一、科学家发现一种炭疽毒素的结构（论文文献综述）
丁双飞[1]（2020）在《牙鲆炎症小体关键组件分子JfNLRP3鉴定及功能初步研究》文中认为先天性免疫系统是宿主应对外部病原威胁的重要屏障,其不仅可以抵御感染侵害和维持机体稳态,也在激活获得性免疫发挥重要作用。炎症小体是先天性免疫系统的重要组成部分,近年来对其已有较为深入的研究。经典炎症小体作为炎症系统激活过程中重要一环,已被广泛应用于生物医学致病机理研究、医药研发、疫苗开发等领域。经典炎症小体组分主要由胞内识别受体NLRP3（NOD-like receptor protein 3）、接头蛋白凋亡相关斑点样颗粒（Apoptosis associated speck like protein containing CARD,ASC）和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶caspase-1组成。NLRP3是炎症小体激活过程中的关键蛋白,主要由PYD、NATCH和LRR结构域组成。当宿主感应病原威胁时,NLRP3会响应外部刺激转变为活性形式,通过PYD-PYD结构域同源配对结合下游蛋白ASC,进而再一次以相似的蛋白结合方式（CARD-CARD同源结合）招募效应蛋白caspase-1,最后诱导IL-1β和IL-18等炎症因子的成熟和释放。由于硬骨鱼中经典炎症小体的激活机制研究稀缺,因此本论文拟以海水养殖经济鱼种牙鲆为研究模型,发现并鉴定牙鲆炎症小体关键组分,并初步探究其在抗菌感染过程中发挥何种效应,为水产养殖鱼类的病害防控提供新的免疫靶点。以哺乳动物中已经解析的炎症小体组装机制为研究模型,本文通过基因筛选技术从牙鲆130多个NLRs蛋白中寻找到一个含有PYD结构域的NLRP蛋白,命名为JfNLRP3。采用基因克隆技术得到牙鲆炎症小体通路的主要组件的编码基因,包括JfNLRP3、JfASC、Jfcaspase-1和Jfpro-IL-1β。通过多序列比对和进化树分析发现,不同物种中NLRP的N端相对保守,且牙鲆的JfNLRP3和大菱鲆亲缘关系最为接近。牙鲆JfNLRP3序列在整个生物进化过程中相对保守,均具有典型的PYD结构域、NATCH和LRR结构域,这些保守的蛋白结构与为牙鲆JfNLRP3经典炎症小体的组装与激活提供了结构基础。鉴于哺乳动物NLRP3在炎症小体信号途径中发挥了识别响应信号及衔接下游蛋白的功能,本论文探索了JfNLRP3在牙鲆活体经典炎症小体信号通路中所发挥的作用。首先,在HEK293T细胞中过表达JfNLRP3蛋白,采用荧光标记法发现,JfNLRP3蛋白能够在细胞内均匀表达,并且通过PYD结构域与下游衔接蛋白ASC直接结合,出现多聚合斑点的现象。接着采用免疫共沉淀的方法证实,JfNLRP3的PYD结构域在ASC寡聚化过程中发挥关键作用。最后使用酶联免疫吸附测定法和免疫蛋白印迹法证实,JfNLRPP3对效应蛋白caspase-1和促炎症因子IL-1β的活化至关重要。为了进一步探索JfNLRP3在牙鲆抗细菌感染中的作用,首先分析了牙鲆不同脏器中JfNLRP3的转录水平,结果表明JfNLRP3在肝和鳃中有较高表达。接着,将杀鱼爱德华氏菌腹腔注射牙鲆活体发现,牙鲆不同器官中JfNLRP3表达量均有明显上调,证实其可能参与牙鲆抗细菌感染过程。然后,活体注射牙鲆JfNLRP3敲降质粒siRNA,并再一次进行杀鱼爱德华氏菌腹腔注射感染,发现细菌定植量明显增多。同时,活体注射JfNLRP3真核表达质粒对牙鲆JfNLRP3进行过表达,再次腹腔注射感染杀鱼爱德华氏菌,发现JfNLRP3过表达鱼体中细菌的定植显着减少,证实牙鲆JfNLRP3可以显着降低杀鱼爱德华氏菌在牙鲆活体不同脏器中的定植水平。综上所述,本论文鉴定了牙鲆经典炎症小体信号的识别受体JfNLRP3,在细胞水平解析了它的分子功能,并在动物水平证实其在牙鲆抗细菌感染过程中发挥了重要作用。上述工作为深入理解先天免疫信号在牙鲆抗感染免疫中的作用机制奠定了基础。
柳颖[2]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中研究指明目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
张玲艳,宋丽丽,贾伟娟,王学理[3]（2020）在《炭疽芽孢杆菌的研究进展》文中研究指明炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）简称炭疽杆菌,可引起人畜共患传染病炭疽（Anthrax）,该菌主要感染牛、羊等家畜,感染人的概率较低。近年来,我国许多地区均有炭疽病的发生,给我国养殖业带来了巨大的经济损失。文章主要就炭疽芽孢杆菌的生物学特性、毒力因子、致病机理、检测方法等进行综述,以期为该病的深入研究提供参考。
陈露露[4]（2020）在《A塞内卡病毒的分离鉴定及其VP3单抗的制备》文中进行了进一步梳理A型塞内卡病毒（SenecavirusA,SVA）是小核糖核酸病毒科,Senecavirus属的唯一成员。SVA感染引起新生仔猪跛行、嗜睡、厌食、急性死亡及特征性水疱病症状。目前已有加拿大、哥伦比亚、美国、巴西、中国、越南、泰国等多个国家报道了 SVA疫情。2015年以来,我国广东、湖北、福建、湖北等14个省份相继暴发SVA疫情。研究表明目前国内流行的SVA毒株正在发生变异,部分毒株已发生重组。最新研究发现SVA似乎获得了比以前更强的致病性和传播能力。然而,中国SVA毒株的流行病学信息还有待补充,特别是SVA致病性毒株的信息仍然非常缺乏。因此,本研究分离鉴定了两株中国的SVA毒株,从亲缘关系、基因组水平以及致病性上分析毒株的差异。制备了能够特异性识别VP3蛋白的单克隆抗体,并鉴定其抗原表位,为SVA新型诊断试剂的研制和该病毒的有关研究工作提供了有力的免疫学工具。具体内容如下:1 A型塞内卡病毒的分离鉴定、基因组测序及遗传进化分析本研究对2017～2018年来自广东若干生猪养殖场的疑似病料进行病毒分离与全基因组测序,并将分离的2株SVA毒株命名为GD04/2017和GD-S5/2018（GenBank登录号:MH316113、MK463618）。病毒生长曲线分析显示两个毒株具有相似的动力学曲线特征,GD-S5/2018毒株的病毒滴度略高于GD04/2017毒株。空斑实验显示两个毒株均能在猪源细胞系上形成可见的空斑,GD-S5/2018毒株形成的空斑略大,与病毒生长曲线结果一致。将本研究分离毒株GD-S5/2018、GD04/2017与美国分离的致病性毒株SVA SD15-26、原型毒株SVV-001进行ORF基因组和多肽序列的分析比较。基于ORF和VP1编码区序列的系统发育树分析,结果显示GD-S5/2018和SVA SD15-26属于同一遗传分支,GD04/2017属于另一个分支,而SVV-001与所有其他SVA毒株亲缘关系最远。GD-S5/2018与SVASD15-26毒株显示出最高的氨基酸相似性,提示两个毒株在致病性上或存在相似。GD04/2017株在5’ UTR的第290位有一个核苷酸的插入,299-309位核苷酸有11个核苷酸的较大插入,这是首次报道SVA 5’UTR区存在一段核苷酸插入。2 A型塞内卡病毒分离毒株的致病性分析为了研究分离的SVA毒株（GD-S5/2018和GD04/2017）的致病性,进行了猪体攻毒实验。结果表明,2株SVA毒株均成功感染所有猪只。在GD-S5/2018毒株感染组的猪只中观察到舌头和牙龈上的水疱及溃疡性病变等特征性临床症状。然而,GD04/2017毒株感染组猪只除了表现出萎靡不振外,没有观察到其它临床症状。在感染后1-3天内,GD-S5/2018感染组鼻拭子中的病毒含量高于GD04/2017感染组。在感染后1-6内,GD-S5/2018组的体温高于GD04/2017组。将病毒感染组的猪血清与GD04/2017、GD-S5/2018、GD05/2017进行同源与异源地中和,结果显示各毒株均引起猪体高水平的中和抗体反应。同源毒株感染组的猪血清针对同源毒株的中和抗体水平高于异源毒株,揭示了 SVA毒株之间存在抗原性差异,在未来的SVA流行病学研究中这种差异值得关注。3 A型塞内卡病毒VP3蛋白单抗的制备及其抗原表位鉴定本研究将截短的VP3片段序列插入pCold Ⅱ原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达得到目的融合蛋白。将纯化后的蛋白免疫小鼠,三次免疫后小鼠多抗血清IFA检测结果为阳性。然后,将小鼠脾淋巴细胞与杂交瘤经细胞融合,通过阳性筛选及亚克隆获得能够稳定分泌针对SVAVP3蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。Western Blot与IFA试验结果表明,该腹水单抗能特异性地识别SVAVP3蛋白。进一步,对该单抗识别的抗原表位进行鉴定。将抗原蛋白的基因序列在真核细胞中进行分段表达,然后利用Western Blot鉴定单克隆抗体能够识别的最小片段。结果显示,单抗识别SVAVP3蛋白的第191-201位氨基酸序列（191DGWFSLHKLTK201）,该表位序列在所有SVA毒株VP3蛋白中高度保守。SVA VP3蛋白单克隆抗体的成功制备与抗原表位的精确鉴定,为SVA新型诊断试剂的研制和该病毒的有关研究工作提供了有力的免疫学工具。
彭海燕[5]（2020）在《2014-2015年云南分离炭疽芽胞杆菌遗传特征分析》文中指出目的对2014-2015年云南省分离的炭疽芽胞杆菌进行分子分型及溯源分析,以了解其遗传特征及基因型别,为炭疽防控提供科学依据。方法以2014年弥渡县分离的1株炭疽菌株（命名为YN1）及2015年东川区分离的2株炭疽菌株（分别命名为YN2及YN3）为试验菌株,提取炭疽菌基因组DNA,采用标准单核苷酸多态性分析（canSNP）和多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA15分析,位点依次为VrrA,VrrB1,VrrB2,VrrC1,VrrC2,CG3,PXO1-aat,PXO2-at,VNTR12,VNTR16,VNTR17,VNTR19,VNTR23,VNTR32及VNTR35两种分子分型方法进行分析,并以中国炭疽菌株分子分型库为参照进行分型及聚类分析;同时通过二代测序方法测定这3株炭疽菌株的全基因组序列,并进行初步分析。结果1.canSNP结果:YN1菌株基因组在A.Br.001,A.Br.002,A.Br.003,A.Br.004,A.Br.006,A.Br.007,A.Br.008,A.Br.009,B.Br.001,B.Br.002,B.Br.003,B.Br.004,A/B.Br.001（13个SNP）位点的核苷酸特征为T,A,G,C,A,T,T,A,T,G,G,T;YN1菌株属于A.Br.001/002组;YN2和YN3炭疽菌株基因组在A.Br.001,A.Br.002,A.Br.003,A.Br.004,A.Br.006,A.Br.007,A.Br.008,A.Br.009,B.Br.001,B.Br.002,B.Br.003,B.Br.004,A/B.Br.001（13个SNP）位点的核苷酸特征为T,A,G,C,A,T,T,A,T,G,G,T,A;YN2和YN3炭疽菌株属于A.Br.001/002组。2.MLVA15结果:针对15个VNTR位点,YN1扩增产物片段大小依次为314bp,229bp,162bp,580bp,532bp,158bp,135bp,141bp,115bp,273bp,378bp,96bp,197bp,577bp,115bp;YN2和YN3依次皆为314bp,229bp,162bp,580bp,532bp,158bp,132bp,141bp,115bp,273bp,386bp,96bp,197bp,577bp,115bp。YN1炭疽菌株单独形成一个分支,为新的基因型,命名为MLVA15-CHN51基因型,YN2、YN3炭疽菌株为MLVA15-6基因型。3.全基因组测序:YN1炭疽菌基因组的大小为5.74Mb,含有5948个基因,基因平均长度为778nt,G+C含量为35.1%,包含90个转运核糖核酸、11个5SrRNA基因、1个23SrRNA,有324个串联重复序列,7个前噬菌体基因,21个基因岛;YN2炭疽菌基因组的大小为5.58Mb,含有6,202个基因,基因平均长度为778nt,G+C含量为35.1（%）,包含92个转运核糖核酸、11个5SrRNA基因、1个23SrRNA,有352个串联重复序列,8个前噬菌体基因,19个基因岛;YN3炭疽菌基因组的大小为5.2Mb,含有5931个基因,基因平均长度为776nt,G+C含量为35.1（%）,包含90个转运核糖核酸、11个5SrRNA基因、1个16SrRNA、1个23SrRNA,有325个串联重复序列,9个前噬菌体基因,21个基因岛。结论本研究发现YN1菌株为一个新的基因型,命名为MLVA15-CHN51。YN2和YN3炭疽菌株canSNP基因型相同,聚类分析显示聚在同一分支,MLVA15基因型相同,结合2015年炭疽暴发的流行病学调查,我们可以推断本次暴发流行的病人感染了同一传染源。3株菌株在基因组水平上都存在一定差异,值得进一步探讨。
曹堃[6]（2020）在《TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究》文中指出一、课题背景胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤,其侵袭性及增殖能力较强,具有高发病率、高术后复发率、高病死率及低治愈率的特点,是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。并且,恶性胶质瘤难以通过手术根治且对放化疗普遍不敏感,同时,现有的恶性胶质瘤放射增敏剂普遍存在着增敏效果差、毒副作用大等缺陷,且其放射增敏效果仍然存在争议,难以满足临床上胶质瘤放射增敏的需求。因此,寻找恶性胶质瘤放射增敏的新靶点,进一步提高恶性胶质瘤的放疗效果,具有十分重要的临床意义。在肿瘤放疗领域的研究中,放疗抵抗的产生机制尚未完全清楚,高效的放射增敏新基因的研究亟待加强。近年来,随着肿瘤生物学和放射肿瘤学的发展,针对肿瘤放射敏感性相关基因的靶向治疗成为研究热点,而全基因组筛选文库有望从人类全基因组的角度筛选出更高效的肿瘤放射增敏靶点。CRISPR Cas9技术是近年来发展迅速的一项基因编辑技术,在此基础上构建的CRISPR Cas9人类全基因组文库为筛选肿瘤放射增敏新靶点提供了新的方法。本研究中,我们使用CRISPR Cas9人类全基因组文库感染了恶性人脑胶质瘤细胞,并通过高通量测序阴性筛选的方法,发现了放射增敏新靶点TTC9C,并进一步在细胞学、动物学、临床层面验证了其放射增敏效果,并对其影响放射敏感性的分子机制进行了深入探究。二、研究内容及方法1、CRISPR Cas9全基因组文库筛选肿瘤放射增敏新靶点本研究首先使用文库感染U87MG细胞后,给予γ射线照射处理,之后使用阴性筛选策略,通过高通量测序获得差异基因作为候选。接下来,使用不同组织来源的肿瘤细胞系构建候选基因的敲低细胞系,进一步通过克隆形成率、细胞凋亡、DNA损伤修复通路检测等手段验证候选靶基因的放射增敏效果,并从中选出了放射增敏效果最佳的靶基因TTC9C。2、TTC9C对胶质瘤细胞放射敏感性的调控作用研究选取不同来源背景的胶质瘤细胞系,构建其TTC9C敲除、过表达稳转细胞,通过肿瘤细胞的增殖、迁移、克隆形成率、凋亡、周期、免疫荧光、DNA损伤修复通路检测等方式,进一步明确其放射增敏效果,并初步探索TTC9C对DNA损伤修复的影响。3、TTC9C对颅内胶质瘤放射敏感性的影响及临床研究构建裸鼠颅内胶质瘤放疗模型,通过生存率观察、脑组织解剖、病理切片、免疫组化等方式,进一步明确了TTC9C敲除在颅内胶质瘤中的放射增敏效果,并验证其对HR修复通路的抑制作用。接下来,通过生物信息学分析等手段,进一步探究了TTC9C在胶质瘤等肿瘤中的表达特征、与HR修复蛋白的共表达关系等,进一步明确TTC9C的生物学作用与功能。4、TTC9C对胶质瘤放射敏感性的调控机制研究本研究使用DSBs foci的方法,检测TTC9C照后于DSBs断端的募集情况,判断其是否直接募集于DNA断端直接发挥作用。接下来,通过免疫共沉淀与Western Blot,检测照后TTC9C是否发生了相应的蛋白分子修饰。进一步通过IP质谱明确TTC9C的互作蛋白与DNA损伤修复的关系,进而通过Co-IP与Western Blot的方法明确其直接作用的分子为ATR。接下来,通过构建ATR的不同截断体,明确TTC9C与ATR结合的具体功能域。三、研究结果:本研究主要结果如下:1、在人类全基因组范围内,成功筛选出了胶质瘤放射增敏新靶点TTC9C:（1）使用CRISPR Cas9人类全基因组文库成功感染了人脑胶质瘤细胞U87MG;（2）通过高通量二代测序及文献调研等方法选取了TTC9C等5个候选基因;（3）验证了5个候选基因的放射增敏效果,确定TTC9C为目标靶基因。2、体外实验中,TTC9C敲除在胶质瘤细胞中发挥了显着的放射增敏效应:（1）TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的增殖能力;（2）TTC9C敲除显着减弱胶质瘤细胞的迁移能力;（3）TTC9C敲除显着降低胶质瘤细胞的照后活力;（4）TTC9C敲除显着减少胶质瘤细胞的照后存活率;（5）TTC9C敲除显着促进胶质瘤细胞的照后凋亡;（6）TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的照后DNA损伤修复;（7）TTC9C敲除显着抑制照后DNA损伤修复通路的激活。3、体内实验中,TTC9C敲低在颅内胶质瘤放疗中发挥了显着的放射增敏作用,进一步研究显示,TTC9C在包括胶质瘤在内的多种肿瘤的发生发展中发挥了重要作用:（1）TTC9C敲除在颅内胶质瘤中发挥了显着的放射增敏效果,显着延长荷瘤裸鼠的照后生存时间、减小颅内胶质瘤的照后体积、抑制颅内胶质瘤的照后增殖能力、促进颅内胶质瘤的照后凋亡、抑制颅内胶质瘤的照后HR修复;（2）TTC9C与胶质瘤患者预后和HR修复信号通路密切相关,TTC9C表达量显着影响胶质瘤等癌症患者的预后、TTC9C与HR相关蛋白的表达具有显着的相关性。4、TTC9C与ATR结合,直接参与了照后DNA损伤的HR修复:（1）电离辐射可导致TTC9C核内募集;（2）TTC9C在照后发生磷酸化修饰;（3）TTC9C与ATR等HR修复通路相关蛋白结合发挥作用;（5）TTC9C与ATR的N端结合。五、结论:本研究通过CRISPR Cas9全基因组文库筛选发现了胶质瘤放射增敏新靶点TTC9C,并在细胞和动物模型中明确了其放射增敏作用。机制研究发现,TTC9C通过与ATR结合,参与电离辐射导致的DNA损伤的HR修复,从而影响人脑胶质瘤的放射敏感性。我们的结果提示,TTC9C在人脑胶质瘤细胞放疗中具有巨大的潜在应用价值。
蔡瑞丽[7]（2018）在《鼠抗人CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用》文中研究表明毛细血管形态发生基因2（capillary morphogenesis gene 2,CMG2）,为I型跨膜蛋白,全长形式由489个氨基酸组成(CMG2489),基因定位于4q21。CMG2最初由于其参与毛细血管的发生而被发现,后来被证实为炭疽毒素的第二种受体,故又称为炭疽毒素受体2（anthrax toxin receptor 2,ANTXR2）。尽管CMG2的确切生理功能尚未明了,但业已证明,该基因的突变可引起幼年透明性纤维瘤病（Juvenile Hyaline Fibromatosis）和小儿玻璃样纤维瘤病（Infantile Hyaline Fibromatosis）。近年来,CMG2在肿瘤中的作用已引起关注。本课题组前期研究发现,CMG2在胃癌组织高表达,是一个新的功能性的胃癌干细胞（gastric cancer stem cells,GCSCs）表面标志物,参与胃癌干细胞的干性维持,促进胃癌进展,并能充当胃癌患者独立的预后因子。本研究所另一课题组的研究还发现,CMG2在胶质瘤中高表达,其表达水平与胶质瘤的级别和预后密切相关。这些研究结果表明CMG2在胃癌、胶质瘤等肿瘤的发生发展中发挥重要作用,是潜在的诊断指标和治疗靶点。CMG2在肿瘤中的作用值得深入研究,然而,开展这些研究离不开高特异高亲和力的抗CMG2抗体。至今,国际国内商品化抗CMG2抗体大多为多克隆抗体,只有Abcam公司供应兔抗人CMG2单克隆抗体。因此,开发CMG2单克隆抗体具有良好的基础研究和临床应用前景。研究目的制备高特异性和高亲和力的小鼠抗人CMG2单克隆抗体,并用其建立CMG2表达的免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术和免疫组化检测方法,探讨其应用于肿瘤细胞和组织中CMG2表达检测的可行性。主要方法1.重组CMG2胞外段抗原多肽的原核表达与纯化根据CMG2（UniProtKB-P58335）的序列信息及在线表位预测结果,设计抗原多肽,包括CMG2胞外段（CMG2-ex）和优势表位肽,并实现其在原核表达系统中的表达,以镍柱纯化表达产物,BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE检测纯度。2.小鼠免疫、杂交瘤细胞制备及筛选、腹水制备和单抗纯化选择免疫原性最强的抗原多肽为免疫原,常规免疫小鼠和制备杂交瘤细胞。使用外购的真核表达的CMG2胞外段肽作为筛选原,通过间接ELISA方法筛选目标克隆。常规制备小鼠腹水并经Protein A亲和纯化获得相应抗体。3.抗体特性鉴定以间接ELISA法鉴定抗体亚类和亲和力,抗原竞争性抑制实验鉴定抗体的特异性。4.以候选单抗为一抗的检测方法的建立用候选单抗为一抗,建立免疫印迹法、免疫荧光、流式细胞术及免疫组化方法。5.以候选单抗建立的检测方法的初步应用以已知表达CMG2的胃癌细胞系SGC7901细胞和胃癌原代细胞XN0422作为模型,考察所建立的免疫印迹法、免疫荧光和流式细胞术方法的检测效果。以所建立的免疫组化方法对162例胃癌组织芯片、多器官肿瘤组织芯片和多器官正常组织芯片进行CMG2表达的免疫组织化学检测,考察染色的特异性和灵敏度。对带有病理参数和随访资料的胃癌样本,统计分析CMG2表达水平与患者临床病理特征的相关性,以及与病人预后的关系。6.候选单抗对胃癌细胞的抑制作用在两种胃癌细胞中加入高低两种浓度的候选抗体,孵育4d,进行细胞计数,分析候选单抗对肿瘤细胞是否具有抑制作用。结果1.通过对CMG2胞外段的表位分析,设计出CMG2-ex（34-318 aa）、CMG2 epitope1（94-139 aa）、CMG2-epitope2（153-200 aa）和CMG2-epitope3（261-306 aa）4个抗原多肽,并实现了其在原核表达系统的表达。经镍柱纯化后的抗原肽纯度均超过90%,浓度均超过2mg/mL,完全满足制备单抗的需要。动物免疫鉴定结果显示,CMG2-ex具有最强的免疫原性而被确定为制备单抗时的免疫原。2.以CMG2-ex为免疫原,以真核表达CMG2胞外段肽为筛选原,共筛选获得3株单克隆抗体,分别命名为2F8、6A7和8F3。特性鉴定显示8F3单抗的特异性和亲和力均显着优于2F8和6A7单抗,且其亚型为IgG1,被确定为候选的目标抗体。3.用8F3单抗建立的免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术方法检测CMG2在胃癌细胞系中的表达,结果表明8F3单抗能很好地应用于免疫荧光、流式细胞术检测方法,但不能用于免疫印迹法检测,提示其针对是构象表位。4.以8F3单抗建立的免疫组化方法具有良好的应用效果和临床应用前景。以8F3抗体为一抗检测162例胃癌组织芯片中CMG2的表达,结果显示,染色主要在胞膜和胞浆,无非特异染色。胃癌组织中CMG2表达远高于癌旁组织,且CMG2高表达患者的无病生存期和总生存期均显着短于CMG2低表达者。Cox单因素和多因素分析显示,CMG2表达水平是患者的独立预后因子。这些结果与本课题组前期采用Proteintech公司的CMG2多抗检测结果相一致。此外,用8F3抗体为一抗对人多种正常组织芯片和人多癌种组织芯片的组化检测结果显示,大多数正常组织呈弱阳性或阴性反应,而不同肿瘤组织呈现不同的CMG2表达水平。5.8F3抗体对胃癌细胞无明显的抑制作用,表明8F3不能作为中和阻断抗体所用。结论成功制备出高特异性和高亲和力的8F3鼠抗人CMG2单克隆抗体,能用于CMG2表达的免疫荧光、流式细胞术和免疫组化检测,但不能应用于免疫印迹法检测。
聂伯尧[8]（2016）在《新型炭疽芽胞杆菌疫苗候选株AP431的系统评价》文中研究指明炭疽（Anthrax）是一种由炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）引起的人畜共患传染病,动物中主要感染草食动物。近年来,炭疽仍呈全球性分布,特别是在一些欠发达地区造成了严重的危害,在欧洲地区甚至还出现了新的炭疽临床分型。同时,炭疽又是一种潜在的生物恐怖武器,容易引起突发性公共卫生事故。因此,炭疽的防控形势不容乐观,不少国家和地区加大了对炭疽研究的投资力度。目前,世界各国使用的炭疽疫苗主要包括炭疽芽胞疫苗和炭疽蛋白苗,中国使用的人炭疽疫苗为A16R活芽胞苗。A16R疫苗具有生产成本低、保护率较高等优点,但是也存在一些不足,如有个别接种后仍感染,划痕接种操作较难掌握,免疫有效期较短,需要每年加强接种等。本实验室在A16R疫苗株的基础上,进行了一系列的基因改造,获得了新的炭疽芽胞杆菌重组菌株AP431,并将其作为炭疽疫苗候选株进行评价研究。本研究的目的是对本实验室构建的新型炭疽疫苗候选株AP431进行系统评价,主要从生物学特性、安全性、免疫原性和免疫保护率等方面进行,并与出发菌株A16R对比,为后续研究奠定基础。生物学特征评价试验中,测得突变株AP431和A16R的生长速度基本一致,并且二者的生化特性无明显差异。通过免疫印迹和流式细胞术检测,发现菌株AP431的保护性抗原表达水平良好,较出发菌株A16R有显着提高,且在菌体S层的空间定位表达稳定。另外,在共培养竞争试验和过氧化氢敏感试验中,发现AP431菌株的竞争生存能力和活性氧抵抗力均显着低于A16R,提示其毒力较出发菌株有明显降低。在安全评价试验中,分别进行了巨噬细胞感染试验、炭疽活菌组织分布试验和动物安全试验。试验分别从细胞、器官组织和动物个体三个不同的角度对菌株安全性进行了比较研究,最后得出了一致的结论。构建的AP431重组菌株与出发A16R相比,毒力明显减弱,安全性显着提高。在细胞实验中发现,AP431菌对巨噬细胞RAW264.7基本无杀灭作用,毒力较A16R明显降低;通过对动物组织中活菌计数,发现AP431在动物脏器组织中的活菌分布量显着少于A16R,说明其对宿主的侵袭力显着降低;在动物安全评价中,发现AP431对小鼠的安全剂量提高到了5×108CFU,比A16R至少提高了2个数量级。在不同的动物模型中,炭疽突变株AP431芽胞的免疫原性水平均与A16R基本相当。通过建立BALB/c小鼠炭疽Sterne株致死性感染模型,对AP431芽胞的免疫保护率进行了检测,发现其对5×106CFU剂量的炭疽Sterne芽胞攻毒的小鼠保护率可以达到83.3%,基本达到了构建疫苗株的目的。综上所述,通过本次试验研究,比较系统地获得了炭疽芽胞杆菌突变株AP431的相关数据。首先,初步掌握了AP431菌株的生物学特征,为后续的研究试验打下了基础;其次,与A16R相比,炭疽芽胞杆菌突变株AP431的保护性抗原PA表达水平有明显优势;值得一提的是,重组疫苗株的毒力明显降低,安全性显着提高,并达到了一定的免疫保护率。因此,炭疽重组菌株AP431的研究开发前景可观,可作为新型的炭疽疫苗候选株,值得进一步研究。
吴诗坡[9]（2013）在《基于重组腺病毒载体的烈性病原体疫苗研究》文中研究指明埃博拉病毒和炭疽芽孢杆菌均为A类生物战剂，可用于生物恐怖袭击。对此，非常有必要开发一种能快速引起免疫反应的疫苗以应付不时之需。在这里，我们以复制缺陷型重组腺病毒作为载体，制备了埃博拉和炭疽重组腺病毒，并在小鼠及大鼠模型上评价了它们的免疫原性。对于埃博拉重组腺病毒疫苗，我们选择了毒性最强的苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒作为研究对象，对疫苗的有效成份，苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的基因进行合成，并克隆入AdMax腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上。通过将穿梭质粒和AdMax腺病毒系统的骨架质粒（pBHGloxE1,3Cre）共转染至HEK293细胞，发生位点特异性重组，包装出表达有埃博拉病毒包膜糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒疫苗候选株。对其进行扩增和纯化，获得一定的量，用于免疫学评价。细胞免疫反应是埃博拉病毒疫苗产生保护作用的关键，而CTL表位是评价疫苗细胞免疫反应的基础。为了筛选到适合于BALB/c小鼠的CTL表位，我们首先通过各种表位预测软件，对苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白H-2d单元型的CTL表位进行预测，并选择最有可能的CTL表位进行合成。使用ELISPOT和流式细胞术的方法，筛选到了第一个苏丹型埃博拉病毒包膜糖蛋白H-2d单元型的CTL表位RF-9，同时筛选到了一个新的扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白H-2d单元型的CTL表位GF-9。实验证实，GF-9比之前报道过的CTL表位LV-9具有更高的灵敏性。在此基础上，我们使用类似的方法，在HLA-A*0201转基因小鼠上成功筛选到了第一个苏丹型埃博拉病毒包膜糖蛋白HLA-A*0201特异的CTL表位CV-9。埃博拉病毒包膜糖蛋白CTL表位的筛选为基于包膜糖蛋白的埃博拉病毒疫苗细胞免疫水平的评价奠定了基础。我们以BALB/c小鼠作为动物模型，对埃博拉重组腺病毒进行免疫学评价。首先，通过流式细胞术和ELISPOT的方法，验证了苏丹型和扎伊尔型埃博拉重组腺病毒均可诱导产生快速而强烈的细胞免疫反应。在体液免疫反应方面，重组腺病毒免疫后小鼠血清的抗体在近一年的时间内可稳定维持。随后，我们将苏丹型和扎伊尔型埃博拉重组腺病毒混合后进行免疫，结果显示，两者均能产生特异而强烈的细胞免疫反应，说明两者不存在相互干扰作用，可以混合使用。同时，我们对IFN-γ阳性的CD8细胞统计其分泌TNF和IL-2以及表达CD107的情况。结果显示，虽然在IFN-γ阳性的CD8细胞中IFN-γ单阳性的细胞占40%左右。然而，IFN-γ、TNF、IL-2和CD107四阳性细胞所占的百分比大于5%，而IFN-γ、TNF、IL-2三阳性的细胞百分比也大于10%。这一结果说明，埃博拉重组腺病毒所激发的效应T细胞中多功能细胞占有较大的比例。通过对埃博拉重组腺病毒不同免疫方式所产生的免疫效果进行比较，结果发现，肌肉注射（IM）能诱导强烈的细胞免疫反应，而滴鼻（IN）的免疫方式虽然在脾细胞上不能检测到IFN-γ的分泌，但其血清抗体水平比肌肉注射的免疫方式要高。此外，滴鼻的免疫方式还能产生高水平的分泌型肺洗液IgA抗体。接着，我们对不同免疫方式的组合进行探讨，结果发现，先肌肉注射后滴鼻免疫的免疫方式，既能够诱导产生强烈的细胞免疫反应，而且可以激发强烈的血清IgG抗体和肺洗液分泌型IgA抗体水平。在此基础上，将扎伊尔型埃博拉病毒分泌型糖蛋白（sGP）的基因进行密码子优化，并以此包装重组腺病毒进行免疫学评价。结果显示，密码子优化后，重组腺病毒的细胞免疫反应水平保持不变，但体液免疫反应水平有明显的增强。同时，密码子优化后重组腺病毒免疫的小鼠产生抗体的时间明显提前。在炭疽重组腺病毒疫苗方面，通过密码子优化，使疫苗的有效成份保护性抗原PA在真核系统中实现高效表达。使用流式细胞术和ELISPOT的方法对炭疽保护性抗原PA的CTL表位进行筛选，发现了一个H-2d单元型的CTL表位NA-9，同时也发现了两个HLA-A*0201特异的CTL表位AV-9和FI-9。实验证实肌肉注射炭疽重组腺病毒可诱导产生强烈而持久的细胞免疫反应。在体液免疫方面，无论是肌肉注射还是滴鼻免疫，均可产生强烈而持久的血清抗体水平和抗炭疽毒素中和抗体水平。其中肌肉注射可更快的产生免疫反应，其血清主要抗体亚型为IgG2a；而滴鼻免疫所产生的血清IgG抗体峰值略高于肌肉注射，其主要抗体亚型为IgG1。使用对炭疽毒素敏感的Fisher344大鼠进行炭疽毒素攻毒实验，结果发现肌肉注射108ifu的炭疽重组腺病毒7天以后进行10倍LD50的炭疽毒素攻击即可实现100%的保护效果，充分证明了该疫苗在紧急预防方面的优势。由于预存免疫是人5型腺病毒载体疫苗必需要考虑的一个问题，我们分别以肌肉注射和滴鼻的方式给予预存免疫对炭疽重组腺病毒的免疫效果进行研究。实验发现，预存免疫对滴鼻免疫方式的影响并不是很大；肌肉注射给予预存免疫会影响肌肉注射的免疫效果，而滴鼻预存对肌肉注射影响较小。自然情况下腺病毒通常是经粘膜系统进行感染，这很大程度上说明了在自然感染人5型腺病毒的情况下，经肌肉注射接种重组腺病毒载体疫苗仍然具有很好的效果。在滴鼻给予预存免疫的情况下，大鼠经肌肉注射免疫炭疽重组腺病毒15天后进行炭疽毒素攻击也可以实现100%的保护效果，进一步证实了这一结论。综上所述，埃博拉重组腺病毒和炭疽重组腺病毒均可迅速产生强烈而持久的细胞及体液免疫反应，有效证明了它们作为烈性病原体快速疫苗的可行性。
刘炬[10]（2013）在《炭疽毒素致死因子的重组制备与检测方法研究》文中认为炭疽是一类严重威胁人类健康的烈性传染病，其病原体为炭疽芽孢杆菌（简称炭疽杆菌）。炭疽杆菌在不适宜的生存条件下会形成具有极强抗逆性的芽孢，其芽孢由于具有存活时间长、易于制备、易于散布等特性，是非常理想的生物战剂和生物恐怖的原材料。炭疽杆菌的毒力因子有两大类，一是荚膜，一是外毒素。荚膜的功能是抵抗宿主的吞噬作用，帮助炭疽杆菌在宿主体内感染和生存。而炭疽杆菌的外毒素则被认为是其致死的最主要因素，包含三种成分，水肿因子（edema factor，EF），致死因子（lethal factor，LF），保护性抗原（protective antigen，PA）。其中PA可以与其细胞表面受体结合，被furin样蛋白酶切割并组装成七聚体或八聚体；EF和LF可以与PA多聚体结合，形成的复合物通过内吞作用进入细胞。在胞质内，EF具有腺苷酸环化酶的活性，能够上调cAMP的水平，LF具有金属蛋白酶的活性，能够切割MEK蛋白家族的成员。学界目前对炭疽感染者损伤甚至死亡的具体机制还不清楚，但认为两类炭疽毒素，致死毒素LT（lethal toxin，即PA与LF的混合物）和水肿毒素ET（edema toxin，即PA与EF的混合物）在其中发挥着主要作用，这也是炭疽感染晚期单纯的抗生素治疗难以发挥疗效的原因。因此，在炭疽感染中，准确检测毒素水平显得非常必要：在感染早期，对毒素的检测可以作为诊断手段；在治疗中，实时监测毒素水平的变化对于评价治疗效果和患者的安全状况也有重要的意义。LF作为炭疽杆菌外毒素的重要组成部分，是炭疽感染中造成损伤和致死的主要成分之一，因此本研究的主要目标之一就是期望建立方便灵敏实用的针对LF的检测方法。为了给检测方法研究准备材料，同时也为了给本室及其他同行关于LF作用机理的研究提供支持，本研究将建立简单高效的LF制备方法作为本研究的另一重要目标。目前在LF的制备工作中存在的主要问题包括生物安全风险，氨基酸序列尤其是N端序列有异于天然蛋白，纯化工艺复杂、效率不高等。本研究立足于大肠杆菌表达系统，从而降低了生物安全的风险。但在实际工作中发现，目的蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达水平又成为了限制条件。因此，本研究从核酸水平上对LF表达的限制因素进行了分析。通过构建一系列的截短突变体进行表达分析，并借助网络工具JCat进行序列分析，发现LFC端的编码序列存在两个稀有密码子密集的区域，推测这两段序列限制了LF在大肠杆菌表达系统中的表达水平。通过对这两个区域的密码子进行优化，实现了LF表达量的提高。在此基础上，对周质蛋白的抽提方式和LF的纯化方法进行了优化。经过优化的渗透休克法处理和CHTTM陶瓷羟基磷灰石层析柱与Source30Q阴离子层析柱两步层析纯化，可以得到纯度大于95%的目的蛋白，产量可达5mg/L。利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹分析、氨基端测序，以及细胞毒性试验和大鼠攻毒试验，对LF进行了性质鉴定。结果表明，该方法可以得到纯度高（大于95%）、序列天然、活性高的LF，可以满足炭疽基础研究、疫苗和防治药物研究等多种需求。在LF制备工艺建立起来的基础上，本研究进一步探索了LF的检测方法。考虑到LF具有较强的细胞毒性，本研究关注了利用LF的细胞毒性对其进行检测的可行性。小鼠巨噬细胞系J774A.1细胞对LF的细胞毒性非常敏感，因此利用该细胞检测LF可能会得到比较理想的灵敏度。本研究首先利用细胞毒性试验测定了LF作用于J774A.1细胞的EC50值，在此基础上，对检测过程中的条件进行优化，建立起了操作简单、灵敏度高的LF检测方法。该方法在Fischer344大鼠模型中得到了验证，并利用该方法，初步计算了LF在Fischer344大鼠血液内的半衰期。该部分工作建立了利用细胞毒性试验检测血液中LF的方法，该方法在灵敏性、经济性和实用性等方面显示了一定的优势，为炭疽的相关研究及临床诊断和治疗中的LF检测提供了新的选择。为了探索更灵敏更稳定的检测方法，本研究又进一步关注了LF的酶活性。LF作为炭疽致死毒素的酶活性组份，在进入细胞后具有Zn2+依赖的金属蛋白酶活性，能够特异地切割MEK蛋白家族的成员。目前，已有多项在研的针对这一性质的LF检测方法，但这些研究往往需要利用质谱、高效液相色谱等复杂的技术和设备。本研究期望在此基础上设计出一套既灵敏又简单的LF检测方法。本研究将MEK中LF的酶切位点部分对应的DNA序列添加到大肠杆菌碱性磷酸酶（AP）野生型或突变体的编码基因的上游，并在融合蛋白的N端添加多聚组氨酸标签（His标签），成功构建了融合蛋白MEKAP的重组表达质粒并进行了表达纯化。将得到的MEKAP用于LF的检测：通过一系列类似于酶联免疫吸附法的操作，实现了对LF的检测。本研究设计的检测方法不需要质谱仪、高效液相色谱等复杂设备，其操作流程简单，可检测到31ng的目的蛋白，显示了较好的应用前景。综上所述，本研究首先建立了简便高效的LF制备工艺，在此基础上，利用LF的细胞毒性和酶活性，对其检测方法进行了探索：利用小鼠巨噬细胞J744A.1对LF细胞毒性的敏感性，建立了基于细胞毒性试验检测LF的方法，并在大鼠动物模型上进行了验证，初步估算了LF在大鼠血液内的半衰期；利用LF切割MEK蛋白家族成员的性质，设计了基于LF的酶活性检测LF的简便方法，并验证了其可行性。这些工作为炭疽的临床诊断治疗和相关的机理研究提供了支持。
二、科学家发现一种炭疽毒素的结构（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、科学家发现一种炭疽毒素的结构（论文提纲范文）
（1）牙鲆炎症小体关键组件分子JfNLRP3鉴定及功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物炎症小体 |
| 1.2 NLRP3炎症小体 |
| 1.2.1 NLRP3炎症小体的组成 |
| 1.2.2 NLRP3炎症小体的激活 |
| 1.2.3 病原菌激活NLRP3炎症小体 |
| 1.3 鱼类炎症小体 |
| 1.3.1 鱼类炎症小体 |
| 1.3.2 鱼类炎症小体在抵抗病原感染中的作用 |
| 1.4 本课题的主要内容和意义 |
| 第2章 牙鲆JfNLRP3基因的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 牙鲆养殖 |
| 2.3.2 RNA抽提 |
| 2.3.3 大肠杆菌感受态制备 |
| 2.3.4 RNA逆转录生成cDNA |
| 2.3.5 RACE产物的In-Fusion克隆 |
| 2.3.6 连接和大肠杆菌的转化及菌落验证 |
| 2.3.7 生物信息学分析软件 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 牙鲆JfNLRP3基因的克隆 |
| 2.4.2 牙鲆JfNLRP3进化树分析 |
| 2.4.3 牙鲆JfNLRP3三维结构预测 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第3章 牙鲆JfNLRP3基因的功能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2. 菌株、质粒、培养基和培养条件 |
| 3.2.1 菌株和引物 |
| 3.2.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基与缓冲液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 真核表达质粒构建 |
| 3.3.2 无内毒素质粒抽提 |
| 3.3.3 真核细胞表达质粒转染 |
| 3.3.4 有机溶剂收蛋白 |
| 3.3.5 荧光共定位 |
| 3.3.6 免疫共沉淀 |
| 3.3.7 免疫蛋白印记 |
| 3.3.8 蛋白电泳胶的配制 |
| 3.3.9 Western blot |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 JfNLRP3与JfASC相互作用的荧光斑点分析 |
| 3.4.2 JfNLRP3与JfASC相互作用的免疫共沉淀分析 |
| 3.4.3 JfNLRP3激活Jfcaspase-1并活化Jfpro-IL-1β |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第4章 牙鲆JfNLRP3和Jfcaspase-1在抗细菌感染中的作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 杀鱼爱德华氏菌的培养 |
| 4.3.2 牙鲆活体注射感染 |
| 4.3.3 敲降质粒及过表达质粒的构建 |
| 4.3.4 荧光定量PCR |
| 4.3.5 杀鱼爱德华氏菌的培养和感染 |
| 4.3.6 对siRNA敲降效果及过表达效果的验证 |
| 4.3.7 定植实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 JfNLRP3和Jfcaspase在不同组织中的表达量分析 |
| 4.4.2 杀爱德华氏菌感染激活JfNLRP3和Jfcaspase-1表达分析 |
| 4.4.3 牙鲆JfNLRP3和Jfcaspase-1基因的活体敲降和过表达分析 |
| 4.4.4 敲降和过表达JfNLRP3和Jfcaspase-1对杀鱼爱德华氏菌定植影响 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 读硕士学位期间发表的论文 |
| 攻读硕士学位期间参加会议 |
（2）杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（3）炭疽芽孢杆菌的研究进展（论文提纲范文）
| 1 生物学特性 |
| 1.1 形态特征 |
| 1.2 培养特性 |
| 1.3 抵抗力 |
| 2 毒力因子 |
| 2.1 荚膜 |
| 2.2 炭疽毒素 |
| 2.2.1 PA |
| 2.2.2 LF |
| 2.2.3 EF |
| 3 致病机理 |
| 4 检测方法 |
| 4.1 细菌学检测 |
| 4.2 分子生物学检测 |
| 4.3 免疫学检测 |
| 4.4 其他检测方法 |
| 5 小结 |
（4）A塞内卡病毒的分离鉴定及其VP3单抗的制备（论文提纲范文）
| 基金项目 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 A型塞内卡病毒研究进展 |
| 1.1 A型塞内卡病毒的基因组结构 |
| 1.2 5'UTR和3'UTR |
| 1.3 前导蛋白L |
| 1.4 结构蛋白 |
| 1.5 非结构蛋白 |
| 2 A型塞内卡病毒的流行病学 |
| 2.1 流行特点 |
| 2.2 流行情况 |
| 2.3 A型塞内卡病毒致病性毒株的报道 |
| 3 A型塞内卡病的临床症状与病理变化 |
| 4 A型塞内卡病毒的诊断 |
| 4.1 病原学诊断 |
| 4.2 血清学诊断 |
| 5 A型塞内卡病毒的防控 |
| 5.1 加强流行病学监测 |
| 5.2 加强生物安全管理 |
| 5.3 做好疫情处置工作 |
| 5.4 加快疫苗研制 |
| 6 单克隆抗体技术与抗原表位研究 |
| 6.1 单克隆抗体技术 |
| 6.2 抗原表位研究 |
| 6.3 抗原表位的应用 |
| 7 研究目的与意义 |
| 研究内容 |
| 第一章 A型塞内卡病毒的分离鉴定及遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料收集与毒株背景 |
| 1.2 主要试剂与材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 相关溶液的配置 |
| 1.5 病料的处理 |
| 1.6 引物的设计与合成 |
| 1.7 病毒RNA提取与反转录 |
| 1.8 RT-PCR检测病料 |
| 1.9 病毒的分离 |
| 1.10 病毒的效价测定 |
| 1.11 病毒的纯化与鉴定 |
| 1.12 病毒生长动力学曲线 |
| 1.13 空斑实验 |
| 1.14 间接免疫荧光分析 |
| 1.15 基因组测序和序列比对 |
| 2 结果 |
| 2.1 样品的病原检测 |
| 2.2 病毒的分离 |
| 2.3 病毒的纯化 |
| 2.4 病毒的效价测定 |
| 2.5 病毒的鉴定 |
| 2.6 病毒生长曲线 |
| 2.7 病毒空斑 |
| 2.8 间接免疫荧光 |
| 2.9 系统进化树与序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 A型塞内卡病毒的致病性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂与溶液 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 1.4 动物攻毒 |
| 1.5 动物症状检测 |
| 1.6 动物体温检测 |
| 1.7 动物排毒检测 |
| 1.8 中和抗体测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪的临床症状观察 |
| 2.2 猪的临床症状曲线 |
| 2.3 猪的体温检测 |
| 2.4 猪的排毒检测 |
| 2.5 中和抗体水平 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 SVA VP3单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 实验试剂与耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 相关溶液的配制 |
| 1.5 重组蛋白的表达 |
| 1.6 重组蛋白的纯化与鉴定 |
| 1.7 动物免疫 |
| 1.8 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 1.9 单克隆抗体腹水的制备 |
| 1.10 单克隆抗体生物学特性的鉴定 |
| 1.11 单克隆抗体抗原表位的鉴定 |
| 1.12 单克隆抗体抗原表位的精确鉴定 |
| 1.13 单克隆抗体抗原表位的保守性分析 |
| 1.14 VP3蛋白三维结构模型中单克隆抗体抗原表位的定位 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒鉴定 |
| 2.2 重组蛋白表达 |
| 2.3 纯化蛋白的SDS-PAGE与Western blot鉴定 |
| 2.4 小鼠血清IFA鉴定 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.6 单克隆抗体腹水效价的检测 |
| 2.7 单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 2.8 杂交瘤细胞株稳定性的鉴定 |
| 2.10 单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 |
| 2.11 单克隆抗体抗原表位的精确鉴定 |
| 2.12 单克隆抗体抗原表位的保守性分析 |
| 2.13 单克隆抗体抗原表位在蛋白三维结构模型上的定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）2014-2015年云南分离炭疽芽胞杆菌遗传特征分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 炭疽芽胞杆菌概述 |
| 1.1.1 炭疽芽胞杆菌的生物学性状 |
| 1.1.2 炭疽芽胞杆菌的主要毒力因子 |
| 1.1.3 炭疽芽胞杆菌抵抗力 |
| 1.1.4 炭疽芽胞杆菌的感染方式和临床症状 |
| 1.1.5 炭疽芽胞杆菌MLVA分型 |
| 1.2 炭疽流行简述 |
| 1.3 2014-2015年炭疽暴发流行病学调查 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 本研究所使用的实验菌株 |
| 2.2 主要试剂与仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 营养琼脂培养基制备 |
| 2.3.2 菌株复苏、培养 |
| 2.3.3 炭疽芽胞杆菌基因组DNA的提取 |
| 2.3.4 制备1%琼脂糖凝胶电泳操作步骤如下 |
| 2.3.5 毛细管电泳分析VNTR扩增产物大小 |
| 2.3.6 基因组测序 |
| 2.3.7 炭疽芽胞杆菌canSNP基因分型 |
| 2.3.8 炭疽芽胞杆菌MLVA15基因分型 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 炭疽杆菌基因组DNA提取 |
| 3.2 基因组分析 |
| 3.3 CanSNP基因分型结果 |
| 3.3.1 反应完成后,在Loche480仪器上查看所检测到的荧光类型及Fluorescence History结果如下 |
| 3.3.2 确定样品的SNP位点类型 |
| 3.3.3 样品的canSNP群或组 |
| 3.4 MLVA15基因分型 |
| 3.4.1 MLVA15分型 |
| 3.4.2 毛细管电泳分析VNTR产物大小 |
| 3.4.3 聚类分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 炭疽芽胞杆菌基因组及其基因分型研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 CRISPR Cas9 全基因组文库筛选肿瘤放射增敏新靶点 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、CRISPR Cas9 人类全基因组文库 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、质粒信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、60Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、CRISPR Cas9 人类全基因组文库感染与样品处理 |
| 4、高通量二代测序 |
| 5、慢病毒质粒构建 |
| 6、慢病毒包装及稳转细胞株构建 |
| 7、细胞蛋白提取 |
| 8、BCA法测定蛋白浓度 |
| 9、蛋白凝胶电泳 |
| 10、细胞凋亡检测 |
| 11、克隆形成率实验 |
| 12、细胞活力检测 |
| 13、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)CRISPR Cas9 人类全基因组文库(Ge CKO v2)病毒包装及感染 |
| (二)阴性筛选及高通量二代测序 |
| 1、sgRNA测序质量分析 |
| 2、sgRNA序列回帖分析 |
| 3、样本聚类分析 |
| 4、Ribosome基因通路富集分析 |
| 5、差异基因筛选 |
| (三)目的基因的筛选与验证 |
| 1、TTC9C等目标基因的sh RNA构建、感染与敲低效果验证 |
| 2、TTC9C等基因敲低对肿瘤细胞的放射增敏作用 |
| 3、目标基因敲低对肿瘤细胞DNA损伤应答(DNA Damage Response,DDR)通路与凋亡相关蛋白的影响 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 TTC9C在胶质瘤细胞放射敏感性中的作用 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、慢病毒质粒构建 |
| 2、细胞增殖检测 |
| 3、划痕实验 |
| 4、细胞周期检测 |
| 5、免疫荧光染色 |
| 6、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)TTC9C质粒过表达和敲低效果验证 |
| (二)TTC9C敲除单克隆细胞系筛选 |
| (三)TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的增殖能力 |
| (四)TTC9C敲除显着减弱胶质瘤细胞的迁移能力 |
| (五)TTC9C敲除显着降低胶质瘤细胞的照后活力 |
| (六)TTC9C敲除显着减少胶质瘤细胞的照后存活率 |
| (七)TTC9C敲除显着促进胶质瘤细胞的照后凋亡 |
| (八)TTC9C敲除或过表达对胶质瘤的照后细胞周期变化没有显着影响 |
| (九)TTC9C敲除显着抑制胶质瘤细胞的照后DNA损伤修复 |
| (十)TTC9C敲除显着抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 TTC9C对胶质瘤荷瘤模型放射敏感性的影响及临床分析 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验动物 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、裸鼠颅内原位荷瘤 |
| 2、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 3、荷瘤裸鼠生存率观察 |
| 4、石蜡组织切片制作 |
| 5、苏木精-伊红染色 |
| 6、免疫组化染色 |
| 7、TUNEL染色 |
| 8、生物信息学分析 |
| 9、其他方法: |
| 二、实验结果 |
| (一)TTC9C敲除在颅内胶质瘤中发挥了显着的放射增敏效果 |
| 1、裸鼠胶质瘤颅内原位荷瘤模型构建成功 |
| 2、TTC9C敲除显着延长荷瘤裸鼠的照后生存时间 |
| 3、TTC9C敲除显着减小颅内胶质瘤的照后体积 |
| 4、TTC9C敲除显着抑制颅内胶质瘤的照后增殖能力 |
| 5、TTC9C敲除显着促进颅内胶质瘤的照后凋亡 |
| 6、TTC9C敲除显着抑制颅内胶质瘤的照后HR修复 |
| (二)TTC9C在胶质瘤预后和HR修复信号通路的生物信息学分析 |
| 1、TTC9C表达量显着影响胶质瘤等癌症患者的预后 |
| 2、TTC9C与 HR相关蛋白的表达具有显着的相关性 |
| 3、现有研究并未揭示TTC9C与 HR修复的相关关系 |
| 4、TTC9C相关基因功能的挖掘 |
| 三、讨论 |
| 第四部分 TTC9C在胶质瘤放射敏感性及DNA损伤修复中的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、慢病毒质粒构建 |
| 2、免疫共沉淀 |
| 3、蛋白质谱分析 |
| 4、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)电离辐射可导致TTC9C核内募集 |
| (二)TTC9C在照后发生磷酸化修饰 |
| (三)蛋白质谱筛选TTC9C结合蛋白 |
| (四)TTC9C与 ATR等 HR修复通路相关蛋白结合发挥作用 |
| (五)TTC9C与 ATR结合位点的筛选 |
| 三、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表一 阴性选择差异基因列表(前200位) |
| 附表二 TTC9C结合蛋白列表(前200位) |
| 附表三 TTC9C正相关基因列表(前200位) |
| 附表四 胶质瘤中与TTC9C负相关基因列表 |
| 文献综述 CRISPR Cas9 全基因组文库应用与展望 |
| References |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）鼠抗人CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 重组CMG2 蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 鼠抗人CMG2 单克隆抗体的制备和鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 鼠抗人CMG2 单克隆抗体的初步应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 CMG2在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）新型炭疽芽胞杆菌疫苗候选株AP431的系统评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 炭疽及炭疽芽胞杆菌 |
| 1.2 炭疽毒力因子及致病机理 |
| 1.3 炭疽的治疗药物 |
| 1.4 炭疽疫苗的研究进展 |
| 1.5 炭疽活芽胞疫苗A16R |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 炭疽芽胞杆菌疫苗候选株AP431 的生物学特征研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 基因水平鉴定 |
| 2.2.2 菌株生长性能比较 |
| 2.2.3 生化特性比较 |
| 2.2.4 保护性抗原PA蛋白的表达水平 |
| 2.2.5 共培养竞争能力比较 |
| 2.2.6 过氧化氢敏感性比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 炭疽芽胞杆菌疫苗候选株AP431 的安全性评价 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 炭疽芽胞感染巨噬细胞RAW264.7 |
| 3.2.2 LDH法检测炭疽芽胞的巨噬细胞毒性 |
| 3.2.3 BALB/c小鼠感染炭疽芽胞后组织活菌分布检测 |
| 3.2.4 C57 小鼠模型安全性评价 |
| 3.2.5 豚鼠模型安全性评价 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 炭疽疫苗候选株AP431 的免疫原性和免疫保护性评价 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 抗原PA蛋白制备结果 |
| 4.2.2 间接ELISA检测抗PA血清IgG抗体 |
| 4.2.3 BALB/c小鼠炭疽Sterne株致死性感染模型建立 |
| 4.2.4 AP431芽胞免疫BALB/c小鼠攻毒保护结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（9）基于重组腺病毒载体的烈性病原体疫苗研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 埃博拉重组腺病毒疫苗的研究 |
| 第一节 埃博拉重组腺病毒疫苗的制备 |
| 第二节 埃博拉病毒包膜糖蛋白 CTL 表位的筛选 |
| 第三节 埃博拉重组腺病毒疫苗的免疫学评价 |
| 第二章 炭疽重组腺病毒疫苗的研究 |
| 第一节 炭疽重组腺病毒疫苗的制备 |
| 第二节 炭疽 PA 蛋白 CTL 表位的筛选 |
| 第三节 炭疽重组腺病毒疫苗的免疫学评价 |
| 第四节 预存免疫存在情况下 Ad5-PAopt 的免疫效果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 主要溶液配制 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）炭疽毒素致死因子的重组制备与检测方法研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 炭疽毒素致死因子的重组制备 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 利用细胞毒性试验检测血液中炭疽毒素致死因子的方法学研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 利用炭疽毒素致死因子的蛋白酶活性进行检测的方法探索 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 主要溶液配制 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 代表性论着 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、科学家发现一种炭疽毒素的结构（论文参考文献）
- [1]牙鲆炎症小体关键组件分子JfNLRP3鉴定及功能初步研究[D]. 丁双飞. 华东理工大学, 2020(08)
- [2]杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制[D]. 柳颖. 浙江大学, 2020(01)
- [3]炭疽芽孢杆菌的研究进展[J]. 张玲艳,宋丽丽,贾伟娟,王学理. 黑龙江畜牧兽医, 2020(15)
- [4]A塞内卡病毒的分离鉴定及其VP3单抗的制备[D]. 陈露露. 扬州大学, 2020(01)
- [5]2014-2015年云南分离炭疽芽胞杆菌遗传特征分析[D]. 彭海燕. 大理大学, 2020(05)
- [6]TTC9C在胶质瘤放射敏感性中的作用及机制研究[D]. 曹堃. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]鼠抗人CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用[D]. 蔡瑞丽. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [8]新型炭疽芽胞杆菌疫苗候选株AP431的系统评价[D]. 聂伯尧. 天津农学院, 2016
- [9]基于重组腺病毒载体的烈性病原体疫苗研究[D]. 吴诗坡. 中国人民解放军军事医学科学院, 2013(11)
- [10]炭疽毒素致死因子的重组制备与检测方法研究[D]. 刘炬. 中国人民解放军军事医学科学院, 2013(01)