发生发展及转移的关系。方法:通过免疫组化方法研究64例胃癌及局部淋巴结组织和20例正常胃组织Fas和FasL蛋白的表达,并分析其与年龄、性别、病理亚型和有无淋巴结转移的关系。结果:①正常胃组织Fas蛋白阳性表达率高,在胃癌组织中Fas蛋白阳性表达率低;正常胃组织FasL蛋白阳性表达率低,在胃癌组织中FasL蛋白阳性表达率高。二者间阳性表达均有显着性差异（P＜0.001）。②Fas蛋白在有侵犯组淋巴结组织中阳性表达率高,在无侵犯组淋巴结组织中阳性表达率低,二者间阳性表达有显着性差异（P=0.003）。FasL在两组淋巴结组织中阳性表达无差异（P=0.593）。③Fas蛋白在高中分化组胃癌组织中阳性表达率高,在低分化组胃癌组织中阳性表达低,二组间阳性表达有显着性差异（P=0.015）。反之,FasL蛋白在高中分化组胃癌组织中阳性表达率低,在低分化组胃癌组织中阳性表达率高,二组间阳性表达有显着性差异（P=0.021）。④胃癌组织中Fas、FasL蛋白阳性表达率与年龄、性别及是否有淋巴结转移无明显关系。⑤胃癌组织中Fas和FasL两者间阳性表达率,两两比较有显着性差异（P＜0.001）;两者表达无直线相关性（rs=-0.425,P=0.575）。结论:①胃癌组织中Fas蛋白表达下调,FasL蛋白表达上调。②有侵犯淋巴结组织中Fas蛋白表达上调,无侵犯淋巴结组织中表达下调。③高分化胃癌组织中Fas蛋白阳性表达高于低分化胃癌组织;高分化胃癌组织中FasL蛋白阳性表达低于低分化胃癌组织。
徐银祥[8]（2007）在《非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究》文中研究表明背景与目的恶性肿瘤的发展变化在某种程度上取决于肿瘤与免疫系统之间的相互作用。机体免疫能力下降是肿瘤发生、发展的一个重要原因。因此,增强机体免疫力,促进肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的一个重要目标。研究发现细胞凋亡主要有线粒体和死亡受体两条途径。FasL是重要凋亡分子,与死亡受体Fas结合后诱导细胞膜表面Fas分子聚集形成三聚体启动细胞凋亡的信号传递诱导Fas阳性细胞凋亡。Fas广泛表达于体细胞,而FasL在正常情况下仅表达于活化T细胞,以及眼、睾丸、胎盘等特殊组织。Caspase是执行凋亡的主要酶类,Caspase-3是一种特异性半胱氨酸蛋白酶,在Caspase酶系级联反应中发挥重要作用。研究发现恶性肿瘤间质内存在以T淋巴细胞为主的淋巴细胞群体,称之为肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。TILs通过表达FasL蛋白诱导肿瘤细胞凋亡发挥其杀瘤活性。然而,TILs与非小细胞肺癌均表达FasL,非小细胞肺癌表达FasL和Caspase-3与肿瘤浸润淋巴细胞凋亡之间存在什么关系?肿瘤细胞高表达FasL能否引起宿主TILs凋亡,从而发挥反杀伤作用,逃避宿主免疫监视?肿瘤细胞高表达FasL是否与肿瘤浸润淋巴细胞分泌的细胞因子有关?表达FasL是不是NSCLC在接受来自TILs分泌细胞因子刺激后采取的一种反击宿主免疫系统的措施?相信深入研究非小细胞肺癌FasL、Caspase-3表达与肿瘤微环境中TILs的关系可能具有重要生物学意义。方法本研究采取以下方法:1.将手术切除45例非小细胞肺癌标本及远癌肺组织作为研究对象,应用免疫组织化学方法检测FasL、Caspase-3蛋白表达。2.应用激光微切技术获取非小细胞肺癌周边区和非周边区域肿瘤细胞,共10例,应用RT-PCR技术检测不同区域肿瘤细胞FasL和Caspase-3 mRNA表达。3.应用免疫组织化学技术标记肿瘤浸润淋巴细胞45例,结合应用TUNEL法检测肿瘤浸润淋巴细胞凋亡情况,原位检测非小细胞肺癌肿瘤浸润淋巴细胞凋亡比例。4.筛选出4份HLA-A2+ PBL;A549细胞转染质粒后稳定表达HLA-A2+,表达HLA-A2的PBL成为A549细胞的特异性TILs。HLA-A2+ PBL培养后细胞计数为3×105/ml,共246ml,离心后共获得96ml上清液。分别应用50μl、100μl、150μl、200μl、250μl和500μl肿瘤浸润淋巴细胞上清液与A549细胞共培养30min、60min、120min、180min和240min,设立阴性对照组,应用RT-PCR和Western blot技术分别检测A549细胞在不同时间、不同剂量肿瘤浸润淋巴细胞上清液共培养时FasL和Caspase-3 mRNA和蛋白表达。5.所得结果采用SPSS 10.0进行相应的统计学分析。结果本课题研究主要结果如下:1.非小细胞肺癌FasL表达检查结果:⑴肺腺癌FasL表达率为73.3%±15.8%,肺鳞状细胞癌FasL表达率为60.4 %±15.8 %,腺癌FasL表达显着高于鳞状细胞癌（p<0.01）;⑵中高分化肺癌FasL表达率为60.6 %±15.8 %,低分化肺癌FasL表达率为70.1 %±16.9 %,低分化肺癌FasL表达显着高于中高分化肺癌（p<0.05）;⑶伴淋巴结转移组NSCLC FasL表达阳性率为62.4 %±15.6 %,无淋巴结转移组肺癌FasL表达阳性率为55.8 %±11.9 %,伴淋巴结转移组肺癌FasL表达率显着高于无淋巴结转移组（p<0.05）;⑷本组单纯以肺癌pTNM分期统计分期,各期间统计比较无显着差异,将Ⅰ+Ⅱ期、ⅢA+ⅢB期分别合并后再进行统计分析,前者FasL表达阳性率为62.4%±15.6 %,而后者FasL表达阳性率为72.8 %±18.0 %,ⅢA+ⅢB期非小细胞肺癌FasL阳性率显着高于Ⅰ+Ⅱ期非小细胞肺癌FasL表达阳性率（p<0.05）。⑸NSCLC周边区FasL表达阳性率为74.4 %±18.4 %,而肿瘤非周边区FasL表达率为64.4 %±13.1 %,肿瘤周边区FasL表达显着高于非周边区FasL表达（ p<0.05 ）。2. NSCLC不同部位FasL、Caspase-3 mRNA表达检测结果:⑴NSCLC周边区FasL mRNA表达强度为0.926 + 0.41;肿瘤非周边区FasL mRNA表达强度为0.892 + 0.26。两组间存在显着差异,（P<0.05 ）。⑵肿瘤周边区Caspase-3 mRNA表达强度为0.912 + 0.07;肿瘤团非周边区Caspase-3 mRNA表达强度为0.923 + 0.04。两组间无显着统计学差异,（P>0.05 ）。3.非小细胞肺癌Caspase-3蛋白表达检测结果:⑴肺鳞状细胞癌Caspase-3蛋白平均阳性表达率为76.9 %,腺癌Caspase-3阳性表达率为47.4 %,鳞癌Caspase-3表达水平显着高于腺癌（p<0.05）;⑵中高分化NSCLC Caspase-3阳性表达率为70.0%,低分化非小细胞肺癌Caspase-3阳性表达率为64.0%,中高分化非小细胞肺癌与低分化NSCLC Caspase-3表达无显着差异（p>0.05）;⑶Caspase-3蛋白表达与N分期有关,无淋巴结转移组Caspase-3阳性表达率为81.8%,淋巴结转移NSCLC组Caspase-3阳性率为61.8%,无淋巴结转移组Caspase-3表达水平显着高于淋巴结转移组NSCLC（p<0.05）;⑷比较肺癌周边区与非周边区Caspase-3蛋白表达无显着差异（p>0.05）。4. NSCLC肿瘤浸润淋巴细胞凋亡检测结果:⑴肺腺癌组织肿瘤浸润淋巴细胞凋亡指数为5.51±1.56,肺鳞状细胞癌肿瘤浸润淋巴细胞凋亡指数为4.11±2.03,腺癌组织TILs凋亡指数显着高于鳞状细胞癌（p<0.01）;⑵中高分化非小细胞肺癌组织中TILs凋亡指数为3.84±1.71,低分化非小细胞肺癌组织TILs凋亡指数为5.38±1.90,低分化肺癌TILs凋亡指数显着高于中高分化NSCLC （p<0.01）;⑶不同pTNM非小细胞肺癌组织TILs凋亡指数统计比较无显着差异（ P >0.05）;⑷TIL凋亡指数随NSCLC FasL表达强度增强而增加,与其表达强度呈显着正相关（r = 0.707, p<0.01）。5.肿瘤浸润淋巴细胞培养上清液与A549细胞共培养后FasL和Caspase-3 mRNA及蛋白检测结果:⑴将TILs上清液250μl与A549细胞共培养60min时,FasL mRNA表达水平显着高于对照组（p<0.05）;⑵将TILs上清液200μl和250μl分别与A549细胞共培养90min时,FasL mRNA表达水平均显着高于对照组（ p<0.05 ）,两组间无显着差异（p>0.05）;⑶其他不同剂量TILs上清液与A549细胞共培养时肿瘤细胞FasL mRNA表达水平无显着变化（p>0.05）;⑷不同剂量肿瘤浸润淋巴细胞培养上清液与A549细胞共培养时各组FasL蛋白表达与对照组比较均无显着差异（p>0.05）;⑸各组A549细胞Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均无显着差异（p>0.05）。结论本研究得出如下结论:1. FasL蛋白在NSCLC中特异性高表达,而且与NSCLC生物学特点有关,FasL高表达可能是肺腺癌容易早期转移、预后较差的原因之一。2. FasL蛋白在NSCLC肿瘤组织呈不均匀分布,肿瘤细胞周边区FasL蛋白及FasL mRNA表达高于非周边区域。推测肿瘤团外部微环境因素可能影响肿瘤细胞FasL表达。NSCLC周边区细胞可能首先接受来自机体肿瘤浸润淋巴细胞分泌的淋巴因子,或其他体液因子刺激,上调FasL表达,对进入肿瘤团块的肿瘤浸润淋巴细胞实施反制措施,杀伤机体免疫细胞,进而在与机体免疫系统的杀伤与反杀伤战斗中争取生存空间,并进一步生长和发展。3.非小细胞肺癌FasL表达与TILs凋亡率存在密切关系,FasL蛋白表达水平越高,肿瘤浸润淋巴细胞凋亡率越高。高表达FasL蛋白可能意味着该组类型肺癌更容易应用FasL蛋白反杀伤机体肿瘤浸润淋巴细胞及免疫系统。4.肿瘤细胞与TIL上清液共培养时FasL表达上调,提示肿瘤细胞接受来自TIL分泌的某种细胞因子影响或调控。肿瘤细胞在加入TIL上清液6090min后上调FasL表达,反应较快,但在更长时间的共培养观察中未发现FasL高表达,并且,更大剂量TIL上清液加入肿瘤培养液中反而未发现FasL表达上调现象,其机制不明。参与细胞凋亡因素很多,调控机制复杂,TIL分泌细胞因子参与肿瘤细胞FasL表达尚需要进一步深入研究。
王健莉[9]（2007）在《FLIP、FAF-1在胃癌中的表达及与Fas/FasL介导的免疫逃逸的相关性研究》文中研究指明目的:胃癌是世界上最常见的消化道肿瘤之一,在我国其发病率也相当高,严重威胁着人们的健康,而肿瘤细胞逃过免疫系统的监视而迅速增长,成为肿瘤难以根治的主要原因。Fas/FasL介导的细胞凋亡机制障碍是胃癌发生发展难以治愈的重要机制之一,同时也是肿瘤逃逸的重要机制。Fas属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员,FasL则是Fas的配体（Ligand）Fas与FasL结合后,可以诱导细胞进入凋亡。在细胞内Fas的死亡区域（DD区）与具有死亡结构域的Fas相关蛋白（FADD）的C端结合,FADD的N端上的死亡效应结构域（death effect domains,DED）与caspase-8的DED相互作用,通过活化caspase-8后,随后出现caspase家族的连锁反应,从而分解DNA促进细胞凋亡。c-FLIP（FLICE-inhibitory protein）就是阻断凋亡的抑制因子之一,在胃癌中高表达。Fas相关因子（Fas-associated Factor1,FAF1）是一个促凋亡的因子,在肿瘤组织中的表达可能减少。故本课题主要研究了,FLIP与FAF1在胃癌中的表达情况及意义、FLIP与FAF1之间的相关关系及与Fas、FasL之间的关系,从而了解FLIP与FAF1在Fas凋亡通路中的作用,为肿瘤免疫的生物治疗提供更有价值的理论。方法:本课题采用38例胃癌患者的癌组织、癌旁组织及距癌组织边缘>5CM的相对正常组织系河北医科大学第二医院肿瘤外科与胃肠外科手术切除的组织蜡块包埋,患者术前均未行放、化疗和激素免疫治疗,术后均有病理学明确诊断,临床资料完整。其中男32例,女6例,年龄39～72岁,中位数年龄55.5岁。病理类型、分期及淋巴结转移情况,经病理科主任鉴定。对照组10例,为非胃癌手术切除的正常胃粘膜。采用免疫组化的方法和阳性细胞半定量积分的方法计算细胞的阳性表达情况,并研究FLIP、FAF1与胃癌临床病理参数之间的关系。统计学处理使用SPSS10.0软件,各指标在组织中的表达情况的比较及各指标与胃癌临床病理参数之间的关系,采用X2检验及Fisher确切概率法;各指标之间在胃癌中的相关性的研究,则采用spearman相关检验,P<0.05视为有统计学意义。结果:（1）Fas在38例胃癌组织中,28例不同程度的阳性表达,阳性率为73.68%;在癌旁组织中,32例不同程度的阳性表达,阳性率为84.21%;在距癌边缘>5CM的相对正常组织中,37例不同程度的阳性表达,阳性率为97.37%,三种组织中,Fas的表达有显着性差异（P<0.05）。FasL在38例胃癌组织中,36例不同程度的阳性表达,阳性率为94.74%;在癌旁组织中,33例不同程度的阳性表达,阳性率为86.84%;在距癌边缘>5CM的相对正常组织中,26例不同程度的阳性表达,阳性率为68.42%,三种组织中,Fas的表达有差异性（P<0.05）。（2）FAF1在38例胃癌组织中,20例不同程度的阳性表达,阳性率为52.63%;在癌旁组织中,31例不同程度的阳性表达,阳性率为81.58%;在距癌边缘>5CM的相对正常组织中,33例不同程度的阳性表达,阳性率为86.84%,三种组织中,FAF1的表达有显着性差异（P<0.05）。FLIP在38例胃癌组织中,35例不同程度的阳性表达,阳性率为92.11%;在癌旁组织中,30例不同程度的阳性表达,阳性率为78.95%;在正常组织中,21例不同程度的阳性表达,阳性率为55.26%,三种组织中,FLIP的表达有差异性（P<0.05）。（3）FAF1与胃癌临床病理参数的关系:FAF1的表达水平在不同年龄、性别、组织分型、病理分型、肿瘤部位、淋巴转移、远处转移、UICC分期等的各组间未见显着差异（P>0.05）,但与肿瘤大小各组间有统计学意义（P<0.05）。（4）FLIP与胃癌临床病理参数的关系:FLIP的表达水平在不同年龄、性别、组织分型、病理分型、肿瘤部位、淋巴转移、肿瘤大小、远处转移、UICC分期等的各组间未见显着差异（P>0.05）。（5）FLIP与Fas、FAF1,FAF1与Fas、FasL之间均无显着相关性（P>0.05）;但FLIP与FasL之间有显着相关性（P<0.05）。结论:（1）Fas在38例胃癌组织中,28例不同程度的阳性表达,阳性率为73.68%;在癌旁组织中,32例不同程度的阳性表达,阳性率为84.21%;在距癌边缘>5CM的相对正常组织中,37例不同程度的阳性表达,阳性率为97.37%,三种组织中,Fas的表达有显着性差异（P<0.05）;FasL在38例胃癌组织中,36例不同程度的阳性表达,阳性率为94.74%;在癌旁组织中,33例不同程度的阳性表达,阳性率为86.84%;在距癌边缘>5CM的相对正常组织中,26例不同程度的阳性表达,阳性率为68.42%,三种组织中,FasL的表达有显着性差异（P<0.05）,提示Fas、FasL在胃癌组织中表达的异常,Fas/FasL介导的凋亡在胃癌组织中出现反击,从而体现了胃癌组织中的免疫逃逸的情况。（2）FAF1在38例胃癌组织中,20例不同程度的阳性表达,阳性率为52.63%;在癌旁组织中,31例不同程度的阳性表达,阳性率为81.58%;在距癌边缘>5CM的相对正常组织中,33例不同程度的阳性表达,阳性率为86.84%,三种组织中,FAF1的表达有显着性差异（P<0.05）,表明FAF1在胃癌组织中低表达,FAF1的减少可能是胃癌发生、发展的重要因素之一;FLIP在38例胃癌组织中,35例不同程度的阳性表达,阳性率为92.11%;在癌旁组织中,30例不同程度的阳性表达,阳性率为78.95%;在正常组织中,21例不同程度的阳性表达,阳性率为55.26%,三种组织中,FLIP的表达有差异性（P<0.05）,提示FLIP在胃癌组织中高表达,FLIP可能是胃癌发生、发展的重要因素之一。（3）FLIP与胃癌临床病理参数的关系:FLIP的表达水平在不同年龄、性别、组织分型、病理分型、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴转移、远处转移、UICC分期等的各组间未见明显差异（P>0.05）。说明,FLIP可能与上述病理参数没有关系。（4）FAF1与胃癌临床病理参数的关系:FLIP的表达水平在不同年龄、性别、组织分型、病理分型、肿瘤部位、淋巴转移、远处转移、UICC分期等的各组间未见显着差异（P>0.05）,但与肿瘤大小各组间有统计学意义（P<0.05）。故此,推测,肿瘤的大小可能与FAF1的表达有关。（5）各个指标之间的相关性:FLIP与Fas、FAF1,FAF1与Fas、FasL以及FAF1与FLIP之间均无相关性（P>0.05）;FLIP与FasL之间有显着相关性（P<0.05）,故可以看出,FLIP的表达与FasL的表达之间有关,而且由于FasL在肿瘤组织中的高表达与肿瘤免疫耐受有关,所以,FLIP的高表达也可能与此有关。
徐彤[10]（2006）在《细胞因子与表达Fas配体人结肠癌细胞肝转移及浸润关系的研究》文中研究说明大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,大肠癌肝转移是影响其长期生存的重要因素。进行大肠癌根治性切除术后的病人近一半由于疾病复发在5年内死亡,绝大多数发生肝转移。大肠癌以肝转移最为常见,发生肝转移率为50%左右。大肠癌肝转移的患者仅5%～10%可得到肝切除的机会,肝转移切除术后患者5年存活率达20%～40%。绝大多数的肝转移由于肿瘤的数目、大小、位置及病人的全身状况不允许被切除。肝转移是大肠癌晚期患者死亡的主要原因。大肠癌肝转移包括多个步骤,癌细胞从原发部位侵入血管,与肝血管内皮细胞附着,穿透进入肝实质并定居。众所周知,肿瘤细胞的侵袭及其逃避机体免疫监控是肿瘤转移的要素。肿瘤转移的结果依赖于恶性细胞与宿主环境复杂的相互作用。通过改变肿瘤细胞增殖与死亡的平衡,恶性细胞与宿主环境的相互作用可影响原发癌的生长及转移。 凋亡或程序化细胞死亡在正常细胞调控中起重要作用,同时被细胞内外的各种信号所调控。Fas抗原（APO-1/CD95）与Fas配体（FasL）组成的Fas系统,在将凋亡信号转导入细胞内发挥重要作用。效应细胞FasL结合靶细胞Fas抗原后,在数小时内通过细胞凋亡途径使靶细胞死亡。近年来很多研究发现,Fas在多种细胞表面均有表达,而FasL表达只限于少量细胞类型,诸如淋巴细胞、免疫特权器官的细胞和多种恶性肿瘤细胞,同时已证实表达FasL的肿瘤周围激活的Fas阳性淋巴细胞凋亡异常增加。另一方面,肿瘤的发生在很大程度上是因为转化的细胞不能正常凋亡所致。根据早期的文献,通过表达Fas配体及对
二、FAP-1的表达与结肠癌抵抗Fas受体介导的细胞凋亡的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、FAP-1的表达与结肠癌抵抗Fas受体介导的细胞凋亡的关系（论文提纲范文）
（1）姜黄素对结肠癌细胞增殖、凋亡与转移的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 姜黄素对结肠癌细胞生长与增殖的抑制作用 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2.实验原理 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 药物及主要溶液的配制 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 实验分组 |
| 3.4 CCK-8 实验测定CUR作用结肠癌HCT-116 细胞的IC50 |
| 3.5 CCK-8 实验测定CUR作用结肠癌SW620 细胞的IC50 |
| 3.6 CCK-8 实验检测CUR对结肠癌HCT-116 细胞和SW620细胞的增殖抑制效应 |
| 3.7 平板克隆形成实验检测CUR对结肠癌HCT-116 细胞生长活力的影响 |
| 3.8 数据的统计学分析 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 CUR和5-FU对 HCT-116 细胞抑制作用的IC50 |
| 4.2 CUR和5-FU对 SW620 细胞抑制作用的IC50 |
| 4.3 CCK-8 实验检测 CUR 对结肠癌 HCT-116 细胞增殖的抑制效应 |
| 4.4 CCK-8 实验检测 CUR 对结肠癌 SW620 细胞的增殖抑制效应 |
| 4.5 CUR对结肠癌HCT-116 细胞生长与活力的影响 |
| 5.讨论 |
| 第二章 姜黄素对结肠癌细胞的增殖周期影响 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2.实验原理 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 药物及主要溶液的配制 |
| 3.2 细胞的培养 |
| 3.3 实验分组 |
| 3.4 实验步骤 |
| 3.5 数据的统计学分析 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 第三章 姜黄素诱导结肠癌细胞凋亡及其机理的研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2.实验原理 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 药物及主要溶液的配制 |
| 3.2 细胞的培养 |
| 3.3 实验分组 |
| 3.4 AO/EB 荧光双染法观察 CUR 对结肠癌细胞凋亡形态的影响 |
| 3.5 Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测 CUR 对结肠癌细胞凋亡的诱导效应 |
| 3.6 RT-qPCR方法检测CUR对结肠癌细胞Fas、FADD、caspase-8、caspase-3 m RNA表达的影响 |
| 3.7 WB方法检测CUR对 HCT-116 细胞NF-κB、Fas、FADD、caspase-8、caspase-3 蛋白表达的影响 |
| 3.8 数据的统计学分析 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 CUR对结肠癌细胞凋亡形态的影响 |
| 4.2 CUR对结肠癌细胞凋亡的诱导效应 |
| 4.3 CUR对结肠癌细胞 HCT-116 细胞 Fas、FADD、caspase-8、caspase-3等mRNA表达的影响 |
| 4.4 CUR对 HCT-116 细胞NF-κB、Fas、FADD、caspase-8、caspase-3等凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 5.讨论 |
| 第四章 姜黄素对结肠癌细胞迁移及侵袭的影响及其机理的研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株及实验动物 |
| 1.2 主要仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2.实验原理 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 药物及主要溶液的配制 |
| 3.2 细胞的培养 |
| 3.3 实验分组 |
| 3.4 细胞划痕实验检测CUR对结肠癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.5 Transwell实验检测CUR对结肠癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3.6 人工转移模型实验检测CUR对结肠癌细胞在肺中转移的影响 |
| 3.7 明胶酶谱实验检测CUR对结肠癌HCT-116 细胞MMP-9表达的影响 |
| 3.8 WB方法检测CUR对结肠癌细胞E-cadherin、Claudin-3 蛋白表达的影响 |
| 3.9 数据的统计学分析 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 CUR对结肠癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 CUR对结肠癌细胞侵袭能力的影响 |
| 4.3 CUR对结肠癌细胞在肺中转移的影响 |
| 4.4 CUR对结肠癌细胞MMP-9 表达的影响 |
| 4.5 CUR对结肠癌细胞E-cadherin、Claudin-3 蛋白表达的影响 |
| 5.讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 文献综述 姜黄素抗结直肠癌细胞的作用及相关机理的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士学位期间科研经历、学术成果及获得奖励情况 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、~(60)Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、总RNA的提取、纯化及质量评估 |
| 4、RNA的反转录 |
| 5、实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 6、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 7、RIP-seq生信分析 |
| 8、SCARNA2下调(敲低/敲除)和过表达细胞系的构建 |
| 9、蛋白凝胶电泳(Western Blot) |
| 10、中性彗星电泳(Comet Assay) |
| 11、免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 12、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| 1、RNA免疫共沉淀及高通量测序 |
| 2、ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| (二)SCARNA2的染色体定位及二级结构预测 |
| (三)SCARNA2在不同肿瘤细胞系中表达 |
| (四)结肠癌细胞在应答IR和 DNA损伤诱导剂时SCARNA2转录水平的变化 |
| 1、SCARNA2可以响应IR诱导的DNA损伤 |
| 2、SCARNA2可以响应CPT和 ETO诱导的DNA损伤 |
| (五)DDR通路抑制剂对SCARNA2表达水平的影响 |
| (六)SCARNA2下调和过表达细胞系的构建与验证 |
| (七)下调SCARNA2显着增加结肠癌细胞受到照射后的DNA损伤程度 |
| (八)下调SCARNA2显着抑制照后结肠癌细胞的DNA损伤修复过程 |
| (九)SCARNA2对DNA损伤修复信号通路的影响 |
| 1、下调SCARNA2可以抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 2、下调SCARNA2可以抑制由CPT和 ETO诱导的DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 LncRNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、真核RNA-seq测序 |
| 2、构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统 |
| 3、RNA pull down-MS |
| 4、蛋白免疫共沉淀(IP) |
| 5、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)敲除SCARNA2对照后基因转录组的影响 |
| 1、文库质检 |
| 2、基因表达相关性分析 |
| 3、基因差异表达分析 |
| 4、差异表达基因的GO富集分析 |
| 5、差异表达基因的KEGG富集分析 |
| (二)SCARNA2主要通过HR通路修复DNA损伤 |
| (三)下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2 的募集 |
| (四)SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定 |
| (五)下调SCARNA2可以影响ATR与 HR通路相关蛋白的互作 |
| (六)下调SCARNA2抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 LncRNA SCARNA2促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌放疗敏感性 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、实验动物 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、SABER-ISH探针信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、克隆形成率 |
| 2、细胞凋亡 |
| 3、细胞增殖/细胞活力 |
| 4、细胞周期 |
| 5、构建裸鼠皮下荷瘤(CDX)模型 |
| 6、移植瘤体内注射慢病毒载体方法 |
| 7、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 8、石蜡切片制作实验 |
| 9、石蜡切片免疫组化实验 |
| 10、石蜡切片荧光TUNEL实验 |
| 11、组织芯片荧光原位杂交(FISH) |
| 12、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)下调SCARNA2可以降低由IR和 DNA损伤剂诱导的细胞存活率 |
| (二)下调SCARNA2可以增加照射和DNA损伤剂诱导的细胞凋亡 |
| (三)下调SCARNA2可以降低照射后结肠癌细胞的增殖能力和细胞活力 |
| (四)下调SCARNA2可以显着抑制结肠癌细胞经照射和DNA损伤剂诱导的G2/M期阻滞 |
| (五)SCARNA2对结直肠癌荷瘤模型放射敏感性的影响 |
| 1、构建裸鼠皮下荷瘤模型 |
| 2、移植瘤内多点注射慢病毒模型构建成功 |
| 3、下调SCARNA2可以抑制照后裸鼠皮下肿瘤细胞的增殖 |
| 4、下调SCARNA2可以促进照后结肠癌肿瘤细胞的凋亡 |
| 5、下调SCARNA2可以抑制照后结直肠癌肿瘤组织的HR修复 |
| (六)SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着 |
| 三、讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 附表一、RIP-seq数据分析软件及参数列表 |
| 附表二、RIP-seq数据库信息 |
| 附表三、RNA-seq测序质量预处理结果 |
| 附表四、ATR结合相关lncRNA列表(前100 位) |
| 附表五、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表六、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表七、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表八、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表九、RNA pulldown-MS鉴定的差异蛋白列表 |
| 文献综述 lncRNA在DNA损伤诱导的细胞周期检查点激活中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路研究藤黄酸B对胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 1.4 动物 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MA的提取分离纯化、含量测定及稳定性考察 |
| 2.1.1 MA的提取分离纯化及含量测定 |
| 2.1.2 MA的稳定性考察 |
| 2.2 MA抗胃癌活性及其对caspase-3依赖凋亡及焦亡影响的体外研究 |
| 2.2.1 受试药物配制 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 MTT法检测MA对不同胃癌细胞株体外增殖的抑制作用 |
| 2.2.4 划痕实验观察胃癌细胞迁移 |
| 2.2.5 Annexin V-PI双染法测定胃癌细胞凋亡率 |
| 2.2.6 Western-blot测定胃癌细胞中caspase-3依赖凋亡相关蛋白表达 |
| 2.2.7 荧光倒置显微镜观察胃癌细胞的焦亡 |
| 2.2.8 乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定胃癌细胞LDH释放率 |
| 2.2.9 Western-blot测定胃癌细胞中caspase-3依赖焦亡相关蛋白表达水平 |
| 2.3 MA抗胃癌活性及其对caspase-3依赖凋亡及焦亡影响的体内研究 |
| 2.3.1 受试药物配制 |
| 2.3.2 BALB/c小鼠胃癌皮下异位移植模型的制备 |
| 2.3.3 动物分组、给药与处理 |
| 2.3.4 小鼠胃癌皮下异位移植模型中观察MA对肿瘤生长的影响 |
| 2.3.5 HE染色法观察肿瘤组织病理形态 |
| 2.3.6 免疫组化检测胃癌模型小鼠胃癌细胞增殖 |
| 2.3.7 Western-blot测定胃癌组织中caspase-3依赖凋亡相关蛋白表达水平 |
| 2.3.8 Western-blot测定胃癌组织中caspase-3依赖焦亡相关蛋白表达水平 |
| 2.4 MA促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的分子机制研究 |
| 2.4.1 受试药物配制 |
| 2.4.2 细胞培养 |
| 2.4.3 RT-qRCR检测MA对于胃癌细胞及肿瘤组织中lncRNA GAS5表达的影响 |
| 2.4.4 siRNA建立lncRNA GAS5低表达胃癌瞬转细胞株 |
| 2.4.5 lncRNA GAS5低表达胃癌瞬转细胞分组与给药 |
| 2.4.6 Annexin V-PI双染法测定lncRNA GAS5低表达胃癌细胞凋亡率 |
| 2.4.7 荧光倒置显微镜观察lncRNA GAS5低表达胃癌细胞焦亡 |
| 2.4.8 乳酸脱氢酶(LHD)试剂盒测定lncRNA GAS5低表达胃癌细胞LDH释放率 |
| 2.4.9 RT-qPCR测定lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5/mi R-23a/Apaf-1通路相关RNA水平 |
| 2.4.10 Western-bolt实验测定lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路相关蛋白表达 |
| 2.4.11 shRNA构建lncRNA GAS5低表达胃癌稳转细胞株 |
| 2.4.12 lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型的制备 |
| 2.4.13 lncRNA GAS5低表达动物分组与给药 |
| 2.4.14 lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型中观察MA对皮下移植瘤生长的影响。 |
| 2.4.15 RT-qPCR测定lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路相关RNA水平 |
| 2.4.16 Western-bolt实验测定lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路相关蛋白表达 |
| 2.5 数据结果分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MA的提取分离纯化、含量测定及稳定性考察 |
| 3.1.1 MA提取分离纯化及含量测定 |
| 3.1.2 MA的稳定性考察 |
| 3.2 MA抗胃癌活性及其对caspase-3依赖凋亡及焦亡影响的体外研究 |
| 3.2.1 MA对不同胃癌细胞株体外增殖的抑制作用 |
| 3.2.2 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞迁移能力的影响 |
| 3.2.3 进一步研究中受试细胞系的选择 |
| 3.2.4 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞凋亡率的影响 |
| 3.2.5 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.2.6 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞焦亡形态的影响 |
| 3.2.7 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞LDH释放的影响 |
| 3.2.8 MA对胃癌MKN-45及MFC细胞中焦亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.3 MA抗胃癌活性及其对caspase-3 依赖凋亡及焦亡影响的体内研究 |
| 3.3.1 MA对胃癌模型小鼠体内肿瘤生长的影响 |
| 3.3.2 MA对于胃癌模型小鼠体内肿瘤组织病理形态的影响 |
| 3.3.3 MA对胃癌模型小鼠体内肿瘤细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 MA对胃癌组织中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.3.5 MA对胃癌组织中焦亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 MA通过lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡和焦亡 |
| 3.4.1 MA对胃癌细胞及肿瘤组织中lncRNA GAS5表达的影响 |
| 3.4.2 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌细胞凋亡率的影响 |
| 3.4.3 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌细胞焦亡形态的影响 |
| 3.4.4 MA对于lncRNA GAS5低表达胃癌细胞LDH释放的影响 |
| 3.4.5 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5,miR-23a以及Apaf-1 mRNA水平的影响 |
| 3.4.6 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDME-NT、Apaf-1以及IL-18 蛋白表达的影响 |
| 3.4.7 lncRNA GAS5低表达稳定转染细胞株构建的最优条件 |
| 3.4.8 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌皮下移植瘤生长的影响 |
| 3.4.9 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5,miR-23a以及Apaf-1 mRNA水平的影响 |
| 3.4.10 MA对lncRNA GAS5低表达胃癌组织中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDME-NT、Apaf-1以及IL-18 蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MA抑制胃癌细胞增殖和迁移 |
| 4.2 MA体外诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡 |
| 4.3 MA体外诱导胃癌细胞caspase-3依赖焦亡 |
| 4.4 小鼠胃癌皮下异位移植模型的制备 |
| 4.5 MA抑制胃癌模型小鼠体内肿瘤的生长 |
| 4.6 MA体内诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡 |
| 4.7 MA上调胃癌细胞及肿瘤组织中lncRNA GAS5水平 |
| 4.8 MA通过lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡,抑制小鼠体内肿瘤的生长 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 Antitumor effects and mechanisms related to the induction of programmed tumor cell death by active components in Resina Garciniae |
| Reference |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（4）PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 PAI-1在肝癌中的临床意义 |
| 1.实验材料及方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.3 S-P(streptavidin-perosidase)法免疫组织化学技术 |
| 1.4 IHC切片定性及定量方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 生物信息学分析PAI-1在肝癌组织中m RNA水平表达 |
| 2.2 生物信息学分析PAI-1在肝癌患者预后 |
| 2.3 IHC检测PAI-1在临床HCC患者中的表达情况及生存预后 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三章 PAI-1在肝癌细胞系中的作用及介导anoikis现象的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 构建悬浮细胞模型 |
| 2.2 细胞培养、传代、冻存 |
| 2.3 RT-PCR(适时定量聚合酶链扩增反应) |
| 2.4 Western Blot(蛋白印迹)检测 |
| 2.5 RNAi慢病毒构建与过表达慢病毒构建 |
| 2.6 流式Annexin V-FITC/PI法检测HCC细胞系anoikis表型 |
| 2.7 划痕实验验证PAI-1在HCC细胞系中的增殖、迁移表型 |
| 2.8 Transwell实验验证PAI-1在HCC细胞系中的浸润、转移表型 |
| 2.9 CCK8测定PAI-1在HCC细胞中增殖表型以及筛选PAI-1抑制剂IC50 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 PAI-1在肝癌细胞系中表达水平 |
| 3.2 验证待遴选肝癌细胞系悬浮表型 |
| 3.3 PAI-1在遴选细胞系中敲减/过表达细胞悬浮后蛋白表达水平 |
| 3.4 PAI-1调控HCC细胞系的anoikis表型 |
| 3.5 PAI-1调控HCC细胞的浸润转移表型 |
| 3.6 PAI-1抑制剂回复HCC细胞的浸润转移表型 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四章 PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控HCC细胞AR及生物信息学工具预测PAI-1调控相关蛋白的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 PAI-1通过激活PTEN调控PI3K/AKT信号通路来调控HCC细胞AR表型 |
| 3.2 PTEN特异性抑制剂(bpV(HOpic))回复PAI-1调控PTEN蛋白来激活/失活PI3K/AKT信号通路来调控HCC细胞AR表型 |
| 3.3 生物信息学工具预测PAI-1在HCC调控互作蛋白 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第五章 体内验证PAI-1调控HCC细胞AR表型 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验器械 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物蛋白提取 |
| 2.2 构建肝癌细胞肝内转移模型及标本处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 构建PAI-1调控体内肝癌细胞转移瘤(cell-line-derived xenograft,CDX)模型 |
| 3.2 体内验证PAI-1表达影响肝癌细胞转移瘤(cell-line-derived xenograft,CDX)模型的小鼠生存周期 |
| 3.3 体内验证PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控HCC浸润转移表型 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 PAI-1在肿瘤浸润转移中作用的研究 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）输注FasL基因转染的血管内皮细胞抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 序言 |
| 第一章 Fas/FasL系统及其在维持T细胞稳态、细胞毒性效应尤其是肿瘤免疫和移植免疫中的作用 |
| 1.1 Fas和FasL的结构和功能介绍 |
| 1.2 FasL-Fas信号途径诱导凋亡的机制 |
| 1.3 FasL在维持免疫稳态中的作用 |
| 1.4 FasL与细胞介导的细胞毒性 |
| 1.5 FasL的转录水平和转录后调控 |
| 1.5.1 FasL转录水平的调控 |
| 1.5.2 FasL的转录后调控 |
| 1.6 Fas反击和肿瘤的免疫豁免 |
| 1.6.1 直接的肿瘤Fas反击：体外和体内的证据 |
| 1.6.2 肿瘤抵抗Fas介导的凋亡 |
| 1.7 Fas/FasL通路与移植免疫耐受 |
| 1.7.1 异体来源的胰岛细胞与FasL阳性细胞共同移植 |
| 1.7.2 FasL基因转染树突状细胞 |
| 1.7.3 FasL基因转染肝细胞 |
| 1.7.4 FasL基因转染造血细胞 |
| 1.7.5 FasL基因转染CD34+细胞 |
| 1.7.6 FasL基因转染内皮细胞 |
| 1.8 结语 |
| 第二章 FasL慢病毒载体的构建 |
| 2.1 FasL ORF克隆构建的实验报告 |
| 2.1.1 实验目的 |
| 2.1.2 实验材料与设备 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 实验结果 |
| 2.2 Lenti-rFasl/puro的包装 |
| 2.2.1 实验目的 |
| 2.2.2 材料报表 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 转染效果 |
| 2.2.5 实验结果 |
| 2.3 MBS101017H01病毒滴度检测报告 |
| 2.3.1 实验目的 |
| 2.3.2 实验材料 |
| 2.3.3 实验方法 |
| 2.3.4 实验结果 |
| 2.3.5 实验结果判定 |
| 2.3.6 实验结论 |
| 第三章 Wistar大鼠血管内皮细胞的培养及FasL基因的转染 |
| 3.1 大鼠主动脉内皮细胞的分离培养鉴定 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 培养方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.1.4 结果讨论 |
| 3.2 管内皮细胞的转染 |
| 3.2.1 实验目的 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 实验结果 |
| 第四章 大鼠急性肝移植排斥反应模型的建立 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 大鼠肝移植手术方法 |
| 4.3.1 供体手术 |
| 4.3.2 供肝准备 |
| 4.3.3 受体手术 |
| 4.3.4 大鼠肝移植的手术操作技巧 |
| 4.4 数据收集与分析 |
| 4.5 术后各组大鼠生存状态和病理检查 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 输注转染FasL基因的内皮细胞对大鼠肝移植急性排斥反应的抑制作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 我们的实验和结果讨论 |
| 5.2.1 研究背景及引论 |
| 5.2.2 材料与方法 |
| 5.2.3 实验结果 |
| 5.2.4 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文 |
| SCI接收函 |
（6）结肠癌SW480细胞FAP-1表达与奥沙利铂化疗耐药关系的研究（论文提纲范文）
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 细胞与细胞培养 |
| 1.2 细胞生长曲线检测 |
| 1.3 RNA提取RNA 提取用将TRIZOL (Invitrogen) 法。 |
| 1.4 RT-PCR |
| 1.5 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MTT检测奥沙利铂对结肠癌SW480细胞增殖的影响 |
| 2.2 化疗压力下SW480表达上调 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（7）塞来昔布抗胃癌作用机制及Fas、FasL在胃癌中表达意义的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 塞来昔布抑制BGC-823胃癌细胞增殖及对p16和p21表达的影响 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 塞来昔布诱导BGC-823胃癌细胞凋亡及对Fas、FasL、Bcl-2表达的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 Fas、FasL在胃癌及淋巴结组织中的表达及意义 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 Fas、FasL与肿瘤 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（8）非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究（论文提纲范文）
| 英文缩写索引 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文非小细胞肺癌FasL 和Caspase-3 表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究 |
| 前言 |
| 第一部分 非小细胞肺癌FasL、Caspase-3 蛋白表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 肿瘤浸润淋巴细胞上清液对FasL、Caspase-3 表达的影响 |
| 分题一 A549 细胞特异性肿瘤浸润性淋巴细胞构建 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 分题二 肿瘤浸润淋巴细胞上清液对Fasl，、Caspase-3 表达的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分NSCLC 肿瘤浸润淋巴细胞凋亡及其与FasL 表达的关系 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 图片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Fas／FasL 系统在肿瘤发展过程中的生物学作用参考文献 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 肿瘤免疫逃避机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（9）FLIP、FAF-1在胃癌中的表达及与Fas/FasL介导的免疫逃逸的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 FLIP、FAF-1 在胃癌中的表达及与 Fas/FasL介导的免疫逃逸的相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Fas 凋亡途径相关抑制因子以及其在肿瘤免疫耐受中的作用 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）细胞因子与表达Fas配体人结肠癌细胞肝转移及浸润关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 细胞因子促进表达Fas配体人结肠癌细胞免疫逃逸 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 大肠癌肝转移中Fas／FasL的相互作用与细胞因子关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述1：大肠癌肝转移的研究进展 |
| 综述2：Fas／FasL与肿瘤关系研究的进展 |
| 致谢 |
四、FAP-1的表达与结肠癌抵抗Fas受体介导的细胞凋亡的关系（论文参考文献）
- [1]姜黄素对结肠癌细胞增殖、凋亡与转移的影响及机制研究[D]. 向磊. 湖北中医药大学, 2021(09)
- [2]长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制[D]. 陈媛媛. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]基于lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路研究藤黄酸B对胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响及机制[D]. 贾步云. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [4]PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究[D]. 陶鹏先. 兰州大学, 2021(09)
- [5]输注FasL基因转染的血管内皮细胞抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究[D]. 刘伟. 中南大学, 2012(12)
- [6]结肠癌SW480细胞FAP-1表达与奥沙利铂化疗耐药关系的研究[J]. 肖治宇,李祖勇,吴畏,伍刚,姚和瑞. 岭南现代临床外科, 2009(04)
- [7]塞来昔布抗胃癌作用机制及Fas、FasL在胃癌中表达意义的研究[D]. 李乾. 中南大学, 2009(02)
- [8]非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究[D]. 徐银祥. 第三军医大学, 2007(03)
- [9]FLIP、FAF-1在胃癌中的表达及与Fas/FasL介导的免疫逃逸的相关性研究[D]. 王健莉. 河北医科大学, 2007(06)
- [10]细胞因子与表达Fas配体人结肠癌细胞肝转移及浸润关系的研究[D]. 徐彤. 天津医科大学, 2006(09)