一、干细胞移植治疗心肌梗死的最新进展（论文文献综述）
王擎擎[1]（2021）在《活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究》文中进行了进一步梳理背景:当代以干细胞技术为核心的再生医学的迅速发展,为心肌梗死的治疗带来新的希望,其中干细胞移植治疗心梗,有望修复坏死的心肌组织,改善受损的心功能,但是梗死区缺血、缺氧局部微环境使MSCs移植后存活率降低,极大地限制了 MSCs用于治疗MI的疗效。中药促进MSCs移植后存活的研究目前也显示出了很好的疗效,可以调控MSCs的归巢、定植,提高MSCs移植后存活率。导师姚魁武教授基于中医胸痹心痛“阳微阴弦”的基本病机,常用活血温通法治疗冠心病,临床疗效显着,并根据多年临床经验拟定了具有活血温通效果的经验方—活血温通方。我们前期研究也发现活血温通方可以显着改善心肌缺血模型组大鼠心功能,明显缩小心肌梗死面积,而且能够降低炎症反应、抑制心肌细胞凋亡、减少胶原纤维面积以及促进血管新生,同时发现活血温通方减轻心肌缺血损伤可能与Sirt1信号通路激活有关。而活血温通方联合MSCs移植治疗心梗,还没有相关的报道。目的:1.总结导师姚魁武教授活血温通法治疗冠心病阳虚证的用药规律、治疗思路,并进行系统的经验总结。2探索活血温通方对BMSCs移植治疗心梗疗效的影响以及可能的作用机制。方法:1.收集2016年1月—2020年12月就诊于中国中医科学院广安门医院姚魁武主任医师门诊,应用中药汤剂治疗且符合纳排标准的全部初诊原始病案。通过“中医传承计算平台（V3.0）”软件系统进行数据分析,根据分析得到到药物频次、常用药物组合、潜在处方等,分析探讨姚魁武教授活血温通法治疗冠心病的用药规律、诊疗思路,并做系统总结。2.提取大鼠BMSCs,培养至第三代时,用流氏细胞仪进行细胞鉴定。用活细胞染色剂CM-Dil进行荧光标记,以检测移植后细胞的存活情况。3.通过结扎左冠状动脉前降支制备心机梗死模型。SD大鼠随机分为5组：假手术组（Sham组）：冠状动脉只穿线不结扎，术后灌胃纯水，持续28天；心梗组（MI组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的PBS。术后灌胃纯水,持续28天;BMSCs移植组（BMSCs组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的MSCs单细胞悬液（细胞浓度3x106个/100μL）。术后灌胃纯水,连续28天;活血温通方组（HXWTF组）:造模方法同心梗组。术后灌胃活血温通方,连续28天;活血温通方+BMSCs移植组（BMSCs+HXWTF组）:造模方法同BMSCs移植组。术后灌胃活血温通方,连续28天。4.超声心动图检测大鼠心功能、TTC染色用于观察心肌梗死面积大小、HE染色观察心梗大鼠心肌组织形态的改变、荧光显微镜观察BMSCs移植后的存活情况。5.用WST-1法测定大鼠血清SOD活力和TBA法测定大鼠血清MDA水平,以评价各组氧化损伤程度;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡;采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中炎性因子TNF-a、IL-6、IL-10与生长因子VEGF、bFGF水平,评价炎症反应程度;天狼猩红染色检测各组大鼠心肌纤维化程度;免疫组织化学染色检测梗死边缘区α-SMA和CD31的表达情况,以评价血管新生情况;Western blotting检测心肌组织Sirt1、NF-κB、FoxO1和p53的蛋白的表达水平。结果:1.从用药频次分析,196张处方中,共137味中药,用药频次≥20的中药有39味,用药频次≥50的有22味,用药频次≥50按频次由高到低依次为丹参（193）,桂枝（164）,砂仁（123）,川芎（117）,瓜蒌（109）,白芍（105）,炙甘草（95）,鸡血藤（93）,茯苓（88）,柴胡（87）,炒枳壳（80）,当归（78）,干姜（77）,炒白术（76）,杜仲（64）,党参（61）,麦冬（59）,肉苁蓉（58）,炒酸枣仁（56）,薤白（54）,葛根（54）,五味子（50）。2.196张处方中的137味中药按功效共分为16类,根据药物功效使用频次由高到低排列前10位的依次为补虚类（769）,活血化瘀类（436）,温里类（339）,清热类（210）,化湿类（198）,解表类（184）,理气类（177）,化痰类（155）,利水渗湿类（119）,安神类（114）。3.从药物组合频次分析,药物组合频次≥90的由高到低依次是丹参-桂枝（162）,丹参-砂仁（123）,丹参-川芎（115）,丹参-瓜蒌（108）,丹参-白芍（104）,丹参-桂枝-砂仁（99）;桂枝-砂仁（99）。基于关联规则深入分析用药组合,导师活血温通法治疗冠心病常用的2味药的组合是丹参-瓜蒌,丹参-砂仁,丹参-桂枝,丹参-鸡血藤等;3味药的组合是丹参-砂仁-瓜蒌,丹参-桂枝-瓜蒌,丹参-桂枝-鸡血藤等。从用药关联规则网络拓扑图可以看出,关联性比较大的药物组合是丹参、桂枝、鸡血藤、瓜蒌、川芎、砂仁。4.基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心组合。3种药物聚类核心组合为丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,鸡血藤;丹参,桂枝,川芎,白芍,砂仁;丹参,桂枝,川芎,砂仁,茯苓。4种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,鸡血藤;丹参,桂枝,麦冬,炙甘草,川芎,生地黄;丹参,桂枝,砂仁,鸡血藤,川芎,降香;丹参,桂枝,砂仁,干姜,茯苓,瓜蒌。5种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,鸡血藤,瓜蒌,川芎,党参;桂枝,丹参,麦冬,川芎,炙甘草,炒白术;丹参,桂枝,干姜,砂仁,茯苓,黄连;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,白芍;丹参,砂仁,桂枝,川芎,鸡血藤,降香。5.基于方剂频数分析,可以得出196例病案中共涉及方剂54个,方剂频数为2以上的药物有32个,方剂频数为5以上的方剂有24个,方剂频数为10以上的方剂有13个,方剂频数为20以上的药物有6个。可以看出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂有丹参饮（118）,四逆散（73）,桂枝甘草龙骨牡蛎汤（25）苓桂术甘汤（23）、瓜蒌薤白白酒汤（21）等。6.根据方剂配伍的使用频次,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散（47）,丹参饮-黄芪赤风汤（11）,丹参饮-交泰丸（11）,丹参饮-瓜蒌薤白白酒汤（11）,丹参饮-半夏泻心汤（11）,丹参饮-瓜蒌薤白半夏汤（11）等。基于关联规则深入分析用方组合,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散-瓜蒌薤白半夏汤,丹参饮-四逆散-黄芪赤风汤,丹参饮-四逆散-桂枝甘草龙骨牡蛎汤等。根据方剂组合规律关联规则网络拓扑图可以看出关联比较大的方剂是丹参饮、四逆散、生脉散、桂枝甘草龙骨牡蛎汤、瓜蒌薤白半夏汤、瓜蒌薤白白酒汤、交泰丸等。基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心方剂组合是生脉散,丹参饮,枳实薤白桂枝汤,补中益气汤,四君子汤;丹参饮,交泰丸,半夏泻心汤,苓桂术甘汤,越鞠丸;丹参饮,四逆散,黄芪赤风汤,瓜蒌薤白半夏汤,桂枝甘草龙骨牡蛎汤。7.BMSCs的鉴定:用流氏细胞仪检测第3代BMSCs表面标记物CD44、CD90、CD45的表达情况,结果显示CD44表达率为99.2%,CD90表达率为97.4%,CD45的表达率为6.7%。8.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心功能的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组EF均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合 BMSCs 移植组 EF比BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组FS均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合BMSCs移植组FS 比 BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,***P<0.001）。9.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌梗死面积的影响:假手术组无梗死,完整心脏表面和心脏切片均呈现红色,无苍白色区域。心梗组完整心脏表面和心脏切片苍白色区域均最大,故心梗面积最大,且心梗处明显凹陷,心梗处心肌明显变薄。BMSCs移植组和活血温通方组较心梗组,完整心脏表面和心脏切片的苍白色区域均明显减少,说明BMSCs移植和活血温通方药物干预均能减少心梗面积。活血温通方联合BMSCs移植组心脏苍白色区域最小,心梗处轻微凹陷,说明活血温通方能提高BMSCs移植改善心梗大鼠心肌梗死面积的疗效。10.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌组织形态的影响:HE染色显示与假手术组相比,其余各组梗死区均有不同程度的炎性细胞浸润。心梗组细胞排列紊乱,细胞间隙增大,炎性细胞浸润最严重。BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组这些病变均有明显改善,炎性细胞浸润有不同程度的降低。与BMSCs移植组、活血温通方组相比较,活血温通方联合BMSCs移植组细胞排列更有序,炎性细胞浸润更少。11.活血温通方对BMSCs移植四周后存活的影响:在全景数字扫描显微镜下观察,可以看到活血温通方联合BMSCs移植组红色荧光分布更广。红色荧光与蓝色荧光重叠的数量明显更多。12.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清SOD、MDA的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（***P<0.001,**P<0.01）;与心梗组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组MDA水平均有显着降低（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs 移植组 MDA 均有显着降低（***P<0.001,**P<0.01）。13.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌细胞凋亡的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平均有显着降低（***P<0.001,***P<0.001）。14.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10的影响:与假手术组相比,MI组TNF-α、IL-6和IL-10水平水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合 BMSCs 移植组 TNF-α 显着降低（**P<0.01,**P<0.01,***P<0.001）,IL-6 显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）,IL-10 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组TNF-α显着降低（**P<0.01,**P<0.01）,IL-6显着降低（***P<0.001,**P<0.01）,IL-10显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。15.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌纤维化的影响:与假手术组相比,MI组心肌纤维化明显（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（*P<0.05,**P<0.01）。16.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠梗死边缘区α-SMA、CD31表达的影响:与假手术组相比,MI组α-SMA、CD31的表达明显增多（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs 移植组 α-SMA、CD31 的表达均显着增多（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组 α-SMA、CD31 的表达显着增多（**P<0.01,*P<0.05;*P<0.05,***P<0.001）。17.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清生长因子VEGF、bFGF的影响:与假手术组相比,MI组VEGF、bFGF水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。18.活血温通方联合BMSCs移植对心肌组织SIRT1、NF-kB、FoxO1和p53蛋白表达的影响:与假手术组相比,MI组Sirt1的表达明显降低（***P<0.001）,NF-kB、Foxo1、p53 的表达明显升高（**P<0.01,**P<0.01,**P<0.01）。与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,NF-κB的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）,FoxO1 的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05,*P<0.05）,p53 的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达均显着升高（**P<0.01,*P<0.05）,NF-kB的表达显着降低（**P<0.01,*P<0.05）,FoxO1的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）,p53的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）。结论:1.导师活血温通法治疗冠心病常活血药与温阳药并重,且用药平和,配伍主次分明,以经方为主。在活血温通法治疗冠心病的组方用药中常含有活血温通方,治疗效果短期的显着,可能是因为改善了心肌缺血缺氧微环境,也初步说明了活血温通方的临床疗效比较显着。2.活血温通方可能是通过改善心梗后缺血缺氧微环境而提高了 BMSCs移植后的存活率,而进一步提高BMSCs移植治疗心梗在抗细胞氧化损伤、抗细胞凋亡、降低炎症反应、抗心肌纤维化和促进血管新生方面的疗效,以及促进移植后的BMSCs的旁分泌功能而进一步修复受损的心肌,缩小心肌梗死面积,改善心功能。3.活血温通方能促进BMSCs移植后Sirt1信号通路的激活,以协同恢复心功能。
冀楠[2]（2021）在《益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究》文中指出背景:急性心肌梗死（Acute Myocardial infarction,AMI）发生后,左心室大小、结构、功能改变,造成心室重构。心室重构（Ventricμlar remodeling,VR）是AMI向心力衰竭发展的主要病程。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）可通过旁分泌、归巢、转化等方式缓解AMI后心肌损伤,改善心室重构。但由于AMI后内环境改变,造成BMSCs迁移效率低下。团队前期研究发现,益气活血方可改善AMI后炎性环境,改善AMI大鼠心肌损伤。但益气活血方是否可以促进BMSCs向AMI大鼠梗死部位迁移,发挥更好的心肌保护作用,值得深入研究。目的:探讨益气活血方联合骨髓间充质干细胞对心肌梗死后心室重构的干预作用,以mi RNA-210/BNIP3为切入点,从自噬-凋亡途径研究益气活血方联合干细胞对心室重构的可能的作用机制。方法:1、从SD大鼠骨髓中提取BMSCs,显微镜下观察细胞形态,流式检测细胞表面标志物。采用LAD结扎的方法建立大鼠心肌梗死模型,分为假手术组、模型组、益气活血方组、骨髓间充质干细胞组、益气活血方联合骨髓间充质干细胞组。造模2小时,心电图检测心肌缺血情况。药物干预4周后,心脏超声评价大鼠心脏结构和功能,TTC染色评价大鼠心肌梗死面积,HE染色观察大鼠心肌炎性细胞浸润情况、Masson染色观察心肌纤维组织病理改变。2、使用CM-DIL染料对BMSCs细胞膜标记染色。造模后隔天尾静脉移植入大鼠体内。干预4周后取材,运用免疫荧光检测BMSCs向梗死部位富集情况,免疫组化检测心肌组织中SDF-1/CXCR4蛋白的表达水平。3、TUNEL检测大鼠心肌细胞凋亡情况。Western Blot检测造模后各组大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62表达情况,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况,目的蛋白BNIP3表达情况。RT-q PCR检测mi R-210、BNIP3 mRNA表达情况。结果:1、与假手术组相比,模型组大鼠的LVESD、LVEDD增加（P<0.01）,LVEF、LVFS降低（P<0.01）,提示模型组大鼠左室扩大,心功能下降,心脏结构改变;与模型组相比,益气活血方组、益气活血方联合骨髓间充质干细胞组的LVEDD、LVESD减小（P<0.05or P<0.01）,LVEF、LVFS升高（P<0.05 or P<0.01）,提示此两组可减轻心肌梗死所致的大鼠心脏损伤,减轻大鼠心脏结构改变;与模型组比较,骨髓间充质干细胞组的LVESD减小（P<0.01）,LVFS、LVEF升高,LVEDD减小,但差异无统计学意义（P>0.05）。与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组与骨髓间充质干细胞组LVESD、LVEDD增加（P<0.05 or P<0.01）,LVEF、LVFS降低（P<0.05 or P<0.01）。提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组对梗死心肌的保护作用最为显着。TTC染色结果显示:与假手术组相比,模型组梗死面积显着增加（P<0.01）。与模型组相比,各给药组梗死面积减少（P<0.05 or P<0.01）。与益气活血联合骨髓间充质干细胞组相比,其余两给药组梗死面积增大（P<0.05 or P<0.01）。HE染色结果显示:假手术组大鼠心肌细胞形态正常,细胞核结构清晰,居于中央,肌丝着色均匀,排列整齐规则,呈正常心肌细胞形态;与假手术组比较,模型组大鼠病变程度严重,心肌细胞形态不规则,排列紊乱,细胞核深染,炎性细胞浸润增多;与模型组比较,各给药组大鼠梗死范围缩小,心肌结构改变减轻,肌丝排列较规则,炎性细胞浸润和水肿减少。Masson染色结果显示:假手术组心肌细胞排列整齐,极少纤维组织沉积;模型组病变最为严重,染色显示在心肌梗死边缘区心肌细胞肥大,纤维组织沉积严重,排列紊乱,可见大面积蓝色纤维化;与模型组比较,各给药组显示胶原纤维沉积减少,心肌排列整齐。2、AMI大鼠造模后隔天经尾静脉移植BMSCs,荧光显微镜下观察其迁移情况,可见心肌组织中橙红色荧光,BMSCs向心肌梗死部位富集。免疫组化结果显示:与骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方联合骨髓间充质干细胞组SDF-1蛋白表达增加（P<0.05）,CXCR4表达无统计学差异。3、TUNEL染色显示假手术组未见明显阳性细胞核染色,阳性细胞核染色多见于模型组。与模型组相比,给药组阳性细胞核染色数量明显减少。凋亡相关蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌Bax蛋白表达上调（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达下调（P<0.01）,Caspase-3表达上调（P<0.01）,提示凋亡激活;与模型组比较,各给药组可下调Bax蛋白表达（P<0.01）,益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可下调Caspase-3蛋白表达（P<0.01）,上调Bcl-2蛋白表达（P<0.05）,骨髓间充质干细胞组Bcl-2蛋白表达有上调趋势,Caspase-3蛋白表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组Bax、Caspase-3蛋白表达上调,（P<0.01 or P<0.05）,Bcl-2表达下调（P>0.05）,提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组抑制凋亡效应最显着。自噬相关蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌P62蛋白表达上调（P<0.05）,LC3B、Beclin-1蛋白表达下调,（P<0.01 or P<0.05）提示自噬激活;与模型组比较,各给药组可下调P62蛋白表达（P<0.01）,上调Beclin-1蛋白表达（P<0.01）,益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可上调LC3B蛋白表达（P<0.01 or P<0.05）,骨髓间充质干细胞组LC3B蛋白表达有上调趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组P62蛋白表达上调（P<0.01 or P<0.05）,LC3B、Beclin-1表达下调（P<0.01 or P<0.05）,提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组诱导自噬效应最显着。BNIP3蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌BNIP3蛋白表达上调（P<0.01）;与模型组比较,各给药组可下调BNIP3蛋白表达（P<0.01 or P<0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组BNIP3蛋白表达上调（P<0.01）。mi R-210与BNIP3 Mrna PCR检测结果显示,与假手术组比较:模型组大鼠心肌mi R-210表达下调（P<0.01）,BNIP3 mRNA表达水平上调（P<0.01）;与模型组比较:益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可上调mi R-210表达（P<0.01 or P<0.05）,骨髓间充质干细胞组mi R-210表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）,各给药组可下调BNIP3 mRNA表达情况（P<0.01）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比:益气活血方组和骨髓间充质干细胞组mi R-210表达下降,（P<0.01）,骨髓间充质干细胞组BNIP3 mRNA表达水平上升（P>0.01）,益气活血方组BNIP3 mRNA有上升趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。提示益气活血方可能通过mi R-210/BNIP3通路发挥作用,且益气活血方联合骨髓间充质干细胞效用最为显着。结论:1、益气活血方联合骨髓间充质干细胞能够提高心梗后射血分数,改善大鼠的心脏结构,减轻心脏损伤。2、益气活血方通过干预SDF-1/CXCR4轴增加BMSCs向梗死区富集效率。3、益气活血方联合骨髓间充质干细胞可能通过调控mi RNA-210/BNIP3轴,影响心肌细胞自噬-凋亡,发挥抑制VR机制。
李记泉[3]（2020）在《针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究》文中提出目的:本文以急性心肌缺血（Acute Myocardial Ischemia,AMI）大鼠为研究对象,以针刺联合骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）静脉移植为干预手段,旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。材料与方法:1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记:健康雄性SD大鼠3只（SPF级,4周龄,体重150-160g）,采用7%水合氯醛（5 m L/kg）腹腔注射麻醉,浸泡于75%酒精消毒5min,无菌条件下取胫骨、股骨,PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液,离心后接种于培养瓶,放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养,及时更换培养基,待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:2传代培养,显微镜观察细胞形态变化,取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记（CD29、CD73、CD90、CD44、CD45）,并取第三代细胞Brd U标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。2.AMI大鼠模型的制备:60只健康雄性SD大鼠,腹腔注射7%水合氯醛（5 m L/kg）麻醉,通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型,将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组,每组10只;同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎,随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠:造模结束后1小时,干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs（2×106个/ml）,同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴,刺入皮下深度2-3mm,疏密波,频率2Hz,强度2m A左右,以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度,留针30min,24h治疗一次,共治疗10次;其他各组不针刺,但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声,随即处死各组大鼠,取腹主动脉全血,分离出血清备用;同时快速取出心脏,生理盐水冲洗干净,每组随机挑选1个心脏样本,在缺血区域切薄片5片,用于大鼠心肌缺血面积的测定,其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。（1）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化,分析BM-MSCs的鉴定和标记结果,采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析,采用氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。（2）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量;酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。结果:1.与假手术组比较,模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异（P>0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）。2.假手术组大鼠未见心肌缺血;与假手术组比较,模型组大鼠心肌缺血面积明显升高（P<0.01）,缺血区面积占左心室总面积的18.39%;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组（P<0.01）。3.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01或P<0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）。4.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）。5.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低（P<0.01）;针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组（P<0.01）。6.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）。7.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）。结论:1.针刺联合BM-MSCs移植能够显着改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化,降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积,提高AMI大鼠心脏功能,为临床治疗本病提供了新思路。2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达,降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平,以及上调抑炎因子IL-10水平,减轻AMI后过度表达的炎症反应,从而减轻心肌细胞坏死;通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达,从而减少AMI后心肌细胞凋亡;通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达,诱导内皮细胞形成,从而改善心肌供血。
倪达[4]（2020）在《外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究》文中进行了进一步梳理背景:近年来,外泌体在心肌保护的研究中逐渐受到越来越多的关注。心血管系统是外泌体进行细胞间信号传递的重要场所之一,外泌体介导的心肌细胞间信号传递广泛涉及心血管系统疾病的生理及病理过程。在心肌缺血后,不同细胞来源的外泌体介导的信号传递和组织修复可能发挥着重要作用,其含有的大量与其结构和功能密切相关的物质可通过自分泌或旁分泌的方式作用于自身或远隔的靶细胞,修复受损心肌,对心肌梗死以及心肌缺血再灌注损伤引发的心肌细胞凋亡具有一定保护作用,可能减少梗死面积、增加新生血管数量,从而改善心脏功能。但外泌体如何发挥心肌保护作用的具体机制仍有待进一步研究。本课题研究拟从两部分内容进行阐述:首先从探讨多种来源外泌体在体外循环围手术期的水平变化的角度阐述外泌体与心肌保护之间的关联与作用,然后选取来源广泛且具有多向分化功能的骨髓间充质干细胞来源外泌体,拟从细胞和整体动物两个层面,通过一系列实验,深入研究外泌体介导心肌损伤保护作用的具体机制。第一部分研究多种来源外泌体在体外循环围手术期的表达变化情况目的:探究外周血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和血小板等多种来源的外泌体在体外循环围手术期的变化情况。方法:选择2017年1月-2017年12月行体外循环下先天性心脏畸形矫治术患儿60例,于体外循环前、再灌注1h、6h、12h、24h、48h、72h分别采集桡动脉血,采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测患儿血浆中c Tn T的浓度水平,并提取桡动脉血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和血小板,分别采用超速离心法分离内皮细胞、树突状细胞和巨噬细胞来源的外泌体,采用离心法分离血小板来源的外泌体。结果:体外循环再灌注1h、6h、12h、24h、48h c Tn T浓度[（1.352±0.233、1.653±0.231、1.263±0.224、0.623±0.145、0.231±0.025）μg/l]均明显高于体外循环前[（0.013±0.001）μg/l]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h内皮细胞来源外泌体含量[（167.55±26.67、210.57±31.12、189.56±26.32、142.28±4.27、91.02±3.16）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（76.78±13.14）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h树突状细胞来源外泌体含量[（87.51±6.28、92.12±5.37、83.14±4.29、68.37±3.28、50.49±3.94）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（34.27±4.52）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h巨噬细胞来源外泌体含量[（92.16±2.73、101.26±3.47、88.19±3.20、65.45±2.76、43.28±1.97）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（28.78±2.64）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注1h、6h、12h、24h、48h血小板来源外泌体含量[（134.27±4.28、141.28±3.06、135.84±3.29、105.61±2.58、65.24±3.10）×106微粒/ml]均明显高于体外循环前[（41.51±2.02）×106微粒/ml]（P<0.05）,再灌注72h各指标和体外循环前比较无统计学意义（P>0.05）。结论:外周血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、血小板来源的外泌体浓度水平在体外循环围手术期明显增高,且与代表心肌损伤的c Tn T浓度变化一致,证明外泌体具有心肌保护作用。第二部分研究骨髓间充质干细胞来源外泌体调控自噬发挥心肌保护作用机制目的:探讨骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死的影响是否与自噬有关,以及外泌体在其中发挥的作用。方法:1.建立小鼠心肌梗死模型,将骨髓间充质干细胞注入梗死周围心肌（4处20μl,共2×105个细胞）,分别于术后1、3、7、14、28天检测心功能的变化;术后28天取心脏标本,经Masson染色后,比较梗死面积的差异;TUNNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况。2.在心肌梗死后1天采集心肌细胞,比较各组心肌组织自噬水平的变化。3.将骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养,在缺氧培养箱中模拟心肌梗死情况,检测心肌细胞自噬水平,并观察使用自噬抑制剂3-MA后的变化情况。4.提取骨髓间充质干细胞来源的外泌体,在缺氧条件下与心肌细胞共培养,检测心肌细胞自噬水平。结果:1.骨髓间充质干细胞移植组术后28天时心功能较心肌梗死组明显改善;骨髓间充质干细胞移植组小鼠心肌梗死面积较心肌梗死组明显减少;骨髓间充质干细胞移植组心肌细胞凋亡率低于心肌梗死组。2.骨髓间充质干细胞移植组LC3-I、LC3-II、p53和BNIP3的表达明显降低。3.缺氧组p53和BNIP3水平升高,骨髓间充质干细胞共培养组p53和BNIP水平降低,使用自噬抑制剂后,心肌细胞死亡率下降。4.骨髓间充质干细胞来源外泌体共培养组LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p53和BNIP3在蛋白和m RNA水平上均明显低于缺氧组。结论:骨髓间充质干细胞分泌的外泌体可通过P53/BNIP3信号通路下调心肌细胞自噬水平,减少心肌细胞自噬死亡,从而改善心功能,减少心肌重塑,发挥心肌保护作用。
徐珺[5]（2020）在《间充质干细胞和重编程因子的内外源性心肌修复的实验研究》文中指出他汀联合骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的方案优化及相关机制研究目的:急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction,AMI）已成为心血管疾病致死以及致残的主要原因。过去的十几年中细胞移植用于AMI的治疗受到了广泛的关注。其中,间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）由于其取材方便并具有免疫调节的属性而成为干细胞治疗的优选种子,然而,在实际应用中由于其低存活率和归巢率而受到阻碍。本课题组前期的实验结果表明,急性心肌梗死后7天,口服强化阿托伐他汀（Atorvastatin,ATV）联合经他汀预处理的MSCs的单次移植同时促进了 MSCs的归巢和存活。本研究首先旨在研究强化他汀对归巢因子基质细胞衍生因子-1（SDF-1）和炎症因子在整个AMI期间的表达的动态变化,以探索MSCs的最佳移植时间窗。此外,本研究还将探索强化他汀联合在AMI不同时期不同次数移植他汀预处理的MSCs是否具有不同的疗效,从而更好地确定AMI中MSCs移植的最佳策略。方法:为了确定MSCs移植的最佳时间窗,我们首先评估了强化他汀对心梗后梗死周边区的SDF-1分泌水平和炎症因子的表达水平的动态影响。本部分实验将150只S/D大鼠随机分为假手术组（Sham组）、AMI对照组（AMI组）和ATV处理组（ATV组）。分别在心梗后1天、一周、两周、三周、四周五个时间点检测各组梗死周边区的SDF-1水平和肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）的动态变化。基于以上结果,将整个心梗时期分为早、中、晚期,将215只SD大鼠随机分为11组,除了 Sham组和AMI组外,另外九个实验组分别为心梗早期一次、两次、三次移植组（Early1,Early2,Early3）、中期一次、两次、三次移植组（Mid1,Mid2,Mid3）和晚期一次、两次、三次移植组（Late1、Late2、Late3）,以比较心梗不同时间不同移植次数对于MSCs的归巢和存活、心功能、梗死面积以及血管新生和分化的影响。急性心梗模型是通过左前降支结扎完成的。口服强化他汀由每日灌胃完成,剂量为10毫克/千克/天。他汀预处理的MSCs通过尾静脉注射。结果:与AMI对照组相比,口服强化他汀在AMI后4周内的各个时间点均能显着增强梗死周边区的SDF-1表达,约为1.5～2.6倍,同时有明显的抑制炎症效应。而口服强化他汀联合不同时期不同次数移植他汀预处理的MSCs进一步提高了 MSCs的归巢率,不同移植方案对归巢率有3.9%～24.0%不等的提高,左心室射血分数（LVEF）也提高了 2.0%～16.2%。其中,中期移植组的疗效最为显着,晚期移植仍然有效。对于作用机制的研究,不同联合治疗方案能不同程度地抑制梗死周边区的炎症和凋亡,同时促进血管新生。此外,在心梗的早期和中期三次移植的较单次移植更为有效,表现为累积作用效应,其中中期三次移植组的效果最好。结论:因此,基于研究结果,我们可以发现强化他汀联合他汀预处理的MSCs移植治疗的最佳方案是口服强化他汀联合AMI中期多次移植他汀预处理的干细胞。本研究结果的临床转化潜力巨大,为急性心梗的干细胞治疗方案进一步提供了理论基础。基于CRISPR-dCas9技术内源性激活成纤维细胞的重编程因子表达以促进心肌直接重编程目的:在过去的几十年中,急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）和AMI后的心力衰竭已成为全球致死致残的主要原因。研究显示,在AMI发生后的几个小时内近25%的心肌细胞可能发生凋亡或者坏死。因此,除了目前较为成熟的再血管化治疗外,探索急性心肌梗死后心肌修复和再生的新疗法,直接修复受损心肌,恢复心功能具有更为重要意义。近年来被广泛研究的直接重编程技术,是指将一种类型的成熟体细胞直接转化为另一种类型的成熟体细胞,而中间不经过向多能干细胞或祖细胞转化的阶段。目前较为成熟的心脏直接重编程技术,是依赖于逆转录病毒载体外源性地过表达心脏重编程因子,如Mef2c、Gata4和Tbx5等,从而将心肌成纤维细胞直接重编程为诱导的心肌细胞（induced cardiomyocytes,iCMs）。但是,目前尚不清楚是否可以通过对重编程因子的内源性激活从而实现心肌直接重编程。方法:在本研究中,我们首先针对心脏重编程因子Gata4（G）和Tbx5（T）的转录起始位点（TSS）附近的区域,以及Mef2c（M）的转录起始位点（TSS）和较远端的三个特异性增强子区域分别设计了各自的候选sgRNA,从而直接靶向M/G/T的内源性转录区域。然后,我们利用第二代CRISPR-dCas9 SAM激活系统,联合sgRNA,来筛选出能有效并精确地激活重编程因子M/G/T的内源表达水平的sgRNA和sgRNA组合。最后运用上述sgRNA和sgRNA组合在小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts,MEFs）和新鲜的心肌成纤维细胞（fresh Cardiac Fibroblasts,fCFs）里检测其重编程效率。结果:首先,sgRNA筛选结果表明,靶向Gata4和Tbx5启动子对应序列的sgRNA足以激活内源性Gata4和Tbx5表达,但不能有效激活Mef2c的内源性表达。故而进一步扩展对Mef2c的三个特异性增强子序列的sgRNA进行设计,发现这部分sgRNA可以提高其激活效率。然后,在二代CRISPR-dCas9 SAM系统的基础上,通过使用最佳的Gata4-sgRNAs组合联合逆转录病毒介导的Mef2c和Tbx5表达,我们在MEFs和fCFs中均通过sgRNA对Gata4表达的内源性激活替代外源性Gata4过表达,实现了成纤维细胞向心肌细胞的重编程。并且,这种组合对MEFs的重编程效率与外源逆转录病毒提高M/G/T的表达的效率相似,而fCFs则不能达到如此高的重编程效率。相反,通过使用所有三个转录因子相应的sgRNA内源性激活M/G/T的表达也能够将部分MEFs和fCFs重编程为iCM,但重编程效率很低。结论:本研究展示了重编程因子的sgRNA的设计和筛选的结果,并发现了可以显着激活内源性M、G和T表达的有效sgRNA,从而将MEFs和fCFs诱导为iCM。这种通过内源性激活基因表达介导的心脏重编程技术为心肌细胞的修复和再生治疗提供了新策略。未来可以通过设计带有高效重编程因子sgRNA的特异性组织工程纳米颗粒作用于成纤维细胞,从而进一步将其重编程为有功能的心肌细胞,这为促进心肌再生治疗,改善AMI后心功能的临床转化研究提供了理论依据。
蔡昊[6]（2019）在《三七皂苷R1预处理提高干细胞移植治疗心肌梗死的作用及其机制》文中研究指明目的干细胞移植治疗心肌梗死（myocardial infarction,MI）作为极具潜力的治疗手段,目前还面临着移植后细胞存活和分化效率低下的问题。针对心梗后缺血缺氧的微环境,提高细胞移植后生存率、促进干细胞分化成熟是目前研究的关注焦点。作为两种最有临床应用价值的干细胞,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）有较强的外分泌功能,在移植后能通过该途径促进组织修复,目前已被广泛应用于临床研究。而诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSs）具有更接近胚胎干细胞的自我更新和多向分化潜能,能够有效诱导分化为心肌细胞,称诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（induced pluripotent stem cells-cardiomyocytes,i PS-CMs）,并可避免伦理问题,在未来有着更广阔的临床应用前景[1]。本研究通过三七皂苷R1（Notoginsenoside R1,NGR1）预处理以提高MSCs、i PS-CMs的存活和外分泌功能,并探讨经NGR1预处理的MSCs和i PS-CMs移植治疗MI的作用及其内在机制,为临床应用干细胞治疗MI等缺血性心脏病提供理论和实验依据。方法体外培养MSCs,经NGR1预处理后,通过H2O2进行氧化应激模型构建,利用CCK8和TUNEL分别检测NGR1对细胞增殖活性和对抗H2O2诱导损伤的的影响,并通过试剂盒检测细胞内ROS含量,Western Blot检测p-Akt、p-CREB、p-Fox O1的水平,ELISA检测细胞培养液中的IGF-1、VEGF、SCF、b FGF含量,q RT-PCR检测细胞培养液外泌体中mi R-21表达水平,并对各组细胞进行转录组测序,在体外探讨NGR1对MSCs的保护作用。体外培养i PSs,并诱导其向心肌细胞分化,利用CCK8检测NGR1对i PSs-CM增殖的的影响,Western Blot检测p-Akt的水平。构建大鼠、裸鼠MI模型,分别移植NGR1预处理的MSCs或i PS-CMs,通过超声心动图检测治疗后各组动物心功能,经Masson三色染色测定心肌梗死面积和梗死区胶原纤维沉积,通过TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光染色检测梗死区HNA、c Tn T、Cx43、v WF、α-SMA、Lyve-1的表达,q RT-PCR检测梗死心肌组织中IGF-1、VEGF、VEGFC、SCF、b FGF的表达,明确NGR1预处理后的MSCs或i PS-CMs移植治疗效果及可能的机制。结果不同浓度NGR1能够促进MSCs增殖。在300μM的H2O2刺激条件下,0.1μM的NGR1处理24h或48h均可显着保存细胞活性,保护细胞免受H2O2造成的损伤,1μM的NGR1和10μM的NGR1处理也可以提高MSCs的细胞活性,但明显低于0.1μM的NGR1。0.1μM的NGR1是保护MSCs的最佳浓度。NGR1处理MSCs后,p-Akt、p-Fox O1的水平明显增加,p-CREB水平无明显变化。加入PI3K抑制剂LY294002后,各组各时间点p-Akt水平相近,p-Fox O1水平相近。DAPI和TUNEL染色显示,300μM的H2O2处理后可以显着地增加凋亡的MSCs数量,并显着提高MSCs中的ROS含量,而NGR1可以明显降低MSCs的凋亡和ROS水平,而加入PI3K抑制剂LY294002后,凋亡MSCs的数量显着增加,ROS含量升高。NGR1可以促进体外培养的MSCs释放IGF-1、VEGF、SCF、b FGF,LY294002可以抑制NGR1对以上细胞因子的促进作用。NGR1处理还能够提高MSCs外泌体中mi R-21的水平。转录组测序结果表明,NGR1的影响会富集到的信号通路包括合成和代谢相关的通路和凋亡信号通路,如:脂肪酸代谢、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、p53信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路等。其他一些通路也明显被激活,如内吞、细胞周期等。MSCs移植可以提高MI大鼠EF和FS值,并降低LVIDs和LVESV值。NGR1预处理的MSCs移植组中EF和FS值最高,LVIDs和LVESV值最低。Masson三色染色检测发现,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可降低梗死面积和胶原沉积。NGR1预处理的MSCs移植组梗死面积和梗死区胶原纤维沉积显着低于PBS组和MSCs移植。PBS组大鼠梗死区室壁厚度明显减少,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均能增加梗死区室壁厚度,并且NGR1预处理的MSCs移植组大鼠中梗死区室壁厚度明显高于MSCs移植组。通过GFP示踪移植细胞的存活发现,NGR1预处理的MSCs移植组中MSCs数量明显高于MSCs移植组。TUNEL染色检测各组梗死区凋亡细胞的数量发现,PBS组中凋亡细胞数量最多,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可减少细胞凋亡。免疫荧光染色检测v WF和α-SMA并统计各组血管密度发现,MSCs移植和NGR1预处理的MSCs移植均可提高梗死区微血管数目和α-SMA阳性血管数目。与MSCs移植组相比,NGR1预处理的MSCs移植组中梗死区微血管数量和α-SMA阳性血管数量明显增多。ELISA检测各组梗死区心肌组织中IGF-1、SDF-1和VEGF的含量发现,与PBS组相比,MSCs移植可提高IGF-1、SDF-1和VEGF的水平,而NGR1预处理的MSCs移植组中各细胞因子的水平明显高于MSCs移植组。通过对GSK3和Wnt信号通路的抑制和控制细胞浓度可以有效诱导hi PSs分化为hi PS-CMs,免疫荧光染色检测到诱导分化后的细胞表达c Tn T。在6孔板中最佳诱导条件为100万细胞/孔,CHIR99021浓度为6μM。经NGR1处理后,各组间OD值无明显差别。但随着药物处理时间的增加,0.1μM、1μM、10μM NGR1均能够表现出促进hi PS-CMs增殖的趋势。药物处理72h后,0.1μM组促进趋势最为明显。NGR1处理hi PS-CMs后,p-Akt水平有明显提升。加入PI3K抑制剂LY294002后,p-Akt的活化受到显着抑制。hi PS-CMs移植后2周时,注射i PS-CMs组（IC）,其心功能指标EF、FS相较于MI组有明显的改善,LVEDV、LVIDd相较于Control组和MI组有所升高,LVESV、LVIDs相较于MI组有所降低。注射经NGR1预处理的i PS-CMs组（NIC）,其心功能指标EF、FS优于IC组,LVEDV、LVIDd、LVESV、LVIDs指标的恢复趋势也优于IC组。4周时,NIC组其心功能指标EF、FS相较于MI组亦有着明显的改善,并优于IC组。Masson三色染色检测发现,IC组和NIC组梗死面积和胶原沉积均降低。MI组裸鼠梗死区室壁厚度明显减少,hi PS-CMs移植和NGR1预处理的i PS-CMs移植均能增加梗死区室壁厚度。NIC组裸鼠中梗死区室壁厚度明显高于IC组。TUNEL染色结果显示,hi PS-CMs移植可以降低凋亡数量,而0.1μM NGR1预处理的hi PS-CMs移植相较于hi PS-CMs移植,可以更明显地地减少心脏组织的细胞凋亡。HNA和c Tn T染色结果显示,NGR1预处理可以促进移植hi PS-CMs的存活数量,并且大部分移植的i PS-CMs均表达c Tn T。v WF和Lyve-1染色结果表明,NGR1预处理还能提高i PS-CMs移植后的血管密度和淋巴管密度。NGR1预处理的hi PS-CMs移植组中各细胞因子VEGFC、IGF-1、SDF-1的水平明显高于hi PS-CMs移植组和MI组。结论NGR1可以保护MSCs对抗H2O2造成的细胞凋亡,促进IGF-1、VEGF、SCF和b FGF的分泌,其机制可能与PI3K/Akt/Fox O1信号通路有关。NGR1预处理可能通过增强MSCs的存活和旁分泌途径提高MSCs移植治疗MI的作用。通过对GSK3和Wnt信号通路的抑制和控制细胞浓度可以有效诱导i PS分化为hi PS-CMs。NGR1有促进hi PS-CMs增殖的趋势并可提高p-Akt的水平。NGR1预处理能够提高hi PS-CMs移植治疗裸鼠MI的作用,其主要机制可能与增强细胞的存活和旁分泌途径有关。
王嵘[7]（2019）在《冠状动脉旁路移植术治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的临床研究》文中指出目的:缺血性心脏病（Ischemic Heart Disease,IHD）左心功能不全（left ventricular dysfunction,LVD）是导致慢性心力衰竭的主要病因,冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting,CABG）是治疗缺血性心脏病的标准技术手段,而以细胞移植和基因药物为代表的再生医学技术已成为这一领域有希望的治疗方法。本文主要研究:1、回顾性分析CABG治疗缺血性心脏病左心功能不全的手术时机、危险因素、心肌保护、与经皮介入技术（Per cutaneous Coronary Intervention,PCI）的对比以及近远期疗效;2、前瞻性随机对照方法研究CABG联合自体骨髓单个核细胞（autologous Bone Marrow Mononuclear Cells,aBMMNCs）/腺病毒肝细胞生长因子基因（adenovirus hepatocyte growth factor,ad-HGF）心肌内注射治疗缺血性心脏病左心功能不全的安全性及有效性。方法:1、收集2003年1月至2013年12月在解放军总医院接受CABG治疗的缺血性心脏病左心功能不全（超声左室射血分数≤50%）患者资料建立数据库,共380例患者纳入研究,收集其人口学资料、EuroSCORE危险因素、心肌梗死与CABG手术的间隔时间、心肌保护液的种类,以手术近期结果（住院死亡及主要并发症）以及远期结果（全因死亡及主要不良事件）为主要观察终点,（1）采取多因素回归分析方法分析影响CABG手术治疗缺血性心脏病左心功能不全近远期疗效的危险因素;（2）以心肌梗死后接受CABG手术的时间分组（心梗后3周、3周到3月以及3月以上）,对比分析不同时机实施CABG手术对近远期结果的影响;（3）选择同期接受PCI治疗的586例同类患者为对照,根据术前危险因素进行1:1配对,对比分析不同血运重建方式的近期疗效;（4）以使用HTK液与含血停跳液分组,比较不同停跳液对该类患者的心肌保护效果。2、以缺血性心脏病左心功能不全患者为研究对象,采用前瞻性随机对照研究方法,根据治疗方式分为细胞移植+CABG组和单纯CABG组。细胞移植组在麻醉后开胸前抽取胸骨骨髓血80ml,采用密度梯度法分离自体骨髓单个核细胞悬液,治疗组与对照组均在体外循环心脏停跳下完成手术,治疗组在心脏停跳下围绕心肌梗死病灶边缘进行aBMMNCs心肌内多点注射,其余过程与对照组一致,按常规完成CABG手术。术前术后采用心脏超声等指标评价左室整体功能等,统计患者近远期死亡及主要不良事件,评价细胞移植治疗的安全性以及有效性。3、以缺血性心脏病左心功能不全患者为研究对象,采用前瞻性随机盲法对照研究,根据ad-HGF给药剂量分为高剂量组（5×109pfu/人）、低剂量组（1.5×109pfu/人）和对照组,治疗组与对照组均在体外循环心脏停跳下完成手术,治疗组在心脏停跳下围绕心肌梗死病灶边缘进行ad-HGF心肌内多点注射,其余过程与对照组一致,按常规完成CABG手术。术前术后采用心脏磁共振、PETCT/SPECT等指标评价左室形态功能以及心肌梗死面积等,统计患者近远期死亡及主要不良事件,探索ad-HGF治疗的有效性。结果:1、除手术死亡外,延迟拔管、低心排出量综合症、恶性室性心律失常、急性肾功能不全以及围术期心肌梗死是术后早期的主要不良事件。Logistic回归分析显示,围术期使用IABP是延迟拔管与低心排的共同危险因素,与手术死亡也密切相关。Cox比例风险模型多因素分析显示:术前LVEF及围术期使用IABP是影响术后长期生存的危险因素。2、早期干预组低心排发生率显着高于其它两组,其它术后不良事件方面无显着差异。总体5年生存率82.8%,Kaplan-Meier曲线显示三组之间5年生存率无统计学差异（χ2=0.668,P=0.716）。免除全因死亡或再次心衰入院比例分别为54.5%,67.2%,和62.3%,无显着统计学差异（χ2=0.878,P=0.645）.多因素回归分析显示术前危重状态是术后长期生存的危险因素,心梗后手术时机与术后长期生存无显着相关性3、CABG组处理的靶血管数目明显多于PCI组（2.90±0.81 vs.1.67±0.73,P=0.000）,完全再血管化程度也显着高于PCI组（94.8%vs.51.8%,P=0.000）。组内比较,两组患者术后LVEF较术前均有显着改善（P=0.000）,CABG组术后LVEDD较术前明显缩小（P=0.000）,而PCI组术后LVEDD较术前无明显改变（P=0.361）。组间比较,PCI组与CABG组患者术前术后LVEF差值无显着差异（P>0.05,P=0.171）,而CABG组术前术后LVEDD的差值显着高于PCI组（P=0.000）。在手术死亡、严重室性心律失常、术后肾衰、低心排、呼吸功能不全、围术期使用IABP及脑血管并发症等方面差异均无统计学意义（P>0.05）。4、HTK液组在吻合口数目、CPB时间、主动脉阻断时间、停机后肺动脉压力及停机后多巴胺用量方面显着高于含血停跳液组,但自动复跳率两组之间无显着差异。两组在手术死亡及围术期严重并发症方面均无显着差异。5、共纳入33例患者,其中细胞移植+CABG组17例,对照组16例。移植组平均每个患者注射98.5±48.3×106 aBMMNCs。全组患者无住院死亡、心肌梗死、卒中、再次开胸止血以及肾功能衰竭等并发症。两组之间心律失常（房颤及室性心律失常）发生率、体外循环时间及吻合口数目无显着差异,主动脉阻断时间细胞移植组长于对照组。33例患者完成术后半年随访,治疗组1例患者在术后10月时发生猝死,共32例患者完成术后2年随访。术后半年细胞移植组LVEF显着高于对照组,但两年时两组无显着差异,LVEDV及LVESV在术后半年及2年时比较均无显着差异。在NYHAⅢ/Ⅳ级占比、6分钟步行距离差值、BNP差值以及MACES事件比率方面,两组均无显着性差异。6、共纳入13例患者,其中高剂量组6例,低剂量组2例,对照组5例。全组患者无住院死亡、心肌梗死、卒中、再次开胸止血以及肾功能衰竭等并发症,均在术后痊愈出院。三组患者术前磁共振检查各指标无显着差异。术后3月随访,磁共振检查梗死面积百分比高剂量组较对照组明显减小,有统计学意义（P=0.05）,LVEF、LVEDVI、LVESVI、梗死体积等指标组间无显着差异;术后6月随访,磁共振检查梗死面积较对照组有减少趋势,但未达到统计学意义,其余各指标均无统计学差异。结论:1、CABG是治疗缺血性心脏病左心功能不全患者的良好手段,近远期疗效满意。低心排是导致手术死亡的主要原因,围术期使用IABP是延迟拔管及低心排的共同危险因素,与手术死亡及长期生存密切相关,高质量的围术期管理对于手术早期结果至关重要。2、急性ST抬高型心肌梗死后左心功能不全患者在心梗后3周内、3周到3月及3月以上接受CABG手术,在手术死亡率及长期生存方面无显着性差异。然而3周内手术低心排发生率较高,需要更为严密的围术期管理。患者术前严重状态而非心梗后手术时间是影响手术近远期结果的危险因素。3、对于复杂冠脉病变合并左心功能不全患者,CABG与PCI均为安全可行的血运重建方式。与PCI相比,CABG完全再血管化程度更高,术后早期左心功能改善更为明显。4、对复杂冠脉病变合并左心功能不全患者,HTK液与4:1含血停跳液均可提供安全有效的心肌保护效果。在心肌缺血时间延长的情况下,HTK液并未增加患者术后早期心血管不良事件的发生率。5、对缺血性心脏病左心功能不全患者,CABG同期心肌内注射aBMMNCs是安全可行的治疗方法,2年随访未发现严重不良事件。aBMMNCs移植可在术后短期内（半年）改善左室收缩功能,但这一作用在术后2年时消失。6、对缺血性心脏病左心功能不全患者,CABG同期心肌内注射5×109pfu/人ad-HGF可在术后早期缩小心肌梗死面积,但对左室形态及功能未见显着改善作用。
尤云颖[8]（2019）在《5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化》文中研究指明目的:本实验体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并用5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,为骨髓间充质干细胞移植治疗心肌纤维化提供良好的种子细胞。方法:（1）通过全骨髓贴壁培养法从wistar大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,在37℃5%CO2培养箱内培养,当贴壁细胞接近大部分融合时反复传代扩增,在倒置显微镜下观察细胞情况,通过MTT法检测第2代骨髓间充质干细胞的吸光度值并绘制生长曲线,同时通过流式细胞仪测定第3代细胞表面CD29和CD45的表达。（2）取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞使用不同浓度的5-氮胞苷（对照组、5umol/l、10umol/l、15umol/l）诱导24h后换液,在CO2培养箱内培养,倒置显微镜下观察细胞形态变化,在第28天行免疫细胞化学染色检测肌钙蛋白T（cTnT）、连接蛋白-43（CX-43）、ɑ-平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）的表达。结果:1.在倒置显微镜下观察原代细胞呈多边形,有集落生长的趋势,约7-10天长满至80%-90%。传代细胞逐代伸展呈长梭形,排列具有方向性,呈漩涡状生长,约4-5天传代一次。2.通过MTT法绘制第2代骨髓间充质干细胞生长曲线发现,细胞在第3-5天增殖速度最快,第6天开始生长趋于平缓甚至有下降趋势,因此最佳传代时间为第4-5天。3.流式细胞仪检测示:第3代骨髓间充质干细胞表面CD29阳性率为99.4%,CD45阳性率为1.4%,表明实验用的第三代骨髓间充质干细胞是纯化的细胞。4.在倒置显微镜及HE染色下观察,对照组细胞形态呈细长梭形,排列具有极性。诱导组在7天开始部分细胞体积变大、形态各异,呈不规则形、三角形、长梭形等,且细胞极性消失,排列不规则;部分细胞伸出粗大突起,彼此融合。5.第28天不同浓度5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞通过细胞免疫化学法鉴定胞浆内肌钙蛋白T（cTnT）的阳性表达率分别为13.66±3.21%、44.33±4.04%、32.33±1.15%（P≤0.01）,连接蛋白-43（CX-43）的阳性表达率分别为6.00±2.00%、31.00±4.00%、11.00±1.73%（P≤0.05）,ɑ-平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）的阳性表达率分别为13.00±4.35%、43.00±4.00%、26.33±1.53%（P≤0.01）,均显着高于对照组。结论:1.全骨髓培养法是一种简单、快速、高效的体外获得纯度较高的骨髓间充质干细胞培养方法。2.10umol/l的5-氮胞苷可以在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,诱导后阳性表达率最高。
朱可扬[9]（2019）在《移植人胚胎干细胞来源心血管前体细胞改善非人灵长类心肌梗死后心功能》文中进行了进一步梳理研究背景及目的:我国心血管疾病高居致死病因首位,且持续上升。心肌梗死可以造成心肌细胞不可逆的损伤和丢失,且现有的手段难以逆转心梗后心肌衰竭的进程。如何减少心梗后心肌细胞丢失、促进功能重建是心血管研究领域的重大问题。由于人多能干细胞可在体外无限增殖,并可分化为各种心血管细胞,移植干细胞及衍生细胞为心梗后心肌修复带来希望。人胚胎干细胞衍生心血管前体细胞具有显着的治疗心肌梗死的疗效。本研究的目的是验证胚胎干细胞衍生心血管前体细胞的治疗有效性和安全性,同时探索不同免疫抑制剂方案对人多能干细胞大动物研究的效果。我们在使用了不同免疫抑制剂的非人灵长类动物中建立心梗模型,并在心梗后将人胚胎干细胞来源心血管前体细胞移植进入动物心脏中,通过多种评价方法,对其治疗作用与潜在机制做进一步研究。方法和结果:我们利用之前建立的方法,运用单层分化方法,成功将人胚胎干细胞高效地诱导为心血管前体细胞。在使用了环孢霉素（cyclosporine）和联合使用环孢霉素,甲强龙和舒莱（MDR）的食蟹猴中构建了心梗模型,在心梗后30min后,将107人胚胎干细胞衍生心血管前体细胞心肌内注射进入不同食蟹猴梗死周边区。同时,本研究中设置了对照组（MI+MDR）,即用了 MDR的且进行心梗模型而不移植细胞的动物。在术后3天后,我们发现MI+MDR+CVPC组中移植细胞的驻留明显高于 MI+cyclosporine+CVPC 组。同时,MI+MDR+CVPC 组梗死周边区中的 CD3,CD4,CD8 阳性 T 淋巴细胞显着性少于 MI+cyclosporine+CVPC 组。MI+MDR+CVPC组的梗死周边区凋亡细胞明显少于MI+MDR组。在术后28天,MI+MDR+CVPC组的心功能恢复好于MI+MDR组。同时我们检测了动物的血生化和血常规来检测免疫抑制剂和细胞移植的安全性,我们发现MDR能导致暂时性的肝功能受损,但是在实验的进行中,肝功能可以恢复到正常水平。结论:本次研究是迄今为止世界上最大样本量在非人灵长类动物上进行的人多能干细胞研究。和单用环孢霉素相比,MDR可以明显减少宿主对移植细胞的免疫排斥,同时增加移植细胞的驻留率。同时,更多的细胞驻留也导致了更少的心肌细胞凋亡与更好的心功能恢复。但是,即使是在MDR组,140天的时间后,还是检测不到移植的心血管前体细胞,预示细胞治疗心肌梗死的主要机制为旁分泌作用。
施盛[10]（2018）在《Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究》文中认为背景:间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新能力的细胞,在一定的诱导条件下它能够分化为脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞类型的多能干细胞,并能分泌多种生长因子诱导血管生成。这使得间充质干细胞在再生医学方面得到了广泛的关注。目前,利用干细胞移植技术治疗缺血性疾病是一个快速发展的领域,其安全性和有效性已经被不同的研究证实。MSCs治疗缺血性心肌病其原理是通过移植或动员干细胞进入缺血性的心肌组织,增加梗死区域心肌样细胞数量及毛细血管数量,逆转心脏重构,进而改善心功能。虽然MSCs向心肌细胞分化能力还存有争议,但MSCs向内皮细胞、平滑肌细胞或血管周细胞的分化能力已得到证实。血管生成能力的增强有助于增加血管数量,从而改善心脏功能。MSCs移植可以通过刺激血管生成来促进心肌的修复,是一种有前景的缺血性心脏病治疗的细胞类型。Hedgehog（Hh）蛋白是一种在胚胎发育过程中具有重要作用的成形素,它们控制着胚胎发育过程中不同的组织和器官的发育模式。VEGF信号通路是调节血管发育和内皮细胞分化的重要信号通路之一,VEGF诱导MSCs向内皮细胞分化的确切调控机制还未明确。Shh与多种血管生成因子相关,能促进VEGF的表达,参与血管的新生,对急性及慢性心肌缺血模型和缺血再灌注损伤模型有明显的治疗作用。Shh可以通过激活血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素促进血管生成,因此Shh可能是血管生成的关键调控分子之一,因此也被认为是增强血管生成较有前景的治疗分子。第一部分过表达Shh基因的大鼠BMSCs的构建目的:从大鼠中分离骨髓间充质干细胞,并利用慢病毒系统构建Shh过表达的MSCs细胞株。方法:首先从幼龄大鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）,取传至第三代的细胞,流式细胞技术对表面相关标记分子进行检测。然后利用PCR扩增技术成功的克隆出了Shh基因,并利用慢病毒系统将Shh基因在BMSCs细胞中稳定过表达。结果:检测结果显示,CD90、CD29抗原在细胞表面高表达,MHC II和CD11b/c在细胞表面不表达,表明我们分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。RT-q PCR检测发现,MSCs中Shh m RNA的表达水平上调,且Shh m RNA表达水平在转染后3天和7天中增加了约3000倍和5000倍。结论:成功的从大鼠骨髓中分离出间充质干细胞,并成功的构建过表达Shh基因的MSCs细胞株。第二部分Shh基因促进BMSCs向内皮细胞分化能力的研究目的:体外实验验证过表达Shh基因后,对于MSC向内皮细胞分化的影响。方法:利用RT-q PCR分别检测Shh转染3天和7天后MSCs细胞中,促血管生成分子Ptch1、IGF1、HGF、Ang-1以及VEGF-A的表达水平,并在分别使用管样形成实验、Transwell迁移实验和体内胶栓实验,检测了MSCShh管样形成能力、细胞的迁移能力和向内皮细胞分化的能力。结果:过表达Shh后,MSCs细胞中促血管生成分子表达水平上调,MSCShh的管样形成能力、迁移能力和向内皮细胞分化的能力显着高于MSCNC对照组。而且转染后7天的MSCShh细胞的成管长度和节点数量以及向内皮细胞分化能力明显高于转染后3天的细胞。结论:过表达Shh基因后,MSCs中促血管生成生长因子的表达增加,体外迁移能力、成管能力增强以及血管新生的能力增强。第三部分过表达Shh基因的BMSCs治疗大鼠心肌梗死的疗效探究目的:大鼠心梗模型中验证过表达Shh基因后,MSC对心梗的修复效果。方法:将Shh过表达前后的MSC细胞,移植到大鼠心梗模型中。心超检测心功能的恢复情况,Masson染色观察纤维化心梗后的纤维化面积。结果:MSCNC以及MSCShh均能够修复心梗后的心功能,且向较于MSCNC组,MSCShh组的修复效果更加明显。结论:过表达Shh基因后,MSC细胞能更有效地减少梗死区域面积,改善心功能。第四部分Shh基因促进BMSCs的内皮细胞分化能力的机制探讨目的:进一步的研究探讨,过表达Shh基因的MSCs细胞向内皮分化的具体机制。方法:将MSCNC和MSCShh的进行高通量测序,并对测序结果进行初步分析,找出差异表达的基因,筛选靶基因。利用si RNA技术,将靶基因沉默后分别验证MSCNC细胞的成管能力和心梗修复的能力。结果:结果发现MSCShh中,VEGF-D等与血管生成相关的基因的表达远高于在MSCNC中的表达。特别是在过表达Shh后VEGF-D的表达水平明显上调,提示Shh分子可能通过促进VEGF-D的表达进而促进血管新生。并进一步分别在细胞水平和动物水平上对此进行验证。用si RNA抑制VEGF-D的表达后,MSCShh的成管能力下降,体内实验发现其心梗后的修复效果受到抑制。结论:Shh基因可以通过Shh/VEGF-D信号轴促进骨髓间充质干细胞的向内皮分化。
二、干细胞移植治疗心肌梗死的最新进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、干细胞移植治疗心肌梗死的最新进展（论文提纲范文）
（1）活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 活血温阳类药物治疗冠心病的文献研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药联合MSCs移植治疗心肌梗死的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 姚魁武教授论治冠心病阳虚证的经验以及发掘 |
| 导师姚魁武活血温通法治疗冠心病的经验总结 |
| 基于中医传承计算平台分析姚魁武教授治疗冠心病阳虚证用药特点 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 活血温通方联合BMSCs移植治疗大鼠急性心梗的疗效评价 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 活血温通方联合BMSCs移植改善大鼠心梗区缺血缺氧微环境的机制研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 创新点与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 查新报告 |
（2）益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 益气活血方联合骨髓间充质干细胞对大鼠心肌梗死心功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 益气活血方对骨髓间充质干细胞缺血心肌归巢影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 实验三:益气活血方联合骨髓间充质干细胞通过miRNA-210/BNIP3 通路影响自噬-凋亡机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 microRNA在心肌梗死后心室重构中的研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗心肌梗死后心室重构的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 针刺治疗心肌缺血及相关分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 总体设计思路 |
| 参考文献 |
| 第一部分 研究多种来源外泌体在体外循环围手术期的改变情况 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究骨髓间充质干细胞来源外泌体调控自噬发挥心肌保护作用机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体的研究进展及在心血管疾病中的临床应用价值 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（5）间充质干细胞和重编程因子的内外源性心肌修复的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要(一) |
| 摘要(二) |
| ABSTRACT 1 |
| ABSTRACT 2 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 他汀联合骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的方案优化及相关机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图表 |
| 第二部分 基于CRISPR-dCas9技术内源性激活成纤维细胞的重编程因子表达以促进心肌直接重编程 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图表 |
| 论文综述 缺血性心脏病的心肌修复与再生治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）三七皂苷R1预处理提高干细胞移植治疗心肌梗死的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 研究背景 |
| 研究意义和价值 |
| 英文缩略词表 |
| 技术路线 |
| 第一部分 NGR1预处理对MSCs存活和移植治疗心肌梗死的影响及机制 |
| 1 实验动物 |
| 2 主要器械 |
| 3 主要药品及试剂 |
| 4 主要耗材 |
| 5 实验设计 |
| 5.1 MSCs培养 |
| 5.2 MSCs复苏 |
| 5.3 MSCs传代 |
| 5.4 CCK8检测NGR1对细胞活力的影响 |
| 5.5 TUNEL检测 |
| 5.6 ROS检测 |
| 5.7 WB检测p-Akt、p-FoxO1的表达 |
| 5.8 ELISA检测细胞培养液中IGF-1、VEGF、SCF、bFGF含量 |
| 5.9 MSCs外泌体提取 |
| 5.10 MSCs转录组基因测序 |
| 5.11 模型制备及细胞移植 |
| 5.12 心功能检测 |
| 5.13 组织取材 |
| 5.14 冰冻切片制备 |
| 5.15 Masson三色染色 |
| 5.16 免疫荧光染色 |
| 5.17 统计学方法 |
| 6 结果 |
| 6.1 NGR1对抗H2O2诱导的MSCs凋亡 |
| 6.2 NGR1对PI3K/Akt/FoxO1和CREB信号通路的影响 |
| 6.3 NGR1通过PI3K/Akt/FoxO1信号通路保护MSCs |
| 6.4 NGR1通过PI3K/Akt/FoxO1信号抑制细胞内ROS水平 |
| 6.5 NGR1对细胞因子分泌的影响 |
| 6.6 NGR1预处理提高MSC外泌体中miR-21的表达 |
| 6.7 NGR1对MSC转录组基因表达的影响 |
| 6.8 NGR1预处理的MSCs移植改善心功能 |
| 6.9 NGR1预处理的MSCs移植降低梗死面积和胶原沉积 |
| 6.10 NGR1预处理的MSCs移植提高MSCs存活和降低心肌组织细胞凋亡 |
| 6.11 NGR1预处理的MSCs移植促进血管新生和旁分泌 |
| 7 小结 |
| 第二部分 NGR1预处理提高hiPS-CMs移植治疗心梗 |
| 1 实验动物 |
| 2 主要器械 |
| 3 主要药品及试剂 |
| 4 主要耗材 |
| 5 实验设计 |
| 5.1 hiPSs复苏 |
| 5.2 hiPSs传代 |
| 5.3 hiPSs诱导分化及心肌细胞标志物的检测 |
| 5.4 CCK8检测NGR1对hiPS-CMs增殖的作用 |
| 5.5 WB检测p-Akt的表达 |
| 5.6 模型制备及细胞移植 |
| 5.7 心功能检测 |
| 5.8 组织取材 |
| 5.9 冰冻切片制备 |
| 5.10 Masson三色染色 |
| 5.11 免疫荧光染色 |
| 5.12 qRT-PCR检测 |
| 5.13 统计学方法 |
| 6 结果 |
| 6.1 hiPSs诱导分化及心肌细胞标志物的检测 |
| 6.2 NGR1对hiPS-CMs增殖的影响 |
| 6.3 NGR1对hiPS-CMs PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 6.4 NGR1预处理的hiPS-CMs移植改善心功能 |
| 6.5 NGR1预处理的hiPS-CMs移植降低梗死面积和胶原沉积 |
| 6.6 NGR1预处理的hiPS-CMs移植提高移植细胞存活,降低心脏组织凋亡 |
| 6.7 NGR1预处理的hiPS-CMs移植促进血管新生 |
| 6.8 NGR1预处理的hiPS-CMs移植促进淋巴管新生 |
| 6.9 NGR1预处理的hiPS-CMs移植促进旁分泌 |
| 7 小结 |
| 讨论 |
| 1、选择合适的细胞类型是干细胞移植的首要问题 |
| 2、NGR1预处理是一种用于提高干细胞移植后存活的可行手段 |
| 3、Pi3k/Akt/FoxO1信号通路参与NGR1促进干细胞存活 |
| 4、NGR1通过旁分泌机制促进干细胞移植治疗MI |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 文献综述 间充质干细胞来源的外泌体治疗心肌梗死的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 |
| 附录三 硕士研究生期间撰写和已发表论文 |
| 附录四 |
| 研究生期间参加活动及会议 |
| 研究生期间参与研究课题 |
（7）冠状动脉旁路移植术治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分: 冠状动脉旁路移植术治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的临床研究 |
| 一、冠状动脉旁路移植术治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的近远期结果及危险因素分析 |
| 1、研究对象 |
| 2、手术方法 |
| 3、观察指标 |
| 4、统计学分析 |
| 5、结果 |
| 6、讨论 |
| 参考文献 |
| 二、不同时机冠状动脉旁路移植术治疗心肌梗死合并左心功能不全的效果分析 |
| 1、研究对象 |
| 2、研究方法 |
| 3、统计学方法 |
| 4、结果 |
| 5、讨论 |
| 参考文献 |
| 三、不同血运重建方式治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的对比研究 |
| 1、研究对象及方法 |
| 2、观察指标 |
| 3、统计学处理 |
| 4、结果 |
| 5、讨论 |
| 参考文献 |
| 四、HTK液与含血停跳液对复杂冠脉病变合并左心功能不全心肌保护的对比研究 |
| 1、研究对象 |
| 2、手术方法 |
| 3、观察指标 |
| 4、统计学分析 |
| 5、结果 |
| 6、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 冠状动脉旁路移植术联合再生医学技术治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的临床研究 |
| 一、冠状动脉旁路移植术联合自体骨髓单个核细胞移植治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的前瞻性随机对照研究 |
| 1、研究对象及方法 |
| 2、手术方法、细胞制备及移植 |
| 3、观察指标及随访 |
| 4、统计分析 |
| 5、结果 |
| 6、讨论 |
| 参考文献 |
| 二、冠状动脉旁路移植术联合腺病毒-肝细胞生长因子基因心肌内注射治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的随机对照研究 |
| 1、研究对象及方法 |
| 2、手术方法及药物注射 |
| 3、观察指标及随访 |
| 4、统计分析 |
| 5、结果 |
| 6、讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述一: 冠状动脉旁路移植术治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二: 冠状动脉旁路移植术联合再生医学技术治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（8）5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）移植人胚胎干细胞来源心血管前体细胞改善非人灵长类心肌梗死后心功能（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 细胞培养试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.1.1 人胚胎干细胞hESC的复苏 |
| 3.1.2 人胚胎干细胞hESC的培养 |
| 3.1.3 人胚胎干细胞hESC的传代 |
| 3.1.4 人胚胎干细胞hESC的冻存 |
| 3.1.5 人胚胎干细胞碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性的鉴定 |
| 3.1.6 表达EGFP的人胚胎干细胞hESC建立 |
| 3.2 人胚胎干细胞向心血管前体细胞(cardiovascular progenitor cells,CVPCs)分化 |
| 3.3 流式细胞术鉴定细胞 |
| 3.4 人胚胎干细胞hESC和心血管前体细胞(CVPC)的免疫荧光染色 |
| 3.5 动物实验 |
| 3.5.1 食蟹猴的免疫抑制剂方案 |
| 3.5.2 食蟹猴心梗手术与细胞移植 |
| 3.5.3 食蟹猴心脏超声检测 |
| 3.5.4 食蟹猴的血常规和肝肾功能检测 |
| 3.5.5 食蟹猴的处死与组织留存 |
| 3.6 聚合酶链式反应 |
| 3.6.1 基因组DNA的提取 |
| 3.6.2 荧光定量PCR |
| 3.7 Western Blot |
| 3.7.1 总蛋白提取 |
| 3.7.2 总蛋白定量 |
| 3.7.3 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 3.7.4 转膜(湿法) |
| 3.7.5 封闭,抗体结合和显影 |
| 3.8 组织学检测 |
| 3.8.1 组织样品冰冻切片 |
| 3.8.2 免疫组化染色 |
| 3.9 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 hESCs的多能性鉴定 |
| 4.2 hESCs定向分化为心血管前体细胞(CVPCs) |
| 4.3 hESC-CVPCs的免疫源性检测 |
| 4.4 多种免疫抑制剂组合MDR能提高移植的hESC-CVPCs细胞驻留 |
| 4.5 联合免疫抑制剂MDR能减少食蟹猴对hESC-CVPCs免疫排斥 |
| 4.6 多种免疫抑制剂组合MDR能够显着增强hESC-CVPCs的抗凋亡作用 |
| 4.7 移植人胚胎干细胞衍生心血管前体细胞(hESC-CVPCs)可以显着改善心梗后非人灵长类动物心功能 |
| 4.8 免疫抑制剂的肝毒性 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 过表达Shh基因的大鼠BMSCs的构建 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 Shh基因促进BMSCs向内皮细胞分化能力的研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 过表达Shh基因的BMSCs治疗大鼠心肌梗死的疗效探究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四部分 Shh基因促进BMSCs的内皮细胞分化能力的机制探讨 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 Shh信号通路在临床的潜在应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 间充质干细胞在心肌再生中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间主要科研成果 |
| 致谢 |
四、干细胞移植治疗心肌梗死的最新进展（论文参考文献）
- [1]活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究[D]. 王擎擎. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究[D]. 冀楠. 天津中医药大学, 2021(01)
- [3]针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究[D]. 李记泉. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [4]外泌体介导心肌损伤保护作用的机制研究[D]. 倪达. 苏州大学, 2020(06)
- [5]间充质干细胞和重编程因子的内外源性心肌修复的实验研究[D]. 徐珺. 北京协和医学院, 2020
- [6]三七皂苷R1预处理提高干细胞移植治疗心肌梗死的作用及其机制[D]. 蔡昊. 上海中医药大学, 2019
- [7]冠状动脉旁路移植术治疗缺血性心脏病合并左心功能不全的临床研究[D]. 王嵘. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [8]5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[D]. 尤云颖. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [9]移植人胚胎干细胞来源心血管前体细胞改善非人灵长类心肌梗死后心功能[D]. 朱可扬. 浙江大学, 2019(03)
- [10]Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究[D]. 施盛. 苏州大学, 2018(06)