一、转基因家禽的生产应用（论文文献综述）
李永山[1]（2020）在《转基因嵌合鸡模型的建立及抗新城疫病毒研究》文中提出转基因动物模型应用广泛,常用于动物育种、基因功能鉴定以及生物反应器等方面。由于家禽胚胎发育的特殊性,使得禽类转基因的发展一直落后于哺乳动物。目前制备转基因家禽的主要方法有胚胎干细胞法、原始生殖细胞法、精子载体法等,但操作复杂,技术难度大,效率低。因此,本研究采用Replication competent ALV LTR with a splice acceptor（RCAS）载体系统,该方法操作简单,效率高。RCAS是衍生自劳斯肉瘤病毒的逆转录病毒载体,具有完全复制能力。利用RCAS系统包装出带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的病毒,通过优化转导途径,制备出转基因嵌合鸡。此外,利用腺相关病毒2/9型（AAV2/9）系统制备超表达EGFP的鸡模型,将其与转基因嵌合鸡模型比较,以判断转基因效果。最后,以RCAS系统为基础分别表达两个潜在的可能具有抗新城疫病毒（NDV）的蛋白HN（Haemagglutinin-neuraminidase protein）和FAM（Family with sequence similarity 110 member）,HN为NDV包膜蛋白,FAM为本实验室鉴定的参与细胞有丝分裂的小鼠蛋白,随后对转基因嵌合鸡模型进行攻毒试验。本研究旨在为抗病毒基因的体内功能验证提供动物模型,为抗病毒转基因鸡的研究提供技术平台。具体研究内容及结果如下:1.RCASBP（A）-EGFP表达系统的构建将EGFP基因片段插入到RCASBP（A）载体特异性酶切位点Cla I,成构建了RCASBP（A）-EGFP载体,并将载体转染DF-1细胞包装病毒。采用荧光观察、Western blot方法检测到了EGFP在DF-1细胞上的高效表达。利用DF-1细胞扩增病毒,测得病毒滴度为1.275×108TU/m L（Transducing units/m L）.2.EGFP转基因嵌合鸡模型的建立（1）对鸡胚日龄、病毒用量等条件进行优化,确定RCASBP（A）病毒以106TU注射8日龄鸡胚卵黄囊时,鸡胚孵化率较高。（2）将RCASBP（A）-EGFP病毒以106TU/枚注射8日龄鸡胚卵黄囊,通过Western blot、组织冰冻切片检测蛋白表达,发现EGFP在心、肝、肾、腺胃、小肠、气管中表达较强,脾、肺、肌胃、法氏囊等组织表达较弱,表明成功建立了EGFP转基因嵌合鸡模型。（3）将RCASBP（A）-EGFP病毒以2×107TU/只,通过颈静脉注射2日龄雏鸡,成功建立了EGFP转基因嵌合鸡模型。EGFP表达在28dpipi（day post injection）时比14dpipi效果好;28 dpi时,EGFP在肝、肺、肾、肌肉、腺胃、淋巴、气管和睾丸中有所表达,其中肝与腺胃表达较强。（4）将AAV2/9-EGFP病毒以1011vg/鸡（Vector genomes/鸡）,通过颈静脉注射2日龄雏鸡,成功建立了EGFP超表达鸡模型。EGFP表达在28dpipi比14 dpi效果好;28 dpipi时,主要表达在心、肝、肺、肾、大脑、肌肉、气管等组织。3.转基因嵌合鸡抗NDV的研究构建了表达HN和FAM的RCASBP（A）-HN和RCASBP（A）-FAM系统,并利用该系统构建了稳定表达HN和FAM的DF-1细胞系。两个细胞系均有一定的抗NDV增殖的作用,病毒滴度降低约10～100倍。将病毒以106TU/枚注入8日龄鸡胚的卵黄囊,成功孵化了转基因嵌合鸡。Western blot检测显示,HN仅在肌肉中表达,FAM仅在肺、肌肉中有所表达;通过RT-PCR在心、肺、肾、肌肉等组织中检测到了目的基因。利用NDV强毒株F48E9对HN和FAM转基因嵌合鸡进行攻毒实验,结果显示,与对照组相比,HN和FAM转基因嵌合鸡在死亡率上并无差异,仅出现短暂延迟;部分组织病毒滴度显示,HN和FAM转基因嵌合鸡在脑、肝、肾、腺胃中病毒滴度仅有轻微降低。综上所述,利用RCAS系统制备了转EGFP嵌合鸡模型,并利用AAV2/9-EGFP制备EGFP雏鸡表达模型。通过优化转导条件,本研究确定了RCASBP（A）-EGFP病毒通过8日龄鸡胚卵黄囊注射时,EGFP表达效果最好。利用该种方法构建了表达HN和FAM的RCAS系统,体外细胞试验显示两个基因均有效抑制了病毒的增殖。制备的HN和FAM转基因嵌合鸡,攻毒试验发现二者没有明显的抗NDV作用,可能是由于两个蛋白的体内组织表达量较低或蛋白本身抗病毒效果有限所致。以上研究为鸡体内表达目的蛋白及抗病毒转基因鸡的研究提供了技术基础。
张蕾,张海波,章敬旗,张扬,常国斌,陈国宏,王健[2]（2020）在《CRISPR/Cas9系统在家禽中应用研究进展》文中认为CRISPR/Cas系统是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫系统,由规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins,Cas）组成。在此基础上改造获得的CRISPR/Cas9基因定点编辑技术可通过设计小的单链引导RNA（single guide RNA,sgRNA）对目标基因进行定向编辑。家禽作为农业经济动物,能够快速高效地生产蛋和肉产品,是世界范围内重要的蛋白质来源,也是极具价值的脊椎动物发育生物学模型。但是受限于卵生动物特点,家禽的受精卵与蛋黄表面紧密结合,未受精的卵子非常难取出,对家禽单细胞阶段受精卵进行靶向遗传修饰的可行性较低,因而家禽功能基因及转基因研究进展较为缓慢。CRISPR/Cas9基因定点编辑技术相较于其他基因编辑系统操作简单,靶向效率高,极大地推动了家禽功能基因的研究进展,是目前筛选和验证家禽功能基因的最有效的工具之一。文章综述了近年来CRISPR/Cas9在家禽细胞、生长发育和性腺分化、家禽疾病、家禽胚胎编辑和转基因家禽制备上的研究进展,以期为CRISPR/Cas9在家禽上的深入研究和应用提供参考。
石铭[3]（2013）在《抗禽流感双表达慢病毒载体的构建及转基因鸡制备方法的优化研究》文中研究指明禽流感是由正黏病毒科A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病,一旦爆发,不仅会给养禽业带来巨大的经济损失,也会对世界公共安全卫生构成威胁。目前,对鸡群进行免疫是当前控制禽流感爆发最常用的措施,但由于禽流感病毒含有多种亚型,且病毒的变异速度很快,所以疫苗免疫很难达到理想的防治效果,因此,通过导入免疫相关基因或针对禽流感病毒的特异性shRNA,制备抗禽流感转基因家禽,使家禽个体本身具有抵抗禽流感病毒的能力,从而有效抑制禽流感病毒的复制和在家禽个体间的传播,具有重大科学意义和应用价值。为成功制备抗禽流感家禽,本课题从抗禽流感转基因载体构建和鸡转基因技术优化等两个方面进行了研究。第一方面,抗禽流感双表达慢病毒载体的构建。从鸭子体内克隆免疫调控基因RIG-I的cDNA,构建了该基因的真核表达载体CS-RfA-EG-RIG:同时,根据禽流感病毒基因的保守序列设计构建了pENTR4-H1-DP1-DP5等6种shRNA表达载体,并利用模拟禽流感病毒复制的荧光素酶报告基因系统,通过培养细胞上的干扰试验,筛选出了效果最好的shRNA表达载体pENTR4-H1-DP1;在此基础上,凭借Gateway LR反应将shRNA表达序列HI-DPI转移至CS-RfA-EG-RIG载体,从而构建成功了表达RIG-I基因和抗禽流感病毒shRNA的双表达载体CS-RfA-EG-DP1-RIG。将该载体导入293T细胞,利用荧光定量PCR检测到了RIG-I mRNA的超表达；与模拟禽流感病毒复制的报告基因系统5种质粒共转染293T细胞,荧光素酶检测结果表明CS-RfA-EG-DP1-RIG载体同时具有抑制禽流感病毒复制的功能。这一研究为抗禽流感转基因鸡的制备提供了重要的材料基础。第二方面,提高鸡转基因效率方法研究。胚盘下腔慢病毒注射法虽然是目前最为有效的鸡转基因方法,但存在着基因导入效率低、难以获得转基因后代的技术瓶颈。为此,本研究设计了旨在提高胚盘细胞慢病毒感染效率的两条技术路线。首先,利用胰酶将胚盘细胞消化分散,同时注射病毒,使大量胚盘细胞能够接触到病毒。实验结果表明：0.25%胰酶注射至鸡胚盘,可使胚盘细胞呈分散状态,且在开始孵化后能够重新聚集,不影响鸡胚正常发育；胰酶处理鸡胚后再注射表达荧光蛋白的重组慢病毒,孵化4天后,胚胎细胞中呈荧光阳性的细胞比率为0.22%,而直接注射慢病毒的鸡胚中荧光阳性细胞占0.29%,表明胰酶处理对提高鸡胚的病毒转染率作用不显着,其原因在于慢病毒接触胰酶后其生物学滴度受到影响,因此,采取保护措施使病毒免受胰酶处理影响将是今后研究的课题。其次,将已注射慢病毒的种蛋在16℃、22℃和28℃条件下放置24小时,再转移到38.5℃温度下进行孵化,孵化到第4天将鸡胚用0.25%胰酶消化成单个细胞,观测了鸡胚中荧光阳性细胞的比率。注射慢病毒后直接放入孵化箱的对照组平均每1000个细胞中仅有1个细胞观察到荧光（0.09%）,而16℃、22℃和28℃实验组分别达到2.30%、0.86%和0.55%。结果表明：鸡胚注射慢病毒后16℃下放置24小时使基因转染效率较直接孵化的常规方法提高了20倍,利用这一改进措施可望获得高度嵌合的转基因鸡。本研究制备了能够同时表达RIG-I基因和抗禽流感病毒shRNA的慢病毒载体,并探索了提高鸡胚转基因效率的可行办法,为下一步成功制备抗禽流感转基因鸡奠定坚实的基础。
石铭,于福先,朱志伟,陈晓宇,黄菁,潘建治[4]（2013）在《家禽的转基因技术研究》文中进行了进一步梳理转基因技术的研究虽然备受争议,但是由于具有广阔的应用前景,近年来发展十分迅速。与哺乳动物相比,禽类具有特殊的生殖系统,因此家禽的转基因研究相对较为滞后。影响转基因家禽研制的关键因素在于表达载体的选择和外源基因的导入方式,这决定了如何获得较高的孵化率和转染率。笔者对目前用于转基因家禽制备的常用载体、转基因家禽制备的方法以及转基因鸡的后续孵化技术进行了综述。
王鹤,王彦彬,康相涛[5]（2012）在《转基因鸡生产技术研究进展》文中研究指明对转基因鸡的生产方法,如病毒载体法、生殖器官注射法、显微注射法、胚胎干细胞法等进行综述,探索转基因鸡各生产方法的可行性,并对各方法的应用特点以及转基因鸡应用方面的最新研究成果进行了剖析。
于敏莉[6]（2012）在《维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究》文中研究说明家禽的胚胎发育有独特的规律,通过对家禽原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）的体外研究,可以更深入地了解其胚胎发育过程及影响因素,并可对其基因进行遗传操作,制作各种研究模型,从而为生殖生物学和发育生物学等研究提供了一个优良的动物模型。为了更深层次揭示禽类生殖细胞增殖和分化的细胞内部和外源性调控机理、性腺发育和配子形成的分子机理,本实验以海兰鸡鸡胚为材料,分离了不同时期的PGC,进行体外培养并优化培养模型,研究了维甲酸（RA）对PGC粘附和增殖的作用及其胞内信号传导机制,同时还研究了RA对胚胎期卵巢生殖细胞减数分裂启动过程中的调控作用,探索基于LV-siRNA的慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立Raldh2基因敲除的转基因鸡模型,为进一步研究胚胎早期发育的机理、转基因家禽的制备奠定了基础。1.鸡胚PGC的分离、培养及鉴定在体视显微镜下用玻璃针分离19期3.5d鸡胚生殖嵴部位或28期5.5d鸡胚性腺,胰蛋白酶+EDTA消化分散组织,用KO-DMEM添加7.5%胎牛血清和10ng/ml白血病抑制因子（LIF）、10ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）、10ng/ml干细胞生长因子（SCF）、0.1mMMEM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺（Glu）、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养液,通过PGC和体细胞体外共培养的方式建立原代培养模型。然后传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上进行继代培养。同时我们从13-15期鸡胚血液中分离提取PGC,在饲养层上进行原代和传代培养。传至3-5代后,用碱性磷酸酶（AKP）、过碘酸雪夫氏（PAS）化学反应及c-kit、SSEA-1,3,4、EMA-1等免疫细胞化学鉴定PGC,用PCNA和BrdU掺入法检测细胞的增殖活性。并收集PGC集落,采用RT-PCR方法检测干细胞多能性相关基因（Pou5fl,Sox2和Nanog）的表达。上述结果表明我们建立的PGC-体细胞共培养模型较好的维持了PGC的生物特性及未分化状态,且具有较强的增殖活性。因此,该模型是可用于PGC体外增殖和分化调控的研究。2.RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其机理的研究本实验研究了RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其相关的信号传导途径。结果表明：经过RA（0.1-10μM）处理后,PGC的集落数目和面积呈时间和剂量依赖性增加。同时RA能够促进细胞间的粘附,提高粘附蛋白E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白和β-连锁蛋白的mRNA水平,增强PGC的粘附性,并存在一定的剂量效应关系。流式分析结果显示,PGC经过RA处理4天后,S/G2期（4N）的PGC数量显着增加,说明此部分细胞已经进入有丝分裂期。此外,RA能激活PGC中PKC和Akt活性,促进NF-κB的核转移,提高钙粘蛋白和β-catenin的磷酸化水平,然而这些刺激作用分别被LY294002（P13K抑制剂）,KP372-1（Akt抑制剂）,SN50（NF-κB抑制剂）和H7（PKC抑制剂）所阻断。RA显着上调PGC中细胞周期蛋白cyclin D1/E, CDK2/6和原癌基因c-fos, c-myc（?）勺表达,但是这种上调作用被H7、LY294002、KP372-1和SN50所抑制：综上所述,在体外培养条件下,RA通过PI3K/Akt/NF-κB信号级联反应及与PKC/β-catenin之间的交联反应促进鸡胚PGC的增殖,揭示RA在调控鸡胚胎生殖细胞发育中起着重要的作用。3.RA对鸡胚生殖细胞减数分裂的调控机理的研究在本实验中,我们结合胚胎期卵巢的体外培养和RNA干扰等手段,探索RA对鸡胚胎期生殖细胞减数分裂的调控及作用机制。SCP3和γH2AX免疫荧光染色结果表明,鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂,比例逐渐增加,到18.5天,进入减数分裂的细胞几乎遍布整个卵巢。减数分裂早期标志基因Strs8mRNA的表达在12.5天开始显着上调,早于减数分裂启动的时间：而减数分裂标志基因Scp3和Dmcl mRNA（?）内表达则在15.5天显着上调,再次验证鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂；RA合成酶基因Raldh2在15.5天显着上调而降解酶Cyp26bl却逐渐下降,表明Raldh2在RA聚集并维持减数分裂中的重要作用；RA受体RARβ则略微升高,表明其在RA启动减数分裂中的介导作用。而在雄性睾丸中,这些基因的表达变化很小,一直保持较低水平。10.5天和12.5天鸡胚卵巢在无血清的体外培养体系中分别培养5天和3天,生殖细胞能白发启动减数分裂：在培养体系中添加RA能明显增加进入减数分裂的细胞比例,显着上调了减数分裂相关基因Stra8,Scp3和Dmcl（?）的mRNA表达水平。Raldh2shRNA干扰后显着抑制了RA诱导减数分裂启动的作用。综上所述,我们的研究表明,RA及其信号通路对减数分裂启动中的重要调控作用,并首次报道了Raldh2基因敲减能够显着抑制生殖细胞进入减数分裂。4.利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型研究生殖细胞的发育本实验采用RNA干涉（RNAi）的方法,成功设计了三对针对Raldh2基因序列的保守区域的shRNA （short hairpin）分子,并构建质粒干涉载体。转染鸡胚15.5天卵巢生殖细胞后,转染效率达到80%-90%。通过qRT-PCR及SCP3免疫荧光染色检测,结果表明Raldh2-gallus-1224很好的抑制了Raldh2的表达,成功筛选出能高效抑制Raldh2复制的靶位点。针对有效位点构建了携带有能高效抑制Raldh2的shRNA慢病毒载体,将包装后的病毒注射到X期鸡胚胚盘内进行转基因操作,建立Raldh2基因敲减的转基因鸡模型。结果发现Raldh2基因敲减的转基因鸡胚外观与对照组的鸡胚相比无明显差异,卵巢形态大致正常,应用PCR检测GFP在胚体内的表达,进一步证实我们成功制备了转基因鸡模型,且qRT-PCR检测到Raldh2的表达显着下降。本实验为探索基于LV-siRNA慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立基因敲减的转基因鸡模型,为研究卵泡发育的分子机制奠定基础。以上实验结果表明：鸡胚PGC的体外共培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究,经AKP、PAS及c-kit、SSEA-1、3、4和EMA-1免疫细胞化学染色和干细胞多能性相关基因（Pou5fl,Sox2和Nanog）表达的RT-PCR检测等多种方法证实了PGC的原始性。利用此模型我们研究了维甲酸在PGC体外培养中的促增殖和粘附作用及其分子机理：我们还描述了鸡胚卵巢生殖细胞体内减数分裂启动中的形态学和分子变化,通过组织培养和RNA干扰等手段研究了RA对减数分裂启动的调控作用。这些发现将为禽类干细胞系的建立和转基因模型的制备奠定基础,同时也为进一步研究生殖细胞的发育提供理论指导和实验平台。
李永双,石放雄,于福先,朱志伟,陈晓宇,潘建治[7]（2011）在《家禽输卵管生物反应器的研究进展》文中研究表明转基因生物反应器主要有血液生物反应器、乳腺生物反应器和家禽输卵管生物反应器三类,由于家禽具有生长周期短、生产性能高、研究成本低,而且表达产物更接近天然状态和易于纯化等优点;因此,已成为转基因动物研究的热点之一。文章仅就家禽输卵管生物反应器的研究现状、卵清蛋白基因的结构、调控机理及输卵管特异性表达载体构建的研究作一综述。
李永双[8]（2011）在《鸡输卵管特异性启动子的优化研究》文中研究说明转基因动物技术研究从上世纪70年代开始,到目前已经取得了巨大成就,其中生物反应器是转基因动物技术应用研究的热点之一。利用哺乳动物乳腺生物反应器来生产蛋白类药物取得了许多进展,家禽输卵管生物反应器由于禽类突出的产蛋能力等优势也成为各国研究和投资的重点,而如何实现外源蛋白基因在家禽输卵管中高效、特异表达是该研究领域的主要技术瓶颈之一。本试验选取鸡卵清蛋白启动子作为研究对象,从以下几个方面进行了研究：1、白来航鸡卵清蛋白启动子5’端调控序列OVs的克隆采用PCR技术成功克隆了含白来航鸡卵清蛋白启动子5’端调控区的六个不同长度的序列（OV1-OV6）,大小分别为959bp,1381bp,2081bp,3140bp,5474bp和6293bp。序列分析结果显示所扩增的片段包含了目前已知鸡卵清蛋白5’端调控序列中的核心启动子区域。2、卵清蛋白启动子-荧光素酶报告基因重组载体系列的构建将以上六种序列分别构建入真核表达载体pGL4质粒中,构建了六个重组表达载体pGL4-OVs,酶切鉴定及测序结果都表明本试验已成功构建了以上六种重组载体。3、鸡原代输卵管上皮细胞培养体系的建立通过培养条件优化,成功获得原代鸡输卵管上皮细胞,为检测卵清蛋白基因启动子的组织特异性表达提供了试验平台。4、卵清蛋白启动子片段的表达活性及特异性检测将六种启动子-报告基因重组载体转染至鸡输卵管上皮细胞、DF-1和鸡胚成纤维细胞,进行了萤光素酶活性的检测比较,找出具有最强活性、保存较好输卵管定位表达特异性的重组质粒pGL4-OV3;同时推断出若干包含增强子、抑制子、特异性调控元件的序列区域。推测-3102～-2042区中存在与组织特异性调控有关的抑制性调控元件,-1342～-921之间存在抑制性调控元件,-5436～-3102之间可能有抑制性区域；而在-2042～-1342区域中含有增强子元件,-6233-5436之间存在潜在的增强子序列。试验结果表明-921～+38区域不含有组织特异性元件。本研究为生物反应器转基因鸡的制备提供了优选启动子材料,也为家禽输卵管特异启动子的进一步优化提供了基础。
任丽伟,陈强,徐贵江,李碧春[9]（2009）在《禽流感病毒神经氨酸酶的研究进展》文中研究说明神经氨酸酶是禽流感病毒的两种表面糖蛋白之一,是一种由AIV基因组第6节段编码的Ⅱ型糖蛋白。宿主细胞膜上的唾液酸（SA.又名神经氨酸）是流感病毒的主要受体。流感病毒与宿主细胞膜上SA受体结合后,才能进入细胞。而神经氨酸酶可以降解AIV识别的宿主细胞膜上的受体,抑制病毒进入细胞。神经氨酸酶的这一独特功能特点使其成为国内外抗禽流感病毒研究的热点之一,同时也为制备抗禽流感转基因家禽提供了理论依据。本文简要综述了禽流感病毒的背景知识,着重介绍了神经氨酸酶的结构与功能以及目前国内外神经氨酸酶的研究状况,并对其今后的研究和应用进行展望。
张秋婷[10]（2009）在《逆转录病毒为载体制备转基因鸡的初步研究》文中提出为了建立更加完善的逆转录病毒法生产转基因鸡的技术体系。本研究选用增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）为外源基因（亦为报告基因）、pEASY-T3为克隆载体、莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV）为骨架的puro-pBabe质粒为表达载体、含有疱疹性口腔炎病毒G蛋白基因的pVSV-G质粒为包装载体、239 10A1细胞为包装细胞。在PCR扩增出EGFP基因序列的基础上,分别构建克隆载体pEASY-T3-EGFP和重组表达载体puro-pBabe-EGFP。采用磷酸钙转染法与竞争包装法相结合的方法将puro-pBabe-EGFP与包装载体pVSV-G共同转入239 10A1细胞中以产生逆转录病毒。病毒原液经滴度检测后,采用低温超速离心的方法浓缩200倍。浓缩病毒液以注射的方式导入鸡胚的囊胚下腔进行原始生殖细胞（PGCs）的鸡胚内转染,然后将鸡胚置于孵化箱中进行孵化。待孵化5.5d时,随机选取试验鸡胚,提取其全胚基因组DNA进行检测。其结果为:1)克隆载体的PCR鉴定结果以及测序结果与理论序列的比对结果表明,已成功构建出与预期设计完全一致的克隆载体pEASY-T3-EGFP;2)表达载体的PCR鉴定结果、测序结果与理论序列的比对结果以及表达载体瞬转入胎牛中肾成纤维细胞中的表达结果表明,已成功构建出与预期设计完全一致并且具有体外表达EGFP活性的重组表达载体puro-pBabe-EGFP;3)由病毒原液的滴度测定数据计算出试验得到的逆转录病毒滴度为2.3×105/ml,结果表明采用磷酸钙转染法与竞争包装法相结合的方法包装出高滴度的逆转录病毒;4)PCR检测鸡胚基因组DNA整合EGFP基因的结果为,有75%的鸡胚呈阳性;在PCR检测基础上进行Southern杂交检测,结果有66.7%的鸡胚呈阳性。表明包装逆转录病毒已经将EGFP基因整合到基因组中,同时也证明了以MoMLV为骨架的转录病毒载体可感染不同物种来源的细胞。综上所述,本研究结果不仅为采用逆转录病毒感染法制备转基因鸡提供了可行性依据,同时也为进一步证明逆转录病毒感染法是一种可应用于多种动物的高效转基因工具提供了依据。此外,本研究结果为深入开展转基因鸡与以鸡蛋为生物反应器相关的转基因家禽的研究奠定了基础。
二、转基因家禽的生产应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因家禽的生产应用（论文提纲范文）
（1）转基因嵌合鸡模型的建立及抗新城疫病毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 转基因家禽与RCAS系统 |
| 1.1 转基因家禽 |
| 1.1.1 家禽转基因的方法 |
| 1.1.2 转基因禽类的应用 |
| 1.2 RCAS系统研究进展 |
| 1.2.1 RCAS系统的起源 |
| 1.2.2 RCAS载体及其衍生家族 |
| 1.2.3 病毒包装与宿主选择 |
| 1.2.4 RCAS载体设计中的注意事项 |
| 1.2.5 RCAS系统的应用 |
| 1.3 AAV系统简介 |
| 1.4 新城疫病毒概述 |
| 试验研究 |
| 第二章 EGFP转基因嵌合鸡模型的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、细胞与鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂、仪器及常用试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计及序列 |
| 2.2.2 RCASBP(A)-EGFP质粒构建 |
| 2.2.3 细胞转染与Western blot |
| 2.2.4 病毒包装及滴度测定方法 |
| 2.2.5 病毒注射方法 |
| 2.2.6 雏鸡EGFP表达检测方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 RCASBP(A)-EGFP载体构建结果 |
| 2.3.2 载体表达结果 |
| 2.3.3 病毒包装与滴度测定结果 |
| 2.3.4 转基因嵌合鸡模型的建立 |
| 2.3.5 雏鸡 EGFP 表达结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转基因嵌合鸡抗新城疫病毒的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、细胞与鸡胚 |
| 3.1.2 主要试剂、仪器及常用试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计及序列 |
| 3.2.2 载体构建方法 |
| 3.2.3 载体表达验证与滴度测定方法 |
| 3.2.4 稳定表达HN和 FAM的 DF-1 细胞抗NDV检测方法 |
| 3.2.5 雏鸡外源基因表达检测方法 |
| 3.2.6 雏鸡攻毒方法 |
| 3.2.7 NDV滴度测定方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RCASBP(A)-HN、RCASBP(A)-FAM载体的构建结果 |
| 3.3.2 载体表达及病毒滴度测定结果 |
| 3.3.3 DF-1 细胞稳定表达HN和 FAM的抗NDV效果 |
| 3.3.4 转基因 HN 和 FAM 嵌合鸡的制备结果 |
| 3.3.5 HN 和 FAM 转基因嵌合鸡抗 NDV 效果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）CRISPR/Cas9系统在家禽中应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 CRISPR/Cas9在家禽细胞模型构建中的应用 |
| 2 CRISPR/Cas9在家禽生长发育和性腺分化研究中的应用 |
| 3 CRISPR/Cas9在家禽疾病研究中的应用 |
| 4 CRISPR/Cas9在家禽胚胎编辑中的应用 |
| 5 CRISPR/Cas9在转基因家禽制备中的应用 |
| 6 CRISPR/Cas9的脱靶效应及其在家禽上的改良应用 |
| 6.1 CRISPR/Cas9的脱靶效应 |
| 6.2 CRISPR/Cas9在家禽上的改良应用 |
| 7 小 结 |
（3）抗禽流感双表达慢病毒载体的构建及转基因鸡制备方法的优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 制备转基因家禽的常用载体 |
| 1.1 质粒载体 |
| 1.2 病毒载体 |
| 2 转基因家禽制备方法 |
| 2.1 精子载体法 |
| 2.2 胚盘下腔注射法 |
| 2.3 原始生殖细胞(PGCs)介导法 |
| 2.4 胚胎干细胞法 |
| 2.5 血液注射法 |
| 3 转基因鸡的后续孵化技术 |
| 3.1 赤道开窗法 |
| 3.2 换壳孵化法 |
| 4 抗禽流感研究现状 |
| 4.1 抗禽流感疫苗 |
| 4.2 转基因技术的应用 |
| 5 本课题研究的目的和意义 |
| 第二章 抗禽流感双表达载体的构建和检测 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 质粒和细胞 |
| 1.3 试验试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 构建pEASY-T1-RIG-I载体 |
| 2.2 构建载体CS-RfA-EG-RIG |
| 2.3 DP表达载体的构建及检测 |
| 2.4 DP与RIG-I双表达载体的构建及检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PCR结果分析 |
| 3.2 酶切鉴定结果分析 |
| 3.3 测序结果分析 |
| 3.4 shRNA表达载体的功能检测 |
| 3.5 RIG-I表达检测 |
| 4 讨论 |
| 第三章 对鸡高效转基因方法的研究 |
| 1 试剂和材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 试验试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 胰酶对病毒感染鸡胚细胞效率的影响 |
| 2.2 孵化前温度处理对转基因效率的影响 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 胰酶处理后的病毒感染能力 |
| 3.2 胰酶对鸡胚发育的影响 |
| 3.3 胰酶处理后慢病毒对鸡胚细胞转染效率的影响 |
| 3.4 孵化前温度处理对病毒转染鸡胚细胞效率的影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 结论、创新点及后续研究展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）家禽的转基因技术研究（论文提纲范文）
| 1 制备转基因家禽的常用载体 |
| 1.1 质粒载体 |
| 1.2 病毒载体 |
| 1.2.1 逆转录病毒载体。 |
| 1.2.2 慢病毒载体。 |
| 2 转基因家禽的制备方法 |
| 2.1 精子载体法 |
| 2.2 胚盘下腔注射法 |
| 2.3 原始生殖细胞 (PGCs) 介导法 |
| 2.4 胚胎干细胞法 |
| 2.5 血液注射法 |
| 3 转基因鸡的后续孵化技术 |
| 3.1 赤道开窗法 |
| 3.2 换壳孵化法 |
| 4 小结 |
（5）转基因鸡生产技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 转基因鸡生产方法 |
| 1.1 显微注射法 |
| 1.2 逆转录病毒载体法 |
| 1.3 胚胎干细胞法 |
| 1.4 原生殖细胞 (PGCs) 转染法 |
| 1.5 雄性生殖细胞载体法 |
| 2 转基因鸡应用前景 |
| 2.1 生产药用或保健蛋白 |
| 2.2 提高禽类的生产性能及抗病育种 |
| 2.3 应用于医学领域 |
| 2.4 应用于基础研究 |
| 3 小结 |
（6）维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 禽类原始生殖细胞的研究进展 |
| 1.1 干细胞的起源 |
| 1.2 干细胞的生物学特性 |
| 1.3 禽类PGC的特性 |
| 1.4 PGC的起源 |
| 1.5 禽类PGC的迁移 |
| 1.6 原始生殖细胞的应用 |
| 1.6.1 PGC作为研究胚胎发育的体外模型 |
| 1.6.2 PGC在种质资源保护中的应用 |
| 1.6.3 转基因家禽的制备 |
| 1.6.4 药物生产 |
| 1.7 小结 |
| 第二节 细胞外基质对PGC迁移的影响及调控 |
| 2.1 粘附蛋白的结构和影响因素 |
| 2.2 E-钙粘蛋白的结构和功能调节 |
| 2.2.1 E-钙粘蛋白生物学特性 |
| 2.2.2 E-钙粘蛋白/连锁蛋白复合体的生物学特性 |
| 2.2.3 E-钙粘蛋白的调控 |
| 2.3 粘附分子在细胞信号传导中的作用 |
| 2.4 粘附分子在生殖细胞发育中的作用 |
| 2.5 ECM在PGC迁移中的作用 |
| 第三节 禽类原始生殖细胞增殖的调控 |
| 3.1 PGC的增殖 |
| 3.2 生长因子对PGC增殖的调控 |
| 3.2.1 白血病抑制因子 |
| 3.2.2 干细胞生长因子 |
| 3.2.3 碱性成纤维生长因子 |
| 3.2.4 肿瘤坏死因子TNF-α和cAMP |
| 3.2.5 维甲酸(RA) |
| 3.2.6 其它细胞因子 |
| 3.2.7 负调控因子 |
| 3.3 细胞信号通路对PGC增殖的调控 |
| 3.3.1 LIF信号通路 |
| 3.3.2 BMP信号通路 |
| 3.3.3 Wnt途径 |
| 3.3.4 Oct4 |
| 3.3.5 Nanog |
| 3.3.6 Sox2 |
| 3.3.7 NF-κB信号 |
| 3.4 细胞周期相关基因控制PGC的增殖 |
| 第四节 禽类原始生殖细胞分化的调控 |
| 4.1 禽类性腺发育 |
| 4.1.1 胚胎性腺的基本过程 |
| 4.1.2 PGC与性腺发生和发育的关系 |
| 4.2 禽类性腺发育的调控及其机理 |
| 4.2.1 减数分裂 |
| 4.2.2 维甲酸在PGC分化中的调控 |
| 4.2.3 Nanos2和PGC分化 |
| 4.2.4 FGF9在PGC分化中的调控 |
| 4.3 卵母细胞发生的分子调控 |
| 4.3.1 卵母细胞的发生 |
| 4.3.2 禽类卵巢的发育 |
| 第五节 利用转基因技术研究生殖细胞发育的调控机理 |
| 5.1 转基因鸡的研究现状 |
| 5.2 RNA干扰的研究进展 |
| 5.2.1 小RNAs的分类 |
| 5.2.2 RNAi作用机制 |
| 5.2.3 RNAi作用的特点 |
| 5.2.4 siRNA与shRNA的比较 |
| 5.2.5 RNA干扰的应用 |
| 5.3 转基因鸡的制备方法 |
| 5.3.1 慢病毒感染法 |
| 5.3.2 原始生殖细胞介导法 |
| 5.3.3 精子载体法 |
| 5.3.4 显微注射法 |
| 5.4 RNAi转基因动物的研究 |
| 5.4.1 RNAi转基因动物的研究现状 |
| 5.4.2 RNAi制备转基因动物的优势 |
| 5.4.3 RNAi转基因动物存在的问题与应用前景 |
| 第六节 本研究的目的和内容 |
| 6.1 本研究的目的和意义 |
| 6.2 研究目标及内容 |
| 第二章 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞粘附调控机理的研究 |
| 第一节 鸡胚原始生殖细胞体外培养模型的建立及优化 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 饲养层的制备 |
| 1.2.5 生殖嵴和性腺PGC的分离、纯化和培养 |
| 1.2.6 血液中PGC的分离、纯化和培养 |
| 1.2.7 鸡胚PGC的染色鉴定 |
| 1.2.8 RT-PCR检测PGC特异基因的表达 |
| 1.2.9 性腺切片免疫组织化学染色 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 生殖嵴、性腺PGC体外分离培养及鉴定 |
| 1.3.2 血液PGC体外分离培养及鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 PGC的分离及培养 |
| 1.4.2 鸡胚PGC的培养条件 |
| 1.4.3 鸡胚PGC的鉴定 |
| 1.5 小结 |
| 第二节 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞粘附的影响及其机理的研究 |
| 摘要 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 主要试剂及配制 |
| 2.2.4 PGC培养及药物处理 |
| 2.2.5 PGC集落粘附性的检测 |
| 2.2.6 SSEA-1和β-catenin双标免疫荧光染色 |
| 2.2.7 细胞周期流式分析 |
| 2.2.8 RNA提取和常规RT-PCR |
| 2.2.9 Real-Time RT-PCR |
| 2.2.10 蛋白质的提取和Western Blot分析 |
| 2.2.11 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 RARs和RA合成酶在PGC及性腺中的表达情况 |
| 2.3.2 RA对PGC粘附性的作用 |
| 2.3.3 PKC在RA对增强PGC问粘附性中的介导作用 |
| 2.3.4 β-catenin在RA增强PGC粘附性中的介导作用 |
| 2.3.5 RA在体外对PGC增殖的影响 |
| 2.3.6 PKC在RA对PGC促增殖中的作用 |
| 2.3.7 RA对细胞周期蛋白mRNA表达水平的影响 |
| 2.3.8 RA在体外对PGC细胞周期的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞增殖调控的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 PGC培养及药物处理 |
| 1.2.5 BrdU掺入鉴定PGC的增殖 |
| 1.2.6 细胞周期流式分析 |
| 1.2.7 RNA提取和常规RT-PCR |
| 1.2.8 Real-Time RT-PCR |
| 1.2.9 蛋白质的提取和Western Blot分析 |
| 1.2.10 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 RA在体外对PGC增殖的影响 |
| 1.3.2 PI3K/Akt在RA对PGC促增殖中的介导作用 |
| 1.3.3 NF-κB在RA对PGC促增殖中的介导作用 |
| 1.3.4 RA及抑制剂对细胞周期蛋白mRNA表达水平的影响 |
| 1.3.5 RA及抑制剂对PGC细胞周期的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第四章 维甲酸对鸡胚生殖细胞减数分裂调控机理的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 样品采集 |
| 1.2.5 鸡胚性腺组织培养和处理 |
| 1.2.6 鸡胚卵巢生殖细胞的分离培养和处理 |
| 1.2.7 Raldh2 siRNA转染 |
| 1.2.8 鸡胚性腺组织的冰冻切片 |
| 1.2.9 鸡胚性腺组织石蜡切片制作 |
| 1.2.10 胚胎期卵巢形态学观察 |
| 1.2.11 性腺冰冻切片免疫荧光染色 |
| 1.2.12 RNA提取和Real-Time RT-PCR |
| 1.2.13 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 胚胎期鸡胚卵巢发育的形态学特征 |
| 1.3.2 胚胎期鸡卵巢减数分裂阶段的变化 |
| 1.3.3 减数分裂相关基因表达的在不同时期鸡胚性腺中的表达情况 |
| 1.3.4 RA合成和降解酶在不同时期鸡胚性腺中的表达情况 |
| 1.3.5 AO染色观察体外培养卵巢的内部结构 |
| 1.3.6 RA在体外对减数分裂的影响 |
| 1.3.7 Raldh2 shRNA干扰 |
| 1.3.8 Raldh2基因敲减对减数分裂的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第五章 利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 玻璃针的制备 |
| 1.2.5 siRNA的设计 |
| 1.2.6 病毒滴度的复核(有限稀释法测定) |
| 1.2.7 靶细胞感染预实验 |
| 1.2.8 293FT细胞的培养 |
| 1.2.9 病毒的生产 |
| 1.2.10 病毒滴度分析 |
| 1.2.11 鸡胚病毒注射 |
| 1.2.12 PCR检测目的基因的表达 |
| 1.2.13 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 慢病毒滴度测定结果 |
| 1.3.2 不同转染时间绿色荧光蛋白的表达分析 |
| 1.3.3 shRNA高效抑制Raldh2复制靶位点的筛选 |
| 1.3.4 转基因个体的PCR分析 |
| 1.3.5 转基因鸡胚15.5天卵巢形态 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第六章 结论和创新点 |
| 1.1 结论 |
| 1.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
（7）家禽输卵管生物反应器的研究进展（论文提纲范文）
| 1 家禽输卵管生物反应器的研究现状 |
| 1.1 转基因家禽输卵管生物反应器的优势 |
| 1.2 国内外家禽输卵管生物反应器的研究进展 |
| 2 转基因家禽输卵管表达载体的构建 |
| 2.1 卵清蛋白及其基因结构 |
| 2.2 家禽卵清蛋白基因的表达调控 |
| 2.3 家禽输卵管特异性表达载体的构建 |
| 3 存在问题与展望 |
（8）鸡输卵管特异性启动子的优化研究（论文提纲范文）
| 资助项目 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 家禽输卵管生物反应器的研究进展 |
| 1 家禽输卵管生物反应器的概况及其优势 |
| 1.1 乳腺生物反应器 |
| 1.2 家禽输卵管生物反应器 |
| 2 家禽生理学特征 |
| 2.1 家禽的卵巢、输卵管和卵子形成 |
| 2.2 家禽卵白蛋白质的形成和组成 |
| 2.3 家禽的胚胎发育 |
| 2.4 家禽胚胎的体外培养 |
| 3 转基因家禽输卵管表达载体的构建 |
| 3.1 输卵管上皮细胞的培养及体外基因转导 |
| 3.2 卵清蛋白基因结构及表达调控 |
| 4 转基因家禽研究方法 |
| 4.1 显微注射法 |
| 4.2 精子载体法 |
| 4.3 反转录病毒法 |
| 4.4 原始生殖细胞法 |
| 5 转基因动物的检测 |
| 5.1 PCR法检测 |
| 5.2 Southern blot法检测 |
| 5.3 染色体原位杂交(Chromosome in situ hybridization)法检测 |
| 5.4 RNA水平检测 |
| 5.5 翻译水平检测 |
| 6 家禽输卵管生物反应器的存在问题及发展趋势 |
| 7 本课题研究的目的和意义 |
| 8 本试验的主要研究内容 |
| 第二章 鸡卵清蛋白5调控序列OVs的克隆 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 试验试剂和仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 PCR结果分析 |
| 2.2 pMD19-T simple-OVs酶切鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 OVs启动子-萤光素酶报告基因载体构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 pGL4-OV～OV4表达载体构建结果酶切鉴定 |
| 2.2 pGL4-OV5、pGL4-OV6表达载体的构建结果酶切鉴定 |
| 2.3 测序分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 鸡原代输卵管上皮细胞及对照细胞系的培养 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 鸡原代输卵管上皮细胞培养 |
| 2.2 鸡胚成纤维细胞培养 |
| 2.3 DF-1细胞培养 |
| 3 讨论 |
| 第五章 几种重组报告基因载体表达活性测定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 测定结果 |
| 2.1 六种重组报告基因质粒在鸡原代输卵管上皮细胞中的表达活性检测 |
| 2.2 六种重组报告基因质粒在DF-1细胞中的表达活性检测 |
| 2.3 六种重组报告基因质粒在鸡胚胎成纤维细胞中的表达活性检测 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 后续研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）禽流感病毒神经氨酸酶的研究进展（论文提纲范文）
| 1 禽流感病毒 |
| 2 神经氨酸酶 (NA) 的结构与功能 |
| 3 神经氨酸酶的研究现状 |
| 3.1 NA基因改造的研究 |
| 3.2 NA免疫学功能的研究 |
| 3.3 NA抑制剂的研究 |
| 4 问题与展望 |
（10）逆转录病毒为载体制备转基因鸡的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 转基因家禽的研究进展 |
| 1.1.1 转基因家禽生物反应器的优势 |
| 1.1.2 家禽转基因制作面临的困境及可能战略 |
| 1.1.3 家禽转基因的研究策略及发展趋势 |
| 1.2 逆转录病毒载体 |
| 1.2.1 逆转录病毒表达系统的构成 |
| 1.2.2 逆转录病毒表达系统应用的理论依据 |
| 1.2.3 逆转录表达系统的开发研究 |
| 2 逆转录病毒载体的构建及表达 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 试验主要试剂 |
| 2.1.3 试验主要药品的配制 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 主要试验器械的清洗与消毒 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 克隆载体的构建 |
| 2.2.2 表达载体的构建 |
| 2.2.3 表达载体及包装载体的大量提取 |
| 2.2.4 逆转录表达载体及包装载体的浓度测定 |
| 2.2.5 逆转录表达载体的表达 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 克隆载体的鉴定与测序 |
| 2.3.2 表达载体的鉴定与测序 |
| 2.3.3 逆转录病毒表达载体及包装载体的浓度测定 |
| 2.3.4 逆转录病毒表达载体的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 逆转录病毒载体体内转染鸡胚原始生殖细胞 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 试验主要试剂 |
| 3.1.3 试验主要药品的配制 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细胞的复苏、传代与冷冻保存 |
| 3.2.2 磷酸钙转染法制备逆转录病毒 |
| 3.2.3 病毒滴度的检测 |
| 3.2.4 逆转录病毒的浓缩 |
| 3.2.5 鸡胚中外源基因整合的PCR检测 |
| 3.2.6 鸡胚中外源基因整合的Southern杂交检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 逆转录病毒的包装与滴度测定结果 |
| 3.3.2 PCR检测外源基因在鸡胚中的整合 |
| 3.3.3 Southern杂交检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、转基因家禽的生产应用（论文参考文献）
- [1]转基因嵌合鸡模型的建立及抗新城疫病毒研究[D]. 李永山. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [2]CRISPR/Cas9系统在家禽中应用研究进展[J]. 张蕾,张海波,章敬旗,张扬,常国斌,陈国宏,王健. 中国畜牧兽医, 2020(01)
- [3]抗禽流感双表达慢病毒载体的构建及转基因鸡制备方法的优化研究[D]. 石铭. 浙江师范大学, 2013(03)
- [4]家禽的转基因技术研究[J]. 石铭,于福先,朱志伟,陈晓宇,黄菁,潘建治. 安徽农业科学, 2013(06)
- [5]转基因鸡生产技术研究进展[J]. 王鹤,王彦彬,康相涛. 河南农业科学, 2012(05)
- [6]维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究[D]. 于敏莉. 浙江大学, 2012(08)
- [7]家禽输卵管生物反应器的研究进展[J]. 李永双,石放雄,于福先,朱志伟,陈晓宇,潘建治. 黑龙江畜牧兽医, 2011(23)
- [8]鸡输卵管特异性启动子的优化研究[D]. 李永双. 南京农业大学, 2011(01)
- [9]禽流感病毒神经氨酸酶的研究进展[J]. 任丽伟,陈强,徐贵江,李碧春. 广东畜牧兽医科技, 2009(02)
- [10]逆转录病毒为载体制备转基因鸡的初步研究[D]. 张秋婷. 东北林业大学, 2009(10)