一、分离人肝细胞的超低温保存（论文文献综述）
李曦[1]（2021）在《三叶苷对急性肝损伤的保护作用及促肝细胞增殖作用的实验研究》文中指出目的:探究三叶苷（trilobatin,TLB）对小鼠急性肝损伤的保护作用及其促进人正常肝细胞L-02的增殖作用。方法:1.通过简单随机法将SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为7组:空白对照组（Control）、空白+TLB高剂量组（Control+40 mg/kg）、模型组[D-氨基半乳糖（D-galactosamine,D-Gal N）/脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）]、模型+TLB低剂量组（D-Gal N/LPS+10 mg/kg）、模型+TLB中剂量组（D-Gal N/LPS+20 mg/kg）、模型+TLB高剂量组（D-Gal N/LPS+40 mg/kg）、模型+阳性对照组（联苯双酯）（D-Gal N/LPS+Bifendate）。给药组分别给予小鼠相应浓度的TLB或联苯双酯,空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水进行预防性给药7天,每天2次。然后采用腹腔注射D-Gal N（700 mg/kg）/LPS（100μg/kg）制备急性肝损伤模型,造模5 h后取材。通过苏木精-伊红染色观察小鼠肝脏病理变化情况;酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）水平和炎症相关因子白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、内皮素-1（endothelin-1,ET-1）、IL-4和IL-10的含量,以及活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）的活力。2.将人正常肝细胞L-02经不同浓度的TLB处理后,通过噻唑蓝比色法测定TLB作用L-02细胞的安全浓度范围以及对L-02细胞活力的影响;采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷酶（5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U）ELISA法和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU）荧光染色法分别观察L-02细胞DNA的含量和细胞增殖的改变;通过免疫印迹法分析细胞周期相关蛋白肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α）、周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases 4,CDK4）、cyclin D1以及相关调节蛋白肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、酪氨酸激酶（tyrosine kinase,c-Met）、蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase 1/2,Erk1/2）的蛋白表达。结果:1.D-Gal N/LPS模型组较空白对照组小鼠肝脏组织外观呈暗红色、充血肿大,肝细胞坏死,且出现明显出血、病变和炎症细胞浸润;血清中ALT、AST的水平明显升高;IL-1β、IL-6、TNF-α、ET-1、ROS和MDA的含量均明显增加,IL-4、IL-10的含量和SOD、GSH-Px的活力明显降低。而TLB（10、20、40 mg/kg）预给药组和D-Gal N/LPS+Bifendate组小鼠肝脏外观和颜色明显改善;血清中ALT、AST的水平明显降低;IL-1β、IL-6、TNF-α、ET-1、ROS和MDA的含量显着降低,而IL-4、IL-10的含量和SOD、GSH-Px的活力明显增加。2.与对照组比较,TLB（25、50、100μM）作用L-02细胞72 h能够明显增加L-02的细胞活力,并明显增加Brd U含量及EDU的荧光强度;同时,TLB能够明显下调L-02细胞中HNF4α的蛋白表达,上调CDK4、cyclin D1、HGF的蛋白表达,并增加c-Met的磷酸化水平和其下游Akt、Erk1/2的磷酸化水平。结论:TLB能够通过降低转氨酶水平,减少炎症因子的产生和氧化应激明显改善D-Gal N/LPS诱导的小鼠急性肝损伤;同时,TLB对人正常肝细胞L-02具有促增殖作用,其机制可能与调控HGF/c-Met信号途径有关。
王永娟[2]（2021）在《LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究》文中进行了进一步梳理急性肝衰竭（ALF）是一种罕见而严重的疾病,威胁着人类的健康。肝移植是治疗ALF最有效的方法。然而,由于供体器官缺乏、价格高昂等因素导致肝移植应用受限。因此,寻找治疗ALF的新方法迫在眉睫。肝细胞坏死导致肝脏募集大量的炎症细胞,进而引发全身炎症反应综合征（SIRS）为ALF的病理机制之一。因此,抑制炎症反应是治疗ALF的关键。小分子多肽LR12能够抑制髓样细胞表达触发受体1（TREM-1）的激活,对多种炎症疾病具有治疗作用。然而,LR12在ALF中的作用尚不清楚。肝再生不足以代偿肝细胞坏死,导致肝功能缺失,进而引发多器官功能衰竭是ALF的病理机制之一。肝脏是一个具有强大再生能力和显着调节最终质量能力的器官。以往的研究表明,肝再生是ALF存活的关键因素。然而,LR12是否能够促进肝再生尚不清楚。本研究建立了TAA诱导的ALF小鼠模型,观察LR12对ALF小鼠肝脏损伤的作用及肝再生的作用;通过体外建立TAA诱导的肝细胞损伤模型,探讨LR12促进肝细胞再生的机制;本研究通过细胞因子芯片技术筛选出LR12作用于巨噬细胞促进肝再生的关键因子,并通过体外和体内实验进一步验证。本课题主要包括以下四部分:第一部分LR12减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生目的:本研究旨在建立硫代乙酰胺（TAA）诱导的ALF小鼠模型,观察LR12对ALF的治疗作用。方法:1.腹腔注射TAA建立ALF小鼠模型。实验分组:对照组、TAA组、LR12组及TAA+LR12组。2.苏木素-伊红（H&E）染色检测肝脏病理变化。赖氏法检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的含量。3.观察TAA组和TAA+LR12组小鼠的存活率。4.Western blot方法检测小鼠肝脏中PCNA的表达。5.激光共聚焦（CLSM）方法检测小鼠肝脏中肝细胞标志角蛋白18（CK18）与增殖指标增殖细胞核抗原（PCNA）的共定位及表达情况。结果:1.造模后,TAA组小鼠肝脏可见肝细胞出血性坏死,而TAA+LR12组肝细胞出血性坏死面积减少（P<0.001）。2.TAA组ALT、AST水平较对照组显着升高,而TAA+LR12组ALT、AST水平较TAA组显着降低（P<0.01）。3.TAA+LR12组小鼠存活率显着高于TAA组（P<0.05）。4.TAA+LR12组小鼠肝脏中PCNA蛋白表达量较TAA组上调（P<0.01）。5.与TAA组相比,TAA+LR12组小鼠肝脏中CK18与PCNA共定位的细胞数显着增多（P<0.001）。结论:LR12能够减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生。第二部分:LR12通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖目的:本研究旨在建立TAA诱导的肝细胞损伤模型,研究LR12促进肝细胞再生的机制。方法:1.建立不同浓度TAA诱导的LO2细胞损伤模型,Western blot方法检测PCNA的表达。2.应用TAA或联合LR12刺激LO2细胞,CLSM和Western blot方法检测PCNA的表达。3.应用TAA或联合LR12刺激巨噬细胞后的上清液刺激LO2细胞或原代肝细胞,CLSM和Western blot方法检测PCNA的表达。4.流式细胞术（FCM）检测LO2细胞的细胞周期。结果:1.1 mM TAA组、2 mM TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低（P<0.05）。2.TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而TAA+LR12组PCNA蛋白表达量较TAA组无显着变化（P>0.05）。3.Supernatant-TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组PCNA蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.01）。原代肝细胞的结果与LO2细胞的结果一致。4.Supernatant-TAA组LO2细胞S期细胞比例较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组S期细胞比例较Supernatant-TAA组显着增多（P<0.01）。结论:LR12通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖。第三部分:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生目的:本研究旨在探讨LR12作用于巨噬细胞促进肝细胞再生的机制。方法:1.应用细胞因子芯片技术筛选TAA或联合LR12刺激巨噬细胞上清液中与增殖相关的细胞因子。2.酶联免疫吸附实验（ELISA）方法及实时荧光定量聚合酶链反应（q-RT-PCR）方法检测C-C趋化因子配体20（CCL20）的表达。3.建立TAA诱导的ALF小鼠模型,CLSM方法检测巨噬细胞标志F4/80与CCL20的共定位及表达情况。4.将LO2细胞分为对照组,TAA组,CCL20组及TAA+CCL20组,Western blot方法检测PCNA的表达。5.将LO2细胞分为Supernatant-TAA+LR12组和Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组,Western blot方法检测PCNA的表达。6.将小鼠分为TAA+LR12+Ig G组和TAA+LR12+anti-CCL20组,H&E染色检测肝脏病理变化。7.赖氏法检测血清ALT、AST的含量。8.CLSM方法检测小鼠肝脏中肝细胞标志CK18与PCNA的共定位及表达情况。结果:1.Supernatant-TAA组巨噬细胞上清液中CCL20蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组CCL20蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.05）。2.ELSA及PCR结果与芯片结果一致。3.与TAA组相比,TAA+LR12组小鼠肝脏中F4/80与CCL20共定位细胞数显着升高（P<0.001）。4.TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而TAA+CCL20组PCNA蛋白表达量较TAA组显着升高（P<0.01）。5.与Supernatant-TAA+LR12组相比,Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组LO2细胞中PCNA蛋白表达量显着降低（P<0.01）。6.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠肝细胞出血性坏死面积显着增加（P<0.001）。7.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠ALT、AST水平显着升高（P<0.05）。8.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠肝脏中CK18与PCNA共定位的细胞数显着减少（P<0.001）。结论:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生。第四部分:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生目的:本研究旨在阐明LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20调控肝细胞再生的机制。方法:1.应用TAA或联合LR12刺激巨噬细胞后的上清液刺激LO2细胞,Western blot方法检测LO2细胞中p-p38的表达。2.建立TAA诱导的ALF小鼠模型,提取原代肝细胞,Western blot方法检测原代肝细胞中p-p38的表达。3.将LO2细胞分为Supernatant-TAA+LR12组和Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组,Western blot方法检测LO2细胞中p-p38的表达。4.将小鼠分为TAA+LR12+Ig G组和TAA+LR12+anti-CCL20组,CLSM方法检测肝细胞中p38的核转位情况。结果:1.Supernatant-TAA组LO2细胞中p-p38蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组p-p38蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.01）。2.TAA+LR12组小鼠原代肝细胞中的p-p38蛋白表达量较TAA组显着上调（P<0.05）。3.与Supernatant-TAA+LR12组相比,Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组LO2细胞中p-p38蛋白表达量显着下调（P<0.001）。4.与TAA+LR12+anti-CCL20组相比,TAA+LR12+Ig G组小鼠可见肝细胞中p38核转位。结论:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生。
侯磊[3]（2020）在《柴胡水提物的谱-效-毒关系及体外生物转化研究》文中进行了进一步梳理目的:运用HPLC指纹图谱技术和灰色关联分析法（GRA）对柴胡水提物降脂活性和肝毒性的效毒成分群进行预测,初步分析效毒成分群在人工胃液、人工肠液、肠道菌群和肝微粒体中的生物转化情况,以期为柴胡水提物临床安全应用提供药理学证据。方法:通过HPLC-MS指纹图谱对柴胡水提物的物质基础进行表征;通过测定柴胡水提物对油酸诱导Hep G2细胞内TG含量、L-02细胞中ALT、AST含量的影响,研究柴胡水提物降脂活性及肝毒性;通过GRA对谱-效-毒进行关联分析,提示降脂活性及肝毒性分别对应的效毒成分群;通过体外L-02细胞毒性实验,探究柴胡含药血清组与水提物组对L-02细胞的影响;通过HPLC-MS指纹图谱研究人工胃液、人工肠液、肠道菌群和肝微粒体对柴胡水提物的影响,对柴胡水提物效毒成分群的体外生物转化情况进行分析,并总结其转化特点。结果:建立了柴胡水提物HPLC-MS指纹图谱,共标定了29个共有峰;GRA结果表明,8、12、27、20、14、10、26号共有峰与柴胡水提物降脂活性具有较高关联度;13、12、8、26、10、14、27、11号共有峰与柴胡水提物肝毒性具有较高关联度;其中8、10、12、14、26、27号共有峰与水提物效毒的关联度均较高,11、13号共有峰仅与柴胡水提物肝毒性相关。体外L-02细胞毒性实验结果表明,同等剂量的柴胡含药血清组与柴胡水提物组相比,L-02细胞的活力明显升高,具有极显着性差异（P<0.001）。体外生物转化实验结果表明,柴胡效毒相关的8、10、12、14号共有峰代表成分在人工胃液、肝微粒体孵育体系中相对稳定,不同时间点样品中各成分变化率均小于10%,在人工肠液中转化24 h后分别降低31%、15%、37%、31%,柴胡肝毒性特有成分11、13号峰降低33%、18%;柴胡效毒成分在肠道菌群中不稳定,其中8号峰在24 h含量增加107%,10、12、14号峰含量分别降低32%、32%、77%,柴胡肝毒性特有成分11、13号峰含量降低61%、42%。体外L-02细胞毒性实验结果表明,柴胡水提物人工胃液、肝微粒体不同时间转化样品对L-02细胞活力的影响无显着性差异;与转化0 h组相比,柴胡水提物人工肠液转化24 h样品可明显升高L-02细胞活力,具有极显着性差异（P<0.001）。结论:柴胡水提物的效毒成分具有较高的一致性,提示柴胡效毒二重性特性可能具有相同的物质基础;体外生物转化研究表明柴胡水提物效毒成分在人工胃液、肝微粒体中相对稳定,在人工肠液、肠道菌群发生转化;毒性成分在人工肠液、肠道菌群中含量降低并改变L-02细胞活力。
张弛[4]（2020）在《基于3D HepaRG细胞模型的化学性肝损伤的评价》文中提出目的肝脏是外源性化合物代谢的主要场所,也是化学品及其代谢产物毒作用的重要靶器官。对来自体内和体外的许多物质如药物、毒物以及体内某些代谢产物,肝脏可通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形形式排出体外。据估计,超过1100种常用的化学药物、草药、天然产品、维生素、矿物质和膳食补充剂具有潜在的肝毒性。化学性肝病种类繁多,其中药物性肝损伤是最常见的急性肝衰竭原因,给世界各地的医疗系统造成巨大的经济负担。因此,需要对化学品的肝毒性进行及时准确的评估以避免对人体造成危害。然而,化学品风险评估仍存在许多困难和障碍。例如,由于参与药物吸收、分布、代谢、排泄的肝脏蛋白和酶的表达及催化活性存在物种差异,动物模型不能准确复制人类肝损伤的病因和发病机制;二维（Two-dimentional,2D）细胞体外模型相比于以动物为载体的传统毒性测试有高通量、廉价等优势,但仍存在缺乏代谢酶活性和有限的生长活性等问题。因此,建立能够模拟人体肝细胞的体外模型,对体外化学性肝损伤评估有重大意义。越来越多人肝细胞来源的体外系统已经被开发并应用于预测化学性肝损伤的风险。三维（Three-dimentional,3D）体外模型是进行毒性试验和安全性评价的新兴工具,相比于传统2D细胞可以更好的模拟人体的内环境和组织功能。Hepa RG细胞被视为人原代肝细胞（Primary human hepatocytes,PHH）的替代物,近年来广泛应用于肝脏疾病的探究和药物肝毒性的评估。故本研究拟利用Hepa RG细胞系建立3D肝细胞模型,并比较2D细胞与3D细胞在代谢功能上的差异;应用建立的模型对肝毒性药物对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）和曲格列酮（Troglitazone,TRO）所诱导的肝毒性进行评价;根据肝毒性评价结果选择合适的体外模型,应用该模型对蓖麻毒素和相思子毒素进行安全性评估并探究其毒性机制。方法1.采用低吸附法构建3D Hepa RG细胞模型,以1000、2000、6000/孔的密度接种于96孔板,在接种后第1、3、7、10、14天分别记录细胞形态学变化并利用P450-Glo试剂和蛋白质印记法（Western blotting,WB）比较2D/3D Hepa RG细胞CYP3A4酶活力和蛋白表达差异;2.2D/3D Hepa RG细胞给予APAP（0.16、0.8、4、20 m M）,应用Alamar blue法测定细胞存活率,高内涵成像分析检测线粒体活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）和线粒体丰度,比较APAP引起的肝细胞损伤;通过液相质谱法（Liquid chromatography–mass spectrometry,LC-MS）检测2D/3D Hepa RG细胞中APAP的代谢产物,并进行比较;3.3D Hepa RG细胞给予TRO（3.125,6.25,12.5,25,50μM）处理不同时间后,应用Alamar blue法测定细胞存活率,检测线粒体ROS、MMP和线粒体丰度;4.给予3D Hepa RG细胞蓖麻毒素和相思子毒素（1.25、2.5、5、10和20 ng/m L）,处理后,测定细胞存活率,并检测线粒体ROS和线粒体丰度。结果1.采用低吸附法构建了3D Hepa RG模型,在第3天时,细胞自发聚集形成致密的球形。以1000、2000、6000/孔的接种密度分别进行接种,在第7天时分别形成直径约为180、250和300μm的球体细胞,其直径大小和形态稳定;2.在第7天时,对比2D Hepa RG细胞和3D Hepa RG细胞CYP3A4酶活力和表达差异,发现3D Hepa RG细胞比2D细胞表现出更高CYP3A4活性和表达,提示3D Hepa RG细胞比2D细胞具有更强的代谢能力;3.APAP在2D和3D Hepa RG细胞中的细胞存活率均呈剂量依赖性下降,但3D Hepa RG细胞在更低剂量（0.8 m M）下表现出细胞毒性;APAP诱导2D和3D培养的Hepa RG细胞表现出线粒体ROS累积和MMP丧失,并且3D培养的细胞对APAP诱导的线粒体氧化应激和功能障碍的敏感性比2D培养的细胞更高,提示线粒体相关指标可以作为3D培养的Hepa RG细胞的毒性敏感生物标志物;3D Hepa RG细胞比2DHepa RG细胞产生更多的APAP-GSH和APAP-硫酸盐（APAP-sulfate）,亦提示3D Hepa RG细胞具有更强的代谢能力;4.通过PBPK模型预测APAP口服中毒剂量下人体肝脏组织中APAP浓度为1.19 m M,比较2D和3D细胞中评估的线粒体毒性生物标志物在体外的最低显着毒性浓度,发现3D细胞模型比2D细胞模型更接近PBPK预测值,提示3D细胞模型更敏感且更接近人体肝脏浓度,说明3D细胞模型更适合用于化学性肝损伤评估;5.TRO可剂量依赖性地降低3D Hepa RG细胞的存活率,应用高内涵成像分析检测其诱导的线粒体损伤,发现3D Hepa RG细胞表现为线粒体ROS生成增加,MMP和线粒体丰度下降;6.蓖麻毒素可剂量依赖性地降低3D Hepa RG细胞的存活率,IC50值为21.98ng/m L,并引起3D Hepa RG线粒体ROS升高,10 ng/m L时为对照组的148%;7.相思子可剂量依赖性地降低3D Hepa RG细胞的存活率,IC50值为8.73ng/m L,并引起3D Hepa RG线粒体ROS升高,在2.5 ng/m L、10 ng/m L时分别升高至对照组的112%和150%。结论1.采用低吸附法成功构建了3D Hepa RG模型,其代谢酶表达和活力均比2D Hepa RG细胞更具优势,更能准确地对化学性肝损伤进行评估,表明3D Hepa RG模型在评估药物性肝损伤等肝毒性测试中具有潜在的重要应用价值;2.蓖麻毒素和相思子毒素对3D Hepa RG细胞的细胞毒性和线粒体毒性呈明显剂量依赖性,线粒体损伤可能是蓖麻毒素和相思子毒素致肝细胞毒性的关键事件。
林佳昀[5]（2020）在《PSAT1促进肝硬化门静脉高压症的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:肝硬化门静脉高压症易感基因的筛选、验证及机制研究。方法:检索GEO（基因表达综合数据库）,使用生物信息学方法筛选肝硬化门静脉高压症的易感基因,验证并确定进一步研究的候选基因。使用q PCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）实验检测相关细胞、动物和临床标本,验证该基因的表达量在疾病的细胞和标本中同样上调,并与α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）和COL1A1（Ⅰ型胶原α1）的表达量呈正相关。建立该基因过表达和沉默的LX-2（人肝星状细胞系）稳转株。使用WB（免疫印迹）实验检测α-SMA和COL1A1,验证其促进LX-2活化;使用CCK-8（细胞计数）实验验证其促进LX-2增殖;使用ELISA（酶联免疫吸附测定）实验检测培养基中TGF-β（转化生长因子-β）,验证其促进LX-2分泌TGF-β;使用WB实验检测相关蛋白,验证其激活TGF-β/SMAD信号通路。在沉默该基因的LX-2的培养基内添加TGF-β,以及在过表达该基因的LX-2的培养基内添加SB431542（TGF-β/SMAD信号通路抑制剂）,检测LX-2活化状态和增殖能力的变化,验证该基因通过TGF-β和TGF-β/SMAD信号通路促进LX-2的活化和增殖。结果:使用生物信息学方法分析GSE55747数据集,得出PSAT1（磷酸丝氨酸氨基转移酶1）和CD63在肝组织中的基础表达量较高,并且在肝硬化标本中显着上调。由于PSAT1更具创新性,故将其确定为进一步研究的候选基因。使用PDGF（血小板衍生生长因子）激活LX-2后,PSAT1的表达量显着上调;四氯化碳造模的肝硬化门静脉高压症大鼠,肝脏中PSAT1的表达量显着上调;肝硬化门静脉高压症患者肝脏中PSAT1的表达量显着上调,与α-SMA和COL1A1的表达量呈正相关。LX-2过表达、沉默PSAT1后,α-SMA和COL1A1的表达量显着上调、下调;增殖能力显着增强、减弱;TGF-β浓度显着增加、降低;TGFBR1（转化生长因子-βⅠ型受体）、磷酸化SMAD2、磷酸化SMAD3、SMAD4的表达量显着上调、下调,SMAD7的表达量显着下调、上调。LX-2沉默PSAT1并添加TGF-β后,α-SMA和COL1A1的表达量由下调变为上调,细胞增殖能力由减弱变为增强;LX-2过表达PSAT1并抑制TGF-β/SMAD信号通路后,α-SMA和COL1A1的表达量由上调变为下调,细胞增殖能力由增强变为减弱。结论:PSAT1和CD63是肝硬化门静脉高压症的易感基因。PSAT1的表达量在激活的LX-2、肝硬化门静脉高压症大鼠和患者的肝脏中显着上调,患者肝脏标本中PSAT1的表达量与α-SMA、COL1A1的表达量呈正相关。PSAT1通过TGF-β和TGF-β/SMAD信号通路促进LX-2的活化和增殖。
郭城[6]（2020）在《胆汁淤积症肠道微生态学的临床与基础研究》文中研究说明第一部分胆汁淤积症患儿肠道微生态学变化与肝功能指标的相关性研究目的:观察胆汁淤积症患儿肠道微生态学变化,力图发现特征性菌群变化规律;阐明胆汁淤积症患儿肠道微生态学变化与肝脏功能指标的相关关系;寻找婴儿胆汁淤积症（Infantile Cholestatic,IC）潜在肠道菌群（Gut Microbiota,GM）的生物标志物。方法:自2017年1月至2018年1月,收集住院患儿符合纳入标准的胆汁淤积症婴儿及门诊健康查体的婴儿,分为健康对照组（H组,n=37例）和婴儿胆汁淤积症组（IC组,n=43例）,收集其性别、年龄（月）、分娩方式、喂养方式、临床诊断等信息,同时检测肝脏功能,并收集粪便通过16sr DNA分析GM构成,分析GM与肝脏功能指标的相关性,采用随机森林模型筛选、验证生物标志物,用PICRUST预测肠道菌群功能。结果:1.检测43例胆汁淤积症患儿和37例健康婴儿的肠道菌群构成。2.所有样本以双歧杆菌属、类杆菌属、肠球菌属、布劳特氏菌属、罗斯氏菌属和粪便杆菌属为主。IC组GM多样性显着低于H组（P=0.013）。喂养方式对H组、IC组间的GM差异有影响（P=0.009）。3.IC、H两组GM在属水平上丰度前10的属中,有13个存在丰度差异,包括双歧杆菌属、拟杆菌属、链球菌属、肠球菌属和葡萄球菌属。IC组GM的共存网络更复杂,叶状杆菌属、瘤胃球菌属和厌氧菌属是IC组共存网络中的核心节点。采用随机森林模型分析,确定了罗斯氏菌属、Eggerthella、叶状杆菌属和布劳特氏菌属,可作为生物标记物高准确度区分IC患儿和健康婴儿（AUC>0.97）。4.利用京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）注释发现,IC患儿中与脂质代谢、外源性生物降解和代谢以及各种疾病相关的功能类别增多,IC患儿与氨基酸代谢和维生素代谢相关的功能类别减少。5.GM组成与肝功能指标之间存在显着相关性,巨球型菌属与总胆红素、间接胆红素呈正相关;γ-GGT与Parasutterella呈正相关,与链球菌属呈负相关。第二部分ANIT诱导亚急性胆汁淤积模型大鼠肠道微生态变化目的:胆汁淤积性肝病病因复杂,多为慢性疾病过程,第一部分的临床研究表明,胆汁淤积肝病患儿发生特征性肠道微生态变化,本实验研究目的是:观察亚急性胆汁淤积SD模型大鼠肠道菌群的特征性构成是否贯穿整个疾病过程?亚急性胆汁淤积SD模型大鼠肠道菌群的特征性变化在疾病的发生发展过程中是因?是果?及可能机制?探索胆汁淤积前后及疾病进展过程中肠道菌群变化与临床相关指标如肝功能和肝脏纤维化指标的关联性。方法:将试验的SD大鼠随机分为2组:正常对照组（N组,n=8只）和亚急性胆汁淤积模型组（M组,n=28只）。M组大鼠在造模的第1天、第7天、第14天、第21天时分别给予α-萘异硫氰酸酯（α-Naphthylisothiocyanate,ANIT）（75mg/kg）灌胃1次制作亚急性胆汁淤积模型,N组大鼠正常进食水。于造模的第3天、第9天?第16天和第23天时,M组分别处死7只大鼠,N组分别处死2只大鼠。采血检测肝功能丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase,AST）、总胆红素（Total Bilirubin,TBIL）、间接胆红素（Direct Bilirubin,DBIL）、胆汁酸（Total Bile Acids,TBA）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（γ–glutamyltranspeptidase,γ–GT）及肝纤维化指标透明质酸（Hyaluronic Acid,HA）、III型前胶原（Procollagen III,PCIII）、IV型胶原（Collagen IV,c IV）、层粘连蛋白（Laminin,LN）;采集肝脏组织行HE染色,观察肝脏病理,同时留取粪便,采用16sr DNA分析肠道菌群组成。结果:1.在造模第3天、第9天、第16天和第23天时M组大鼠肝脏功能和肝纤维化指标（HA）明显高于N组,肝脏病理均呈现胆汁淤积表现。2.M组大鼠肠道菌群丰度、物种多样性与N组比较没有统计学差异,但两组大鼠肠道菌群物种构成存在差异。在门水平上,M组大鼠肠道菌群以拟杆菌门为主,N组以厚壁菌门为主。在属水平上,造模第9天时,M组大鼠粪便菌群中双歧杆菌属、乳杆菌属、瘤胃球菌属丰度明显低于N组（P<0.05）;Parabacteroides及普氏菌属明显高于N组（P<0.05）;造模第23天时M组大鼠粪便菌群中双歧杆菌属、乳杆菌属、丰度明显低于N组（P<0.05）,Parabacteroides明显高于N组（P<0.05）。LEf Se分析:双歧杆菌属、瘤胃球菌属、普氏菌属存在统计学差异。3.双歧杆菌属、乳杆菌属与ALP、AST、ALT、TBA均成负相关;瘤胃球菌属与TBA及ALP成负相关;Parabacteroides与TBIL、TBA、ALP、AST、ALT成正相关,普氏菌属与TBA成正相关（P<0.05）。第三部分观察不同干预措施对ANIT诱导亚急性胆汁淤积模型大鼠的保肝利胆作用及肠道菌群变化的机制研究目的:基于“肠-肝轴”新的治疗理念被应用于胆汁淤积性肝病中,结合我们前期临床和基础实验结果,第三部分研究目的:1.观察不同干预措施对亚急性胆汁淤积模型大鼠的保肝利胆效果;2.探索不同干预措施对其肠道菌群的动态影响;3.对其相关机制进行研究。方法:将实验的SD大鼠随机分为5组:正常对照组（N组,n=16）、熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic,UDCA）干预组（A组,n=22）、鼠李糖乳杆菌GG（Lactbacillus rhamnosus GG,LGG）干预组（B组,n=22）、LGG+UDCA联合干预组（C组,n=22）、疾病观察组（M组,n=22）。基于第二部分亚急性胆汁淤积模型造模方法,对A、B、C、M组制作亚急性胆汁淤积模型。在造模第3天开始给予各组大鼠药物干预,即A组每日UDCA100mg/kg;B组每日灌服LGG 2.5ml,C组每日先灌服UDCA 100mg/kg、1小时再灌服LGG 2.5ml 1次/日;M组无额外干预措施,干预21天。分别于实施干预措施后的第1天、7天、14天、21天时各组处死大鼠4只,检测肝脏功能指标、肝纤维化指标,行肝脏病理,采用Western blot检测肝脏法尼酯X受体（Farnesoid X Receptor,FXR）蛋白、肝脏胆固醇7-羟化酶（cholesterol 7-alpha hydroxy-lase,CYP7A1）蛋白,回肠FXR蛋白及Na+依赖性胆酸盐转运蛋白（apical sodium-dependent bile acid transporter,ASBT）蛋白表达。在实施干预措施第7天和第21天时分别处死大鼠7只,采集肠内容物行16sr DNA分析肠道菌群组成。结果:1.UDCA干预对胆汁淤积模型大鼠肝脏功能指标影响不大;LGG干预能够降低肝脏功能各项指标（P<0.05）,LGG与UDCA联合应用未呈现协同或拮抗作用;药物干预与时间没有交互效应。2.A、B、C、M组大鼠的肝脏纤维化指标透明质酸（Hyaluronic Acid,HA）均明显高于N组（P<0.05）。UDCA与LGG对于肝纤维化指标影响没有交互效应（P>0.05）。药物干预第1周时,C组大鼠HA水平明显低于A、B、M组（P<0.05）。3.药物干预第1周、第2周、第3周时,A、B、C组大鼠肠ASBT蛋白表达量均低于M组（P<0.05）,肠FXR蛋白表达量均高于M组（P<0.05）,A、B组肝脏FXR蛋白表达量均高于M、C组（P<0.05）;C组肝脏FXR蛋白表达量高于M组（P<0.05）;药物干预第1周、第3周时,A、B、C组大鼠肝脏CYP7A1蛋白表达量均低于M组（P<0.05）。4.NMDS法分析A、B、C组粪便菌群构成相似度高,M与N组及药物干预组（A、B、C组）大鼠肠道菌群构成存在可比性。各时间点、各组肠道菌群物种多样性差异不显着（P>0.05）。N组大鼠肠道菌群中以厚壁菌门、放线菌门为主;A、B、C、M组大鼠在药物干预第7天、第23天时,以拟杆菌门为主;A、B、M组大鼠放线菌门丰度明显低于N组（P<0.05）,C组放线菌门明显高于A、B组（P<0.05）。在药物干预第7天时,A、B、M组大鼠肠道双歧杆菌属丰度明显低于N组（P<0.05）,B、C组双歧杆菌属丰度明显高于A、M组（P<0.05）。在药物干预第23天时,B组双歧杆菌属丰度高于A、C、M组。5.线性相关性分析发现:双歧杆菌属与ALP、AST、ALT、TBA成负相关（P<0.05）;乳杆菌属与ALP成负相关（P<0.05）,瘤胃球菌属与AST、ALT及ALP成负相关（P<0.05）,Parabacteroides与TBIL、TBA、ALP、AST、ALT成正相关（P<0.05）。结论:1.IC患儿与健康婴儿肠道菌群存在差异,细菌群落多样性降低,菌群共存网络复杂,叶状杆菌、瘤胃球菌和厌氧菌是共存网络中核心节点。罗斯氏菌属、Eggerthella、叶状杆菌属和布劳特氏菌属可作为高准确度区分IC患儿和健康婴儿的生物标记物。肠道微生态组成与肝功能指标间存在关联。2.成功制作了亚急性胆汁淤积大鼠模型,与临床胆汁淤积性肝病的病理过程相吻合,满足临床观察肝脏损害指标和肠道微生态学变化需求。3.亚急性胆汁淤积模型大鼠胆汁淤积前后及进展过程中存在肠道微生态学动态改变,这种胆汁淤积后的肠道特征性菌属变化是一种适应性改变,随时间推移,菌群结构也趋于稳态。4.胆汁淤积模型大鼠早期肠道中双歧杆菌属、瘤胃球菌属减少和普氏菌属比例变化是早期胆汁淤积的特征性生物标志。5.胆汁淤积模型大鼠肠道双歧杆菌属、乳杆菌属及Parabacteroides与肝脏功能变化存在关联。6.LGG能够改善胆汁淤积模型大鼠肝脏各项指标,在疾病早期能降低肝纤维化指标HA。7.LGG通过直接或间接促进肝脏和回肠FXR蛋白表达,抑制肝CYP7A1蛋白表达,抑制胆汁酸产生;抑制肠ASBT蛋白表达,减少胆汁酸重吸收,减轻胆汁淤积和降低胆汁酸对肝脏进一步损伤,同时间接降低HA。8.LGG通过改善肠道生境扶正菌群结构,减轻肠道菌群失衡,发挥对肝脏的保护作用。9.因本研究观察时间和样本数量限制,未发现UDCA对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠的保护肝脏作用和对肠道微生物群的影响。10.UDCA联合LGG应用对胆汁淤积模型鼠的肝脏功能、肝纤维化指标未产生协同或拮抗作用,需大样本研究加以证实。
罗丹丹[7]（2020）在《八氢姜黄素立体异构体对药物代谢酶和肝损伤的作用研究》文中研究表明目的:姜黄（Rhizoma Curcumae Longae）是姜科植物姜黄（Curcumalonga L.）的干燥根茎,主要活性成分为姜黄素（Curcumin）。由于抗氧化和抗炎活性较高,姜黄素被广泛用于肝脏相关疾病的预防和治疗。然而,姜黄素的稳定性、溶解度和生物利用度较差,临床应用价值很低。因此,姜黄素的体内代谢产物如四氢姜黄素（Tetrahy drocurcumin）和八氢姜黄素（Octahydrocurcumin）,成为近几年国内外的生物医学研究热点。八氢姜黄素是姜黄素的氢化代谢产物,具有比姜黄素更强的抗炎和抗氧化活性。但是,由于获取困难,未见八氢姜黄素的肝保护作用研究。八氢姜黄素的化学结构中含有2个手性C原子。由于结构对称性,产生了 2个立体异构体,分别是（3R,5S）-octahydrocurcumin（又称 Meso-octahydrocurcumin,Meso-OHC）和（3S,5S）-octahydrocurcumin（（3S,5S）-OHC）。然而,姜黄素的体内代谢是否能够产生八氢姜黄素立体异构体未见报道。当立体异构体作用于人体的手性环境时,其立体结构在生物体内引起不同酶系的分子识别造成“手性识别”现象,从而产生不同的药效。但是,关于八氢姜黄素的2个立体异构体,是否能在生物体内引起“酶系识别”作用,从而产生差异性的药理活性未见报道。本文首先采用对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）诱导的小鼠急性肝损伤模型,探讨八氢姜黄素的肝保护作用及相关机制;通过高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）检测大鼠灌胃姜黄素之后不同代谢样品,确认八氢姜黄素立体异构体是否存在;采用快速柱层析结合萃取法制备Meso-OHC和（3S,5S）-OHC纯品,用于后续动物实验;采用制备液相法制备Meso-OHC和（3S,5S）-OHC单体,用于后续化学结构鉴定和细胞实验;采用“Cocktail”探针药物法研究Meso-OHC和（3S,5S）-OHC对L-02细胞的药物代谢酶影响,以探讨立体异构体是否会引起“酶系识别”作用;采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究Meso-OHC和（3S,5S）-OHC的肝保护作用及相关机制,以探讨立体异构体间的差异性药理活性。方法和结果:1.八氢姜黄素抗APAP诱导的急性肝损伤的作用及机制研究采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究八氢姜黄素的肝保护作用,并以姜黄素和四氢姜黄素为参考,确认其作用强度。实验过程中,测定下述指标以探讨八氢姜黄素的作用及机制:测定ALT和AST活性;制备H&E病理切片;测定肝组织中GSH、SOD、CAT、T-AOC、MDA和ROS水平;体外肝微粒体孵育法测定CYP2E1酶活性;RT-PCR 法测定 CYP2E1、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的 mRNA 表达;Western blot法检测CYP2E1、GCLC、GCLM、NQO1和HO-1的总蛋白、胞浆Keap1和核内外Nrf2蛋白的表达;分子对接探讨八氢姜黄素与CYP2E1酶和Keap1蛋白之间的结合机制。实验结果表明,八氢姜黄素（25,50和100 mg/kg）具有良好的抗APAP肝损伤作用,且呈剂量依赖性。八氢姜黄素可显着改善小鼠肝功能（ALT和AST）及肝脏组织病理状态,并且作用强度优于姜黄素和四氢姜黄素。八氢姜黄素抗APAP肝损伤的主要作用机制为:改善肝脏氧化应激状态（提高GSH、SOD、CAT和T-AOC水平,降低MDA和ROS水平）;与CYP2E1酶结合并抑制其活性和表达;与Keap1蛋白结合,抑制Keap1蛋白的表达,继而促进Nrf2蛋白核转位,最终激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路;诱导Keap1-Nrf2抗氧化应激通路下游目的基因（GCLC、GCLM、NQO1和HO-1）的表达。2.姜黄素大鼠体内代谢研究以大鼠为研究对象,收集大鼠灌胃姜黄素（100 mg/kg）后的血液、肝脏、尿液和粪便样品。采用HPLC法分析代谢样品中是否存在八氢姜黄素立体异构体。实验结果表明,大鼠灌胃姜黄素后,其血液、肝脏、尿液和粪便样品中均可检测出八氢姜黄素立体异构体（M1和M2,其中M2极性较大）。此外,2种立体异构体在不同样品中的分布比例有所不同:血液中M2:M1=0.34:1;肝脏中M2:M1=0.73:1;尿液中 M2:M1=4.59:1;粪便中 M2:M1=0.81:1。3.八氢姜黄素立体异构体拆分制备和结构鉴定采用快速柱层析结合萃取法制备M1和M2的纯品,为动物实验提供药物储备;采用制备液相法制备M1和M2的单体,为化学结构鉴定和细胞实验提供药物储备;采用液相质谱（Liquid mass spectrometry,LC-MS）、核磁共振氢谱与碳谱（Nuclear paramagnetic resonance spectroscopy,NMR）、比旋光度以及X-射线单晶衍射法确定M1和M2的绝对构型。采用快速柱层析结合萃取法获得M1和M2的纯品,纯度均大于95%;经制备液相纯化后获得M1和M2的单体,纯度大于98%。经LC-MS和1H-NMR检测分析后,M1和M2的结构数据基本一致,均符合八氢姜黄素相关文献记录,确认两者均为八氢姜黄素。经13C-NMR和比旋度检测分析,确认M1和M2分别为Meso-OHC和（3S,5S）-OHC,符合相关文献记录。此外,采用溶剂扩散法首次制备出了 M1单晶,经X-射线单晶衍射法检测分析后,确认M1的绝对构型为Meso型。4.八氢姜黄素立体异构体对L-02细胞药物代谢酶的作用研究采用“Cocktail”探针药物法结合分子对接,评价Meso-OHC和（3S,5S）-OHC对L-02 的药物代谢酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8、CYP2E1 和 UGTs）活性影响及相关机制;采用RT-PCR法,测定Meso-OHC和（3S,5S）-OHC对CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8、CYP2E1 和 UGTs 酶 mRNA水平的影响。实验结果表明,6.25、12.5、25、50、100 和 200μM 剂量下,Meso-OHC 和（3S,5S）-OHC对L-02细胞活力无影响,可用作后续细胞实验剂量。6.25～100μM剂量下,Meso-OHC和（3S,5S）-OHC对L-02细胞的大部分药物代谢酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8和UGTs）的活性或者表达无显着影响,表明其潜在的药物与药物之间相互作用（Drug-drug interaction,DDI）风险较低。此外,Meso-OHC 和（3S,5S）-OHC均可以抑制CYP2E1酶的活性和表达,并且Meso-OHC的作用强度显着优于（3S,5S）-OHC。以上结果表明,CYP2E1酶对Meso-OHC和（3S,5S）-OHC具有选择性识别作用。分子对接进一步表明,Meso-OHC和（3S,5S）-OHC均可与CYP2E1酶活性部位结合,但结合部位和结合能有所不同。5.八氢姜黄素立体异构体抗APAP诱导的急性肝损伤作用和机制研究采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究Meso-OHC和（3S,5S）-OHC的肝保护作用和机制。实验过程中,测定下述指标以探讨Meso-OHC和（3S,5S）-OHC的作用和机制:测定ALT和AST活性;制备H&E病理切片;测定GSH、SOD、CAT、T-AOC和MDA水平;免疫组化法测定3-NT和4-HNE的表达;Elisa法测定CYP2E1和UGT1A1 酶活性、TNF-α 和 IL-1β水平;RT-PCR 测定 CYP2E1、UGT1A1、TNF-α、IL-1β、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的基因表达;Western blot 法检测 CYP2E1、UGT1A1、IκBα、p-IκBα、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的总蛋白表达,胞浆 Keap1、核内外p65和Nrf2蛋白表达;分子对接法研究八氢姜黄素立体异构体与p65蛋白和Keap1蛋白之间的结合机制。实验结果表明,Meso-OHC和（3S,5S）-OHC（25,50和100mg/kg）具有良好的抗APAP肝损伤作用,且呈剂量依赖性。Meso-OHC和（3S,5S）-OHC均可显着改善小鼠肝功能（ALT和AST）及肝脏组织病理状态,并且Meso-OHC的作用强度优于（3S,5S）-OHC。Meso-OHC和（3S,5S）-OHC的肝保护主要作用机制为:改善肝脏氧化应激状态（提高GSH、SOD、CAT和T-AOC水平,降低MDA、3-NT和4-HNE的水平）;抑制CYP2E1酶活性和表达;诱导UGT1A1酶活性和表达;与Keap1蛋白结合,抑制Keap1蛋白的表达,进而促进Nrf2核转位,最终激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路;诱导Keap1-Nrf2抗氧化应激通路下游目的基因（GCLC、GCLM、NQO1和HO-1）的表达;与p65蛋白结合,抑制IκBα向p-IκBα的转化,进而抑制p65蛋白核转位,最终抑制NFκB（p65）炎症通路的活化;抑制NFκB（p65）炎症通路下游目的基因（TNF-α和IL-1β）的表达。此外,两者作用机制存在一定差异:Meso-OHC激活Keap1-Nrf2通路的作用强度优于（3S,5S）-OHC,（3S,5S）-OHC抑制NFκB（p65）炎症通路的作用强度优于Meso-OHC。结论:本文的研究结果首次证实了八氢姜黄素具有良好的抗APAP诱导的肝损伤作用,主要机制为抑制CYP2E1酶和激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路。姜黄素的体内代谢可以产生八氢姜黄素立体异构体,并且2种八氢姜黄素立体异构体在不同的代谢部位（血液、肝脏、尿液和粪便）中的分布状况有所不同。CYP2E1酶对八氢姜黄素立体异构体具有选择性识别作用,主要机制为结合能和结合位点不同。八氢姜黄素立体异构体具有抗APAP诱导的肝损伤作用,主要机制为抑制CYP2E1酶、激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路、抑制NFκB（p65）炎症通路的活化。此外,八氢姜黄素立体异构体在APAP诱导的肝损伤模型中,存在差异性的肝保护行为:Meso-OHC对小鼠肝功能的改善作用优于（3S,5S）-OHC;Meso-OHC激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路的作用强度优于（3S,5S）-OHC;（3S,5S）-OHC抑制NFκB（p65）炎症通路的作用强度优于Meso-OHC。
孙鑫[8]（2019）在《基于肝脏自然杀伤细胞与肝星状细胞的关系探讨扶正化瘀方联合恩替卡韦有效逆转乙肝肝硬化的免疫调节机制》文中提出目的:观察肝脏自然杀伤细胞在乙肝肝硬化及肝癌临床肝组织样本中的表型变化特点,寻找乙肝肝硬化及肝癌中肝内NK细胞的相关病理分子;体内动物实验比较分析中药扶正化瘀方联合抗病毒药物恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝脏自然杀伤细胞的免疫调控作用,进一步体内清除NK细胞后,观察联合用药方案对抗乙肝背景肝纤维化药效的影响;体外探讨说明中药扶正化瘀方通过提高NK细胞对HSC的识别杀伤活性,抑制HSC活化的抗肝纤维化的免疫调控机制。本论文分为四个部分。方法:1、收集2017年11月至2018年10月期间在上海交通大学附属仁济医院肝移植中心行外科手术住院患者的肝组织样本以及术前临床基线资料,HE及天狼猩红病理染色观察肝组织炎症及纤维化程度,采用流式细胞术检测各肝组织样本中NK细胞的数量、亚型以及表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46的表达,Pearson相关性分析探索NK细胞数量、亚型及表面激活型受体的表达与相应临床基线资料实验室指标之间的相关性,以及其与肝纤维化天狼猩红染色面积参数的相关性,通过免疫组化双重染色技术对激活型NK细胞与活化HSC进行共定位,观察不同组别的共表达差异。2、采用HBV转基因小鼠复合10%CCl4腹腔注射诱导乙肝背景肝纤维化小鼠模型,以野生型小鼠及单纯HBV转基因小鼠为对照,造模2周后给予扶正化瘀方、恩替卡韦、扶正化瘀方联合恩替卡韦干预并继续造模4周,观察小鼠的一般情况,计算脏器指数,检测小鼠血清HBs Ag、HBe Ag、HBV-DNA及肝组织HBs Ag、HBc Ag病毒学指标,ALT、AST、AKP、TBil、Alb等血清肝功能生化指标,观察肝组织炎症及纤维化病理学变化,检测肝组织羟脯氨酸的含量,流式细胞术检测肝内淋巴细胞亚群变化以及NK表面激活型受体NKG2D的表达特点,免疫荧光染色观察HSC活化与静止状态下的NKG2D配体RAE-1分子的表达差异。3、同上方法制备乙肝背景肝纤维化小鼠模型,同时采用ASGM1腹腔注射清除体内NK细胞,以同基因背景野生型小鼠为对照,设复合模型+Rabbit Ig G组、复合模型+Anti-ASGM1组、扶正化瘀方联合恩替卡韦干预+Rabbit Ig G组、扶正化瘀方联合恩替卡韦干预+Anti-ASGM1组,10%CCl4腹腔注射造模同时并灌胃给药干预4周,记录小鼠体重及一般情况,计算脏器指数,检测小鼠血清HBs Ag、HBe Ag、HBV-DNA病毒学指标,ALT、AST、AKP血清肝功能生化指标,流式细胞术检测肝内NK细胞清除情况以及观察NK细胞清除后肝内主要淋巴细胞亚群的变化,以HE和天狼猩红病理染色评价肝组织炎症及纤维化程度,结合肝组织羟脯氨酸的含量评价抗肝纤维化药效。4、体外以人外周血来源的NK92细胞株和人肝星状细胞株LX-2为研究对象,首先采用CCK8法测定扶正化瘀方对NK92及LX-2的最大无毒浓度,在无毒浓度范围选择3～5个药物浓度进行NK92细胞功能和活性的评价,Annexin V/7-AAD复染法检测NK92细胞凋亡,荧光定量PCR检测药物孵育NK92细胞株8h和16h后表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46的m RNA水平,流式细胞术检测并验证NK92细胞表面分子NKG2D的表达变化,ELISA法检测药物孵育NK92后其细胞因子IFN-γ和颗粒酶B的分泌水平,以聚肌胞苷酸Poly I:C为阳性对照药物,在NK92与K562共培养杀伤体系中评价药物对NK92细胞株杀伤功能的影响,最后以不同浓度扶正化瘀方预孵育的NK92细胞株与人肝星状细胞株LX-2共培养5h,流式细胞术检测NK92细胞表面激活型受体NKG2D的表达,细胞免疫荧光染色观察LX-2细胞的活化（α-SMA的表达）以及其对表面RAE-1分子的表达情况。结果:1、通过对正常供肝组9例、乙肝肝硬化组8例、乙肝肝癌组12例患者的临床术前基本资料统计分析和组间比较,发现三组人群平均年龄依次递增,乙肝肝硬化组较正常供肝组患者血红蛋白（Hb）明显降低,血小板计数（PLT）显着降低,中性粒细胞百分比明显升高,凝血酶原时间（PT）明显延长,凝血国际标准化比值（INR）明显增大;乙肝肝癌组较正常供肝组患者血小板计数（PLT）显着降低,中性粒细胞百分比显着升高,γ-谷酰胺转酞酶（γ-GGT）显着升高;乙肝肝癌组患者血小板计数（PLT）、γ-谷酰胺转酞酶（γ-GGT）均明显高于乙肝肝硬化组。通过病理观察,乙肝肝硬化组肝组织大量炎性细胞浸润,纤维化明显,乙肝肝癌组明显炎性细胞浸润伴弥漫性纤维化,部分样本仍可见癌细胞增生活跃。流式细胞术检测肝内NK细胞数量、亚型及表面激活型受体结果显示,与正常供肝组比较,乙肝肝硬化组肝内NK细胞比例明显降低,乙肝肝硬化组与乙肝肝癌组肝内NK细胞表面NKG2D分子表达均明显减少,乙肝肝癌组肝内NK细胞表面NKp46分子表达明显减少;乙肝肝癌组肝内NK细胞比例明显高于乙肝肝硬化组,NKp46的表达明显低于乙肝肝硬化组。Pearson相关性分析结果显示,肝内NK细胞占淋巴细胞的比例与患者血清白蛋白（Alb）水平呈正相关;肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D、NKp44、NKp46的表达均与凝血酶原时间（PT）和凝血国际标准化比值（INR）呈负相关;NKG2D的表达水平还与肝组织天狼猩红阳性染色面积呈负相关。在乙肝肝硬化组和乙肝肝癌组免疫组化双染图像中可以看出,肝内NKp46的表达减少,且主要表达于α-SMA阳性染色区域周围,而正常供肝组肝组织α-SMA表达极少,NKp46表达散在分布。2、扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝脏自然杀伤细胞免疫调控的体内观察研究发现:与野生型对照组相比,单纯HBV转基因小鼠与HBV转基因复合CCl4模型组小鼠血清HBV-DNA载量均高于1×107IU/ml,血清及肝组织HBs Ag、血清HBe Ag和肝组织HBc Ag均呈阳性表达;与单纯HBV转基因组相比,HBV转基因复合CCl4模型组小鼠血清ALT、AST、AKP、TBil水平显着升高,血清Alb水平显着降低,肝组织细胞坏死,汇管区大量炎症细胞浸润,胶原纤维增生明显,羟脯氨酸含量显着升高,α-SMA和I型胶原表达显着增多,肝内B细胞占淋巴细胞比例升高,NK细胞及NKT细胞占比显着降低,CD4+T细胞占T淋巴细胞比例显着降低,CD8+T细胞占比显着升高,NK细胞表面NKG2D分子表达减少,肝组织RAE-1表达显着减少。与HBV转基因复合CCl4模型组相比,恩替卡韦组、扶正化瘀方组、扶正化瘀方联合恩替卡韦组小鼠血清HBV-DNA载量、HBe Ag水平以及肝功能ALT、AST、AKP、TBil水平均不同程度降低,恩替卡韦组纤维化指标没有明显改善,三组肝内淋巴细胞亚群比例变化均有不同程度改变,其中,恩替卡韦组、扶正化瘀方组、扶正化瘀方联合恩替卡韦组小鼠肝内NK细胞占淋巴细胞比例依次显着增高,NK细胞表面NKG2D分子表达依次增多,扶正化瘀方以及扶正化瘀方联合恩替卡韦组小鼠肝组织RAE-1表达均显着增加。3、体内清除NK细胞后,扶正化瘀方联合恩替卡韦抗乙肝背景小鼠肝纤维化药效观察研究显示:与野生型对照组相比,复合模型+Rabbit Ig G组肝内NK细胞占淋巴细胞比例显着降低,血清HBV-DNA载量高于1×106IU/ml,HBs Ag、HBe Ag均呈阳性表达,ALT、AST、AKP水平显着升高,肝组织大量炎性细胞浸润伴局部坏死、肝细胞气球样变及脂肪变,明显胶原沉积,羟脯氨酸含量增高,肝内免疫细胞群比例紊乱;与复合模型+Rabbit Ig G组相比,复合模型+Anti-ASGM1组肝内NK细胞占比减少更为明显,天狼猩红染色纤维化区域和羟脯氨酸含量均有增加的趋势,而扶正化瘀方联合恩替卡韦干预+Rabbit Ig G组肝内NK细胞占比显着增加,血清HBV-DNA载量和肝功能生化指标均显着降低,肝组织炎症及纤维化明显减轻,羟脯氨酸含量显着减少;与复合模型+Anti-ASGM1组相比,扶正化瘀方联合恩替卡韦干预+Anti-ASGM1组肝内NK细胞占比增加,血清HBV-DNA载量和肝功能生化指标均显着降低,肝纤维化程度轻微改善,羟脯氨酸含量呈现减少的趋势。4、扶正化瘀方体外调节NK细胞杀伤功能的抗HSC活化的作用机制研究发现:扶正化瘀方在100μg/ml及以下的浓度对NK92和LX-2细胞株均无明显毒性,较低浓度（0.1～10μg/ml）的扶正化瘀方对NK92细胞凋亡有保护作用,不同浓度的扶正化瘀方孵育NK92细胞株16h,可不同程度增强NK细胞表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp46的表达以及促进IFN-γ的分泌,扶正化瘀方在无毒浓度范围可呈现剂量依赖性地提高NK92细胞对K562细胞的杀伤功能,预孵育扶正化瘀方的NK92细胞株与LX-2共培养5h后,NK92细胞表面NKG2D分子表达上调,同时LX-2表面RAE-1分子表达增强,α-SMA表达减少。结论:1、乙肝肝硬化及肝癌患者肝内NK细胞数量和功能受到抑制,主要表现在肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D及NKp46表达下调,并通过相关性分析发现其表达与PT和INR水平呈负相关,尤其是NKG2D的表达与肝纤维化程度呈负相关。2、扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠具有抗病毒抗肝纤维化协同治疗的作用,且可纠正乙肝肝纤维化小鼠肝内淋巴细胞免疫紊乱,其抗乙肝肝纤维化的作用可能与恢复NK细胞的数量和功能、增强NKG2D（NK）-RAE-1（HSC）的有效应答有关。3、体内注射Anti-ASGM1清除NK细胞后,肝内NK细胞数量显着减少,肝纤维化进一步加重,扶正化瘀方联合恩替卡韦能够拮抗Anti-ASGM1对该复合模型肝内NK细胞的抑制作用。同时抑制肝内NK细胞的数量和功能,限制了该联合用药方案改善肝纤维化的作用效果。4、扶正化瘀方对NK细胞的功能有正性调节作用,可通过增强NK细胞与HSC细胞表面分子NKG2D-RAE-1的直接接触途径抑制HSC的活化,从而发挥抗肝纤维化的作用。
狄玮[9]（2018）在《春石斛‘红梦幻’类原球茎玻璃化超低温保存中损伤机制的研究》文中指出超低温保存是目前种质资源经济、有效且永久保存的重要方法。但是仍有部分种质无法实现超低温保存或冻存后存活力较低,这种局限性很大程度上源于对超低温保存损伤机制的不完全了解。因此,解答超低温保存中的损伤机制可为揭示极端低温下生命现象提供理论基础,同时对超低温保存技术优化也具有重要意义。本研究以玻璃化超低温保存后再生率低（5.56%）的春石斛’红梦幻’（Dendrobium nobile Lindl.’Hamana Lake Dream’）类原球茎（PLBs）为试材,研究其在玻璃化超低温保存中蛋白质表达谱的变化,分析与PLBs在超低温保存中存活率变化相关的蛋白功能,并获得与PLBs存活率下降密切相关的关键差异蛋白。在此基础上,研究与活性氧（ROS）介导的氧化应激相关的关键差异蛋白在PLBs玻璃化超低温保存中的作用。主要研究结果如下:1)利用TTC染色法检测春石斛PLBs在玻璃化超低温保存程序中存活率下降的关键环节,结果显示各环节均造成PLBs细胞相对存活率不同程度地下降,其中PLBs存活率在预培养和冷冻-解冻环节下降最明显。利用透射电镜观察春石斛PLBs在玻璃化超低温保存程序中的细胞结构变化,结果显示玻璃化超低温保存程序会造成PLBs细胞结构明显的改变甚至破坏,但再生培养后多数细胞结构的改变可以恢复,呈现生活细胞的特征,说明细胞结构改变不是造成PLBs冻存后再生率低的主要原因。2)采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术探究春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序的各环节中的蛋白表达谱,共鉴定到1,747个蛋白质,其中在预培养、装载、PVS2处理、冷冻-解冻和去装载环节中差异表达的蛋白分别有14、17、82、108和63个,主要功能涉及蛋白质周转、碳水化合物与能量代谢、应激与防御以及膜与运输等,且这些蛋白的差异表达与PLBs在玻璃化超低温保存程序中的存活率变化有关。其中,与ROS代谢相关的差异蛋白在PLBs存活率下降幅度较大的预培养和冷冻解冻环节中所占比例较大,推测这些蛋白的差异表达与PLBs存活率明显下降有关。3)检测春石斛PLBs在玻璃化超低温保存程序的不同环节后ROS、氧化应激产物和抗氧化物质的变化,结果表明PLBs存活率下降最明显的预培养和冷冻-解冻环节是氧化应激爆发的关键环节。在玻璃化超低温保存程序的不同环节中添加非酶类ROS清除剂抗坏血酸（AsA）均可提高PLBs冻后存活率;在去装载环节添加0.1 mM AsA对PLBs冻后存活率提高效果最佳,可提高14.34%,检测此时氧化应激指标发现外源AsA可降低ROS水平、提高抗氧化能力并缓解膜脂过氧化损伤。结果表明,ROS介导的氧化应激与春石解PLBs玻璃化超低温保存中存活率的下降密切相关。4)将ROS代谢平衡相关的外源差异蛋白超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙酮酸脱氢酶（PDH）添加在春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序的不同环节中,发现在去装载环节添加SOD、CAT和PDH均可显着提高PLBs冻后存活率,分别可提高5.76%、33.49%和2.49%,并不同程度地降低ROS水平和提高抗氧化物质含量;三者对内源SOD活性和丙二醛含量的影响不同,外源CAT对存活率的提高效果明显优于SOD和PDH,这是由于外源CAT在维持内源SOD的低活性时提高CAT活性更有利于降低ROS水平并减轻膜脂过氧化损伤。结果表明,ROS代谢平衡相关的差异蛋白可减轻春石斛PLBs玻璃化超低温保存中氧化应激的发生。5)为研究春石斛PLBs玻璃化超低温中ROS代谢相关差异蛋白的基因表达变化,首先利用荧光定量技术结合geNorm、NormFinder、Bestkeeper和qBase plus软件从春石斛PLBs的6个候选内参基因中筛选得到EF-1α和ACT基因可作为玻璃化超低温保存中基因表达研究的适宜内参基因。以该内参为参照,检测PLBs中14个ROS代谢相关差异蛋白的基因在玻璃化超低温保存程序中的表达,发现各环节均显着影响ROS介导的氧化应激与细胞凋亡相关基因的差异表达,且非酶类ROS清除剂AsA对PLBs超低温保存中损伤的缓解作用与其在转录水平减轻氧化应激和细胞凋亡有关。多数ROS代谢相关蛋白在玻璃化超低温保存中的表达与其基因表达变化不一致,可能与转录后、蛋白翻译和翻译后水平的调控有关。综上所述,本研究发现春石斛PLBs在玻璃化超低温保存中存活率的变化主要与蛋白质周转、碳水化合物与能量代谢、应激与防御以及膜与运输相关蛋白的差异表达有关,其中与ROS代谢相关的差异蛋白起关键作用。明确了 ROS介导的氧化应激与春石斛PLBs在玻璃化超低温保存中存活率的下降密切相关。验证了 3个ROS代谢平衡相关差异蛋白在春石斛PLBs玻璃化超低温保存中的积极作用。
夏鹏[10]（2016）在《RAGE抗体对大鼠胆道梗阻性肝损伤的抑制作用及其机理研究》文中提出近年来,由胆道梗阻性肝损伤引起的急性肝损伤和肝纤维化/肝硬化患者日趋增多,严重威胁着人类健康。本文从制备高活性高纯度低内毒素的重组小鼠G-CSF蛋白及重组大鼠sRAGE蛋白入手,经免疫新西兰大白兔及利用抗原亲和纯化,制备具有高特异性的兔抗大鼠RAGE多克隆抗体,以此作为治疗胆道梗阻性肝损伤新蛋白药物的原料,然后采用胆道梗阻性肝损伤动物模型--大鼠胆管结扎（BDL）模型,研究其药效,并从基因角度探究其作用机理,旨在为探索和研究治疗胆道梗阻性肝损伤的新药物提供科学依据。主要研究结果如下:1、选择小鼠G-CSF（mG-CSF）和大鼠sRAGE（rsRAGE）两个蛋白作为候选药物并进行表达纯化。构建了pET-30a（+）-mG-CSF表达质粒并利用大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）表达系统获得了高纯度、低内毒素和高生物学活性的G-CSF蛋白,并且发现重组小鼠G-CSF蛋白对肝纤维化的治疗并无显着效果。2、构建了rsRAGE-pPICZαA表达质粒并利用毕赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）表达系统获得了高产量、高纯度、低内毒素和高生物学活性的重组大鼠sRAGE蛋白。研究还揭示了重组大鼠sRAGE蛋白可显着降低CCl4导致的大鼠肝纤维化。3、通过免疫新西兰大白兔及纯化获取了具有高特异性的兔抗大鼠RAGE多克隆抗体,同时应用大鼠胆管结扎模型,研究了RAGE抗体在胆道梗阻性肝损伤的作用。结果显示RAGE抗体可显着改善大鼠生长和生存状况;同时在对肝脏组织的H&E和MASSON染色中发现该抗体可显着降低胆阻性的肝坏死,炎症,纤维化和胆管增生。血清学指标也发现RAGE抗体可显着改善胆阻引起的肝功能损伤和肝纤维化。4、通过体内体外实验,初步探索了RAGE抗体在胆道梗阻性肝损伤中的作用机理。在体内实验中,采用免疫组化和荧光定量技术发现RAGE抗体可显着抑制炎症因子IL-1β的转录水平以及其在损伤部位的表达,从而降低肝脏坏死/炎症;RAGE抗体可显着地调节MMPs/TIMP-1的表达水平,降低肝纤维化;RAGE抗体还可显着地调节Cyp7α1的表达水平,以降低胆管增生。通过体外LX-2肝星状细胞系实验,证实了RAGE抗体可显着降低Col1α1和MMP-9的表达水平。最后,体内和体外实验同时证实了RAGE抗体可显着降低肝星状细胞的活力。综上研究表明,通过检测和分析各类肝硬化相关基因的表达变化,RAGE抗体对胆道梗阻性肝损伤具有明显的保护作用;同时,体外肝星状细胞实验揭示RAGE抗体的作用机理,是通过显着降低肝星状细胞活力和调节相关基因的表达来降低肝纤维化水平。这些研究结果为进一步开发治疗胆道梗阻性肝损伤新药奠定了基础。
二、分离人肝细胞的超低温保存（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、分离人肝细胞的超低温保存（论文提纲范文）
（1）三叶苷对急性肝损伤的保护作用及促肝细胞增殖作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一节 三叶苷对小鼠急性肝损伤保护作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 三叶苷对人正常肝细胞L-02增殖作用的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 黄酮类化合物对急性肝损伤的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LR12 减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LR12 通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LR12 通过促进巨噬细胞分泌CCL20 促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 LR12 通过促进巨噬细胞分泌CCL20 激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 急性肝衰竭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）柴胡水提物的谱-效-毒关系及体外生物转化研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 柴胡效-毒及体外生物转化的研究进展 |
| 1 柴胡降脂作用及肝毒性研究进展 |
| 2 中药谱效及谱毒的相关性研究与应用 |
| 3 中药体外生物转化的研究进展 |
| 4 小结 |
| 第二部分 基于谱效关系的柴胡水提物降脂活性成分群研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 小结 |
| 第三部分 基于谱毒关系的柴胡水提物肝毒性成分群研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 小结 |
| 第四部分 柴胡水提物含药血清对正常人肝L-02 细胞的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 小结 |
| 第五部分 柴胡水提物的体外生物转化研究 |
| 1 柴胡水提物在人工胃、肠液的转化研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 小结 |
| 2 柴胡水提物在肠道菌群的转化研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 小结 |
| 3 柴胡水提物在肝微粒体的转化研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 小结 |
| 第五部分 结语 |
| 1 对柴胡水提物降脂活性及肝毒性的成分群研究结果的讨论 |
| 2 对柴胡水提物体外生物转化研究结果的讨论 |
| 3 本学位论文的意义与创新点 |
| 4 本学位论文的研究不足和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文论着 |
| 科研课题 |
（4）基于3D HepaRG细胞模型的化学性肝损伤的评价（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 2D与3D HepaRG细胞模型的构建和肝毒性评估 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 3D HepaRG细胞模型的构建及其形态学特征 |
| 1.2.2 CYP3A4酶活力 |
| 1.2.3 CYP3A4酶表达 |
| 1.2.4 APAP对2D/3D HepaRG细胞的毒性比较 |
| 1.2.5 TRO对3D HepaRG细胞的毒作用 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 蓖麻毒素和相思子毒素在3D HepaRG细胞中的毒作用研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 蓖麻毒素对3D HepaRG细胞的毒作用 |
| 2.2.2 相思子毒素对3D HepaRG细胞的毒作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 综述 |
| 参考文献 |
| 附录B 代表性文章 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（5）PSAT1促进肝硬化门静脉高压症的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 绪论 |
| 第一部分 易感基因的筛选和验证 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 相关基因表达数据集的检索 |
| 1.2.2 差异表达基因的筛选 |
| 1.2.3 差异表达基因的验证 |
| 1.2.4 统计学方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 相关基因表达数据集的检索 |
| 1.3.2 差异表达基因的筛选 |
| 1.3.3 差异表达基因的验证 |
| 1.3.4 易感基因的筛选和验证的总体流程 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 PSAT1 差异表达及临床相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要器材、耗材、试剂和相关试剂的配制 |
| 2.2.2 细胞系及细胞实验方法 |
| 2.2.3 动物及动物实验方法 |
| 2.2.4 临床标本的采集和保存 |
| 2.2.5 RNA的抽提、反转录反应和qPCR |
| 2.2.6 标本的病理检查 |
| 2.2.7 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 LX-2 激活后PSAT1 的表达量显着上调 |
| 2.3.2 肝硬化门静脉高压症大鼠的造模结果 |
| 2.3.3 肝硬化门静脉高压症大鼠肝脏标本Psat1 的表达量显着上调 |
| 2.3.4 肝硬化门静脉高压症患者肝脏标本PSAT1 的表达量显着上调 |
| 2.3.5 PSAT1、α-SMA、COL1A1 之间的表达量呈正相关 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 PSAT1 的功能及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要器材、耗材、试剂和相关试剂的配制 |
| 3.2.2 PSAT1 过表达、沉默、对照慢病毒的构建 |
| 3.2.3 细胞系及细胞实验方法 |
| 3.2.4 蛋白质的提取、免疫印迹(Western Blot)实验 |
| 3.2.5 细胞增殖(CCK-8)实验 |
| 3.2.6 酶联免疫吸附测定(ELISA)实验 |
| 3.2.7 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PSAT1 慢病毒效果的评价 |
| 3.3.2 PSAT1 促进LX-2 的活化和增殖 |
| 3.3.3 PSAT1 通过TGF-β促进LX-2 的活化和增殖 |
| 3.3.4 PSAT1 通过TGF-β/SMAD信号通路促进LX-2 的活化和增殖 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（6）胆汁淤积症肠道微生态学的临床与基础研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 胆汁淤积症患儿肠道微生态学变化与肝功能指标的相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ANIT诱导亚急性胆汁淤积模型大鼠肠道微生态变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 观察不同干预措施对 ANIT 诱导亚急性胆汁淤积模型大鼠保肝利胆作用及肠道菌群影响机制的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 胆汁酸-肠道微生物相互作用对婴儿胆汁淤积性肝病的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）八氢姜黄素立体异构体对药物代谢酶和肝损伤的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 八氢姜黄素及其立体异构体的研究进展 |
| 一、八氢姜黄素立体异构体的化学结构和来源 |
| 二、八氢姜黄素的生物活性 |
| 第二章 手性化合物的立体选择性和拆分制备 |
| 第三章 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤 |
| 一、APAP诱导的肝损伤的发病机制 |
| 二、APAP诱导的肝损伤的防治策略 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 八氢姜黄素抗APAP诱导的急性肝损伤作用和研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 第二章 姜黄素大鼠体内代谢研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 第三章 八氢姜黄素立体异构体拆分制备和结构鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 第四章 八氢姜黄素立体异构体对L-02细胞药物代谢酶的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 第五章 八氢姜黄素立体异构体在对乙酰氨基酚致肝损伤中的保护作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 结语 |
| 本文创新之处 |
| 不足之处及后续工作思路 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文和参与科研情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）基于肝脏自然杀伤细胞与肝星状细胞的关系探讨扶正化瘀方联合恩替卡韦有效逆转乙肝肝硬化的免疫调节机制（论文提纲范文）
| 主要缩略语 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 肝脏自然杀伤细胞在乙肝肝硬化及肝癌组织中的表型变化特点 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 分组 |
| 2 观察指标 |
| 2.1 实验室检查 |
| 2.2 肝组织病理检查 |
| 2.3 肝内NK细胞亚型及激活型受体检测 |
| 3 材料 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要仪器设备 |
| 4 方法 |
| 4.1 组织样本的处理 |
| 4.2 肝组织病理染色 |
| 4.3 肝内NK细胞亚型及表面激活型受体检测 |
| 4.4 石蜡切片免疫组化双重染色 |
| 4.5 统计分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 基本资料 |
| 5.2 肝组织病理学观察 |
| 5.3 肝内NK细胞亚型及表面激活型受体的表达特点 |
| 5.4 肝内NK细胞数量、亚型与临床基本资料的相关性分析 |
| 5.5 肝内NK细胞表面激活型受体与临床基本资料的相关性分析 |
| 5.6 肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D的表达与纤维化面积相关性分析 |
| 5.7 肝组织免疫组化双重染色观察肝内NK细胞与活化肝星状细胞的关系 |
| 6 分析与讨论 |
| 第二部分 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝脏自然杀伤细胞的免疫调控作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验分组、造模及药物干预 |
| 2.2 样品的采集与处理 |
| 2.3 血清病毒学检测 |
| 2.4 血清肝功能检测 |
| 2.5 肝组织病理染色 |
| 2.6 肝组织羟脯氨酸含量测定 |
| 2.7 石蜡切片免疫组化染色 |
| 2.8 Western Blot蛋白免疫印迹杂交 |
| 2.9 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 2.10 肝组织免疫荧光 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠体重及脏器指数的影响 |
| 3.2 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠病毒学指标的影响 |
| 3.3 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清肝功能的影响 |
| 3.4 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织炎症病理的影响 |
| 3.5 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响 |
| 3.6 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织羟脯氨酸含量的影响 |
| 3.7 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织α-SMA及I型胶原表达的影响 |
| 3.8 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝内淋巴细胞分群的影响 |
| 3.9 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D表达的影响 |
| 3.10 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织RAE-1和Desmin表达的影响 |
| 3.11 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织RAE-1和α-SMA表达的影响 |
| 4 分析与讨论 |
| 第三部分 体内清除自然杀伤细胞对扶正化瘀方联合恩替卡韦抗乙肝背景小鼠肝纤维化药效的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验分组、造模及药物干预 |
| 2.2 样品的采集与处理 |
| 2.3 血清病毒学及肝功能生化检测 |
| 2.4 肝组织病理染色 |
| 2.5 肝组织羟脯氨酸含量测定 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠体重及脏器指数的影响 |
| 3.2 扶正化瘀方联合恩替卡韦对Anti-ASGM1清除乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞的拮抗作用 |
| 3.3 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清病毒学指标的影响 |
| 3.4 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清肝功能的影响 |
| 3.5 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织炎症病理的影响 |
| 3.6 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响 |
| 3.7 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织羟脯氨酸含量的影响 |
| 3.8 Anti-ASGM1清除乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞后肝内主要淋巴细胞亚群的变化及扶正化瘀方联合恩替卡韦的干预作用 |
| 4 分析与讨论 |
| 第四部分 扶正化瘀方体外调节自然杀伤细胞功能的抗肝纤维化作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞复苏、培养与冻存 |
| 2.2 药物配制 |
| 2.3 药物对细胞的毒性测定 |
| 2.4 Annexin V/7-AAD复染法检测细胞凋亡 |
| 2.5 荧光定量PCR检测mRNA表达 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 2.7 ELISA检测细胞因子分泌水平 |
| 2.8 NK92与CFSE-K562细胞共培养杀伤体系的建立及药物评价 |
| 2.9 药物预孵育的NK92与LX-2共培养 |
| 2.10 细胞免疫荧光检测 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 扶正化瘀方对NK92细胞株和LX-2细胞株的毒性测定 |
| 3.2 扶正化瘀方对NK92细胞株凋亡的影响 |
| 3.3 扶正化瘀方对NK92细胞表面激活型受体表达的影响 |
| 3.4 扶正化瘀方对NK92细胞分泌IFN-γ和Granzyme B水平的影响 |
| 3.5 扶正化瘀方对NK92细胞株杀伤K562功能的影响 |
| 3.6 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后NK92细胞表面激活型受体NKG2D的表达变化 |
| 3.7 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后LX-2细胞表面配体RAE-1的表达变化 |
| 3.8 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后LX-2细胞活化情况 |
| 4 分析与讨论 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 :文献综述 基于肝脏免疫微环境探讨中西医结合有效逆转乙肝肝纤维化的目标人群特征和作用机制 |
| 参考文献 |
| 附录2 :在校期间发表学术论文 |
| 在校期间发表的学术论文1(首页) |
| 在校期间发表的学术论文2(首页) |
| 在校期间发表的学术论文3(首页) |
| 在校期间发表的学术论文4(首页) |
| 在校期间发表的学术论文5(摘要) |
| 在校期间发表的学术论文6(Abstract) |
| 在校期间发表的学术论文7(Abstract) |
| 附录3 :参加学术会议及获奖情况 |
（9）春石斛‘红梦幻’类原球茎玻璃化超低温保存中损伤机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 超低温保存的基本理论 |
| 1.2 石斛属植物超低温保存研究进展 |
| 1.2.1 石斛属植物超低温保存所用外植体类型 |
| 1.2.2 石斛属植物超低温保存方法 |
| 1.2.3 石斛属植物超低温保存后存活状况 |
| 1.3 植物超低温保存中损伤程度的评价 |
| 1.4 超低温保存损伤机制的研究进展 |
| 1.4.1 生物材料在超低温保存中蛋白表达的变化 |
| 1.4.2 生物材料在超低温保存中基因表达的变化 |
| 1.4.3 超低温保存中的氧化应激研究 |
| 1.4.4 超低温保存中的细胞凋亡研究 |
| 1.5 蛋白质组学的研究技术及在超低温保存中的应用 |
| 1.6 本研究的目的意义、研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 本研究的目的意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 2 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中细胞存活力变化及其与结构改变的关系 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 数据处理与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 玻璃化超低温保存前后春石斛PLBs再生率的变化 |
| 2.2.2 春石斛PLBs相对存活率在玻璃化超低温保存程序中的变化 |
| 2.2.3 春石斛PLBs在玻璃化超低温保存中的细胞超微结构观察 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 玻璃化超低温保存程序的不同环节对PLBs存活力的降低作用 |
| 2.3.2 春石斛PLBs在玻璃化超低温保存程序中细胞结构的改变与其存活力的关系 |
| 2.4 小结 |
| 3 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中的蛋白质组学研究 |
| 3.1 材料及方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 数据处理与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序中所鉴定蛋白的基本信息统计 |
| 3.2.2 基于COG数据库对春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序中鉴定蛋白的功能分类 |
| 3.2.3 春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序的不同环节中差异蛋白的鉴定 |
| 3.2.4 春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序的不同环节中差异蛋白的Venn图分析 |
| 3.2.5 春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序的不同环节中差异蛋白的功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 蛋白质合成、加工和降解相关蛋白对玻璃化超低温保存的响应 |
| 3.3.2 能量代谢相关蛋白对玻璃化超低温保存的响应 |
| 3.3.3 应激与防御相关蛋白对玻璃化超低温保存的响应 |
| 3.3.4 膜与运输相关蛋白对玻璃化超低温保存的响应 |
| 3.4 小结 |
| 4 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中ROS介导的氧化应激研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 数据处理与分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 春石斛PLBs玻璃化法超低温保存程序中氧化应激指标的变化 |
| 4.2.2 外源AsA对春石斛PLBs玻璃化超低温保存后存活率的影响 |
| 4.2.3 外源AsA对玻璃化超低温保存中春石斛PLBs氧化应激指标的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序中氧化应激发生情况 |
| 4.3.2 外源AsA对春石斛PLBs玻璃化超低温保存中氧化应激的调控 |
| 4.4 小结 |
| 5 ROS代谢平衡相关差异蛋白在春石斛PLBs超低温保存中的作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.3 数据处理与分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 外源SOD对春石斛PLBs玻璃化超低温保存后存活率的影响 |
| 5.2.2 外源CAT对春石斛PLBs玻璃化超低温保存后存活率和再生率的影响 |
| 5.2.3 外源PDH对春石斛PLBs玻璃化超低温保存后存活率的影响 |
| 5.2.4 3种外源差异蛋白对春石斛PLBs玻璃化超低温保存中氧化应激指标的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 外源CAT作为冷冻保护剂在超低温保存中添加的最适宜环节和浓度 |
| 5.3.2 外源SOD和PDH作为冷冻保护剂在春石斛PLBs玻璃化超低温保存中添加的效果 |
| 5.3.3 外源SOD、CAT和PDH对春石斛PLBs玻璃化超低温保存中氧化应激的调控 |
| 5.4 小结 |
| 6 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中ROS代谢相关差异蛋白的基因表达研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.1.3 数据处理与分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中候选内参基因和目的基因的引物扩增效率 |
| 6.2.2 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中候选内参基因稳定性分析 |
| 6.2.3 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中ROS代谢相关差异蛋白的基因表达变化 |
| 6.2.4 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中ROS代谢相关差异蛋白的基因与蛋白表达的关系 |
| 6.2.5 外源AsA对春石斛PLBs玻璃化超低温保存中ROS代谢相关蛋白的基因表达的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中适宜内参基因的选择 |
| 6.3.2 春石斛PLBs玻璃化超低温保存中ROS代谢相关差异蛋白的基因表达调控 |
| 6.3.3 ROS代谢相关差异蛋白的基因表达与其蛋白表达的关系探讨 |
| 6.4 小结 |
| 7 结论 |
| 7.1 研究结论 |
| 7.2 研究创新点 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 图版 |
| 个人简介 |
| 获得成果目录清单 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（10）RAGE抗体对大鼠胆道梗阻性肝损伤的抑制作用及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1 急性肝损伤 |
| 1.1 肝细胞的增殖和凋亡 |
| 1.2 炎症反应 |
| 2 肝纤维化/肝硬化 |
| 2.1 肝纤维化/肝硬化的研究历史及现状 |
| 2.2 肝纤维化过程的生理变化 |
| 3 肝星状细胞 |
| 3.1 肝星状细胞在正常机体的基本作用 |
| 3.2 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 3.3 人肝星状细胞系LX-2 |
| 4 胆汁酸的合成 |
| 5 大鼠胆管结扎(BDL)动物模型 |
| 5.1 临床意义 |
| 5.2 胆管结扎的生理反应 |
| 5.3 胆管结扎的肝脏损伤机制 |
| 5.4 胆管结扎的综合病征 |
| 6 RAGE跨膜受体 |
| 6.1 RAGE蛋白结构 |
| 6.2 RAGE蛋白的配体及其生理功能 |
| 6.3 阻断RAGE通路与肝疾病的关系 |
| 7 G-CSF蛋白 |
| 8 胆道梗阻性肝损伤的治疗 |
| 8.1 熊去氧胆酸(Ursodeoxycholate,UDCA) |
| 8.2 蛋白药物 |
| 9 研究意义、内容及技术路线 |
| 9.1 研究意义 |
| 9.2 研究内容 |
| 9.3 技术路线 |
| 第二章 重组小鼠G-CSF蛋白的表达纯化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与试剂 |
| 2.1 仪器与设备 |
| 2.2 材料和试剂 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 3 方法及步骤 |
| 3.1 重组小鼠G-CSF蛋白的表达质粒构建 |
| 3.2 重组小鼠G-CSF蛋白的原核表达 |
| 3.3 目的蛋白的纯化与鉴定 |
| 3.4 目的蛋白纯度和分子量测定 |
| 3.5 目的蛋白生物活性鉴定 |
| 3.6 重组小鼠G-CSF蛋白对肝纤维化的作用 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 重组小鼠G-CSF蛋白的表达质粒构建 |
| 4.2 重组小鼠G-CSF蛋白的表达 |
| 4.3 重组小鼠G-CSF蛋白的纯化与鉴定 |
| 4.4 重组小鼠G-CSF蛋白的体内活力测定 |
| 4.5 重组小鼠G-CSF蛋白对小鼠肝损伤/纤维化的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第三章 重组大鼠SRAGE蛋白表达与纯化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与试剂 |
| 2.1 仪器与设备 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.3 主要试剂配制 |
| 3 方法与步骤 |
| 3.1 重组大鼠s RAGE蛋白酵母表达与纯化 |
| 3.2 终产物检测 |
| 3.3 体外活力测定(SH-SY5Y细胞系) |
| 3.4 体内测活(CCl_4诱导大鼠肝纤维化模型) |
| 3.5 数据分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 构建pPICZαA–rrsRAGE酵母表达质粒 |
| 4.2 构建和筛选pPICZαA–rrsRAGE-X-33酵母高表达菌株 |
| 4.3 发酵表达重组大鼠sRAGE蛋白 |
| 4.4 蛋白纯化 |
| 4.5 体外蛋白活性检测 |
| 4.6 重组大鼠sRAGE蛋白体内活性测定 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第四章 兔抗大鼠RAGE抗体对胆道梗阻性肝损伤的药效学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与试剂 |
| 2.1 仪器与设备 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.3 主要试剂配制 |
| 3 方法及步骤 |
| 3.1 RAGE抗体(Rabbit anti-rrsRAGE)制备 |
| 3.2 兔IgG(RAGE抗体阴性对照)纯化 |
| 3.3 RAGE抗体抗原亲和纯化 |
| 3.4 RAGE抗体对胆道梗阻性肝损伤的药效学实验 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 抗原亲和纯化兔抗大鼠sRAGE多克隆抗体(RAGE抗体) |
| 4.2 RAGE抗体对大鼠BDL模型14d生长率的影响 |
| 4.3 RAGE抗体对大鼠BDL模型14d生存率的影响 |
| 4.4 RAGE抗体对肝损伤/纤维化的影响 |
| 4.5 RAGE抗体对肝功能/纤维化血清学指标的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第五章 RAGE抗体在胆道梗阻性肝损伤中的药理研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器与设备 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 3 方法与步骤 |
| 3.1 免疫组化 |
| 3.2 肝星状细胞LX-2的复活和冻存 |
| 3.3 RAGE抗体对LX-2细胞活力的影响 |
| 3.4 RAGE抗体对LX-2细胞Col1α1和MMP-9转录水平的影响 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 RAGE抗体能有效抑制肝细胞损伤 |
| 4.2 RAGE抗体能有效地抑制IL-1β的表达 |
| 4.3 RAGE抗体调节MMPs/TIMP的表达 |
| 4.4 RAGE抗体抑制了Cyp7α1的转录水平 |
| 4.5 RAGE抗体有效地调节了肝星状细胞的活力 |
| 4.6 RAGE抗体通过肝星状细胞减轻肝纤维化 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第六章 结论和展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 pET-30a(+)质粒图谱 |
| 附录二 pPICZα-A质粒图谱 |
| 附录三 小鼠G-CSF碱基序列和氨基酸序列 |
| 附录四 小鼠G-CSF三级结构预测 |
| 附录五 大鼠RAGE碱基序列和氨基酸序列 |
| 附录六 大鼠与人和小鼠RAGE蛋白氨基酸对比 |
| 附录七 大鼠SRAGE蛋白三级结构预测 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、分离人肝细胞的超低温保存（论文参考文献）
- [1]三叶苷对急性肝损伤的保护作用及促肝细胞增殖作用的实验研究[D]. 李曦. 遵义医科大学, 2021
- [2]LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究[D]. 王永娟. 河北医科大学, 2021
- [3]柴胡水提物的谱-效-毒关系及体外生物转化研究[D]. 侯磊. 山东中医药大学, 2020(01)
- [4]基于3D HepaRG细胞模型的化学性肝损伤的评价[D]. 张弛. 军事科学院, 2020
- [5]PSAT1促进肝硬化门静脉高压症的机制研究[D]. 林佳昀. 上海交通大学, 2020
- [6]胆汁淤积症肠道微生态学的临床与基础研究[D]. 郭城. 河北医科大学, 2020(01)
- [7]八氢姜黄素立体异构体对药物代谢酶和肝损伤的作用研究[D]. 罗丹丹. 广州中医药大学, 2020(06)
- [8]基于肝脏自然杀伤细胞与肝星状细胞的关系探讨扶正化瘀方联合恩替卡韦有效逆转乙肝肝硬化的免疫调节机制[D]. 孙鑫. 上海中医药大学, 2019(02)
- [9]春石斛‘红梦幻’类原球茎玻璃化超低温保存中损伤机制的研究[D]. 狄玮. 北京林业大学, 2018
- [10]RAGE抗体对大鼠胆道梗阻性肝损伤的抑制作用及其机理研究[D]. 夏鹏. 上海交通大学, 2016(01)